CC BY
32
УДК [618. 19 - 006. 55: 616. 832 - 002 - 022. 6: 615. 277. 3] - 092. 9 Е. А. Рогозин, Л. Н. Уразова, В. Ю. Серебров
ИЗМЕНЕНИЯ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ОПУХОЛИ ЭРЛИХА, ИНДУЦИРОВАННЫЕ КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИЕЙ ВИНКРИСТИНОМ И ВАКЦИННЫМ ШТАММОМ ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА
Сибирский государственный медицинский университет М3 РФ, Томск НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН
При экспериментальном изучении средств, обладающих противоопухолевой активностью, представляется целесообразным одновременно с оценкой воздействия на опухолевый процесс оценить и их влияние на эффективность цитостатической терапии. В представленной работе дана оценка цитологических показателей асцитного варианта опухоли Эрлиха при различных схемах терапии вакцинным штаммом вируса ВЭЛ и винкристином. Полученные данные являются одним из этапов изучения механизмов противоопухолевого действия модификаторов биологических реакций, в частности вирусов.
Ключевые слова: винкристин, вирус венесуэльского энцефаломиелита, аденокарцинома Эрлиха
В клинической и экспериментальной противоопухолевой терапии используется множество различных схем и сочетаний противоопухолевых агентов [6]. Среди них такие, как подавление кальциевым антагонистом верапамилом опухолевой резистентности к химиотерапии винкристином (ВК), применение живой туляремийной вакцины в сочетании с операционным вмешательством и лучевой терапией у больных раком тела матки, подавление опухолевого роста новым соединением из мутантного штамма гриба [5,12,16].
Ранее в литературе сообщалось об использовании вируса венесуэльского энцефаломиелита (ВЭЛ), обладающего выраженной тропностью к ряду перевиваемых опухолей (саркома 37, саркома 180, асцитная опухоль МК/Ьу), в различных схемах терапии неоплазий в эксперименте [8, 10, 16]. Так, при однократном введении вируса происходит 50-80% торможение роста опухоли Эрлиха [15].
В исследованиях предпринимались попытки выявить механизм цитотоксического действия винкристина и природу его тропности к тем или иным опухолевым клеткам в эксперименте [7, 9, 12]. Описано синергеческое действие этого препарата с РНК-азой бактериального происхождения в эксперименте с асцитным вариантом опухоли Эрлиха [3]. Винкристин путем торможения образования митотических веретен обратимо блокирует деление клеток в стадии метафазы. В опухолевых клетках он избирательно ингибирует механизм восстановления ДНК и посредством торможения РНК-полимеразного фермента, зависящего от ДНК, угнетает синтез РНК. Некоторые авторы считают, что препарат, связывая бе-
лок тубулин, останавливает образование веретена деления, тем самым вызывая гибель клеток в активно пролиферирующих тканях. Следует отметить, что речь идет о введении его в максимально допустимых в эксперименте дозах (суммарная доза 2,1 мг/кг в течение 3 недель) [2].
Ранее нами было проведено изучение комплексного противоопухолевого действия ВЭЛ и циклофосфана в эксперименте [13]. На наш взгляд, может представлять интерес и сочетанное применение вируса ВЭЛ и ВК в терапии экспериментальных опухолей. Вероятно, в этой комбинации будут реализованы два механизма воздействия: прямое цитодеструктивное и опосредованное, с привлечением иммунной и/или других систем организма. Мы полагаем, что оценка цитологических показателей опухоли при терапии по указанной схеме может быть полезной и информативной для более глубокого изучения данного биотерапевтического подхода.
Целью настоящего исследования явилась оценка в динамике митотической активности, степени вакуольной дистрофии, а также процентного содержания иммуноцитов в клеточной популяции асцитного варианта опухоли Эрлиха при различных схемах терапии вакцинным штаммом вируса ВЭЛ и ВК.
Методика. Эксперименты проводились на 2-месячных беспородных мышах весом 20-22 г разведения вивария Сибирского медицинского университета. Опыты осуществлялись в осенне-зимний период. До начала исследований животные в течение 10-14 суток выдерживались в стандартных условиях вивария. Пассирование опухоли проводилось с интервалом 6-7 сут в со-
ответствии с принятыми в экспериментальной онкологии методами [15]. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации шейных позвонков. В экспериментах использовали аттенуированный штамм вируса ВЭЛ, который был разработан в Томском НИИ вакцин и сывороток [4] и прошёл контроль как вакцинный препарат в ГИСК им. Тарасевича (Москва).
Все животные были разделены на три группы, которым были введены внутрибрюшинно опухолевые клетки в концентрации 1х 10 /мышь. На 3-и, 10 и 17-е сут эксперимента первой подопытной группе животных внутрибрюшинно был введен ВК в концентрации 0,4 мг/кг массы животного в 0,5 мл среды 199 [15]. Вторая группа получила то же количество ВК внутрибрюшинно и 104 вируса ВЭЛ подкожно. Третья группа животных-опухоленосителей использовалась в качестве контрольной.
Приготовление препаратов опухолевых клеток проводилось через 24 часа после каждого введения терапевтических агентов, то есть на 4, 11 и 18-е сут от начала эксперимента. Мазки готовились по стандартной методике, затем фиксировались 10 мин в 96 этиловом спирте и окрашивались по методу Нохта - Максимова. Изучались следующие цитологические показатели: митотическая активность - подсчет на 100 клеток количества делящихся; дистрофические изменения - подсчет на 100 клеток количества с ва-куолизированной цитоплазмой; процентное содержание иммунокомпетентных клеток - подсчет на 100 опухолевых клеток встречающихся среди них иммуноцитов (моноцитов, лимфоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов).
Для всех выборок полученных данных проверяли гипотезу нормальности распределения методом Колмогорова - Смирнова. Полученные результаты статистически обрабатывали с помощью критерия Манна - Уитни (иЧев^.
Результаты. Согласно полученным данным, процентное содержание делящихся опухолевых клеток асцитного рака Эрлиха (АРЭ) при монотерапии ВК достоверно снижалось на 4, 11 и 18-е сут опухолевого процесса (рис.1). При сочетанной терапии вирусом ВЭЛ и винкристином отмечено достоверное снижение исследуемого показателя на 4-е и 11-е сутки эксперимента. При этом в указанные сроки цитостатический эффект использованных схем терапии в подопытных группах практически не различался. Однако на 18-е сут онкогенеза наблюдалось статистически значимое различие между ними по данному показателю (р<0,05), причем в группе животных, получивших монотерапию ВК, по-прежнему отмечалось его цитостатическое действие в отношении клеток АРЭ, в то время как сочетанное применение ВК и вируса ВЭЛ не давало достоверного эффекта.
Таким образом, снижение митотической активности клеток на определенном этапе опухолевого процесса (4-е и 11-е сут) свидетельствует о положительном эффекте использованных схем терапии на ранних стадиях онкогенеза. Однако отсутствие этого феномена на 18-е сут эксперимента при сочетанной схеме лечения может объясняться несколькими причинами, в частности тем, что уже произошла селективная гибель клеток АРЭ, чувствительных к вирусу ВЭЛ, либо цитостатический эффект наступает в более поздние или ранние сроки от начала терапии.
Анализ процентного содержания клеток с ва-куолизированной цитоплазмой показал, что достоверное снижение количества этих клеток в асците при терапии ВЭЛ+ВК происходило на 4-е и 11-е сут опухолевого процесса, а при монотерапии ВК - на 11 и 18-е сут (рис. 2). Вакуольная дистрофия - процесс обратимый, однако длительное воздействие патогенного фактора может привести к гибели клетки [1]. Следовательно, од-
Рис. 1. Динамика процентного содержания делящихся клеток АРЭ при моно- и сочетанной с вирусом ВЭЛ терапией ВК; * - различие достоверно (р<0,05)
Рис. 2. Динамика содержания клеток АРЭ с вакуоли-зированной цитоплазмой при моно- и сочетанной с вирусом ВЭЛ терапией ВК; * - достоверно при (р<0,05)
ним из возможных объяснений полученных нами результатов может быть предположение, что высокая дистрофическая активность вируса ВЭЛ потенциируется ВК, что и приводит к интенсивной гибели вакуолизированных клеток на начальном этапе лечения. С другой стороны, монотерапия ВК, которая на 4-е сут не вызывала вакуольной дистрофии опухолевых клеток, достоверно снижала данный показатель на 11-е и 18-е сут, что может свидетельствовать либо о гибели этих клеток на ранних стадиях опухолевого процесса, либо об отсутствии в них дистрофических изменений.
При комплексной терапии опухоли ВК+ВЭЛ процентное содержание иммуноцитов достоверно коррелировало с аналогичным показателем для клеток с вакуолизированной цитоплазмой (К=0,60; р<0,05), что может быть объяснено повышенной дистрофической активностью вируса ВЭЛ (рис. 3). При исследовании под световым микроскопом вакуольная дистрофия характери-
■п
—I сутки 18
Рис. 3. Динамика процентного содержания иммуноцитов в АРЭ при моно- и сочетанной с вирусом ВЭЛ терапией ВК; * - достоверно при (р<0,05)
зуется наличием большого числа цитоплазматических вакуолей, наполненных прозрачной жидкостью. Эта картина при электронно-микроскопическом исследовании дополняется набуханием митохондрий, лизосом и агранулярной цитоплазматической сети [1]. Вирус ВЭЛ, по-видимому, разрушает цитоплазматические мембраны опухолевых клеток и стимулирует миграцию иммуноцитов в асцит.
Проведенные исследования показали достоверное увеличение процентного содержания перитонеальных иммуноцитов при комплексной терапии опухоли ВЭЛ+ВК на всех этапах опухолевого процесса. При этом монотерапия ВК достоверно изменяла изученный показатель только на 4-е сут эксперимента. Кроме того, подо-
пытные группы достоверно (р<0,05) различались между собой по этому показателю. Полученные данные могут трактоваться в соответствии со сведениями из литературных источников о свойствах использованных при проведении экспериментов терапевтических агентов.
Известно, что цитостатики, обладая иммуно-депрессивной активностью, способны активировать инаппарентно протекающую инфекцию при одновременном введении вируса или вскоре после его инокуляции [14]. В условиях подавления цитостатиками как гуморальных, так и клеточных факторов иммунитета, вакцинальный процесс, вызванный вирусами, протекает значительно тяжелее [13]. В то же время вирусы по своей природе являются антигенными, высокомолекулярными иммуномодуляторами, способными взаимодействовать с чувствительными клетками, в том числе и с опухолевыми, индуцируя специфический иммуногенез и распространяясь на феномен неспецифической иммуномодуляции [14].
Заключение. Таким образом, показано, что комплексное применение вакцинного штамма вируса ВЭЛ и ВК в терапии асцитного рака Эрлиха вызывает достоверное снижение митотической активности клеток АРЭ на ранних стадиях опухолевого процесса, достоверное увеличение перитонеальных иммуноцитов на всех этапах экспериментального онкогенеза. Полученные данные свидетельствуют о перспективности применения изученных агентов в терапии экспериментальных опухолей.
CHANGES OF CYTOLOGICAL INDEXIES OF EHRLICH’S CANCEROUS GROWTH INDUCED BY COMPLEX THERAPY WITH USE OF VINCRISTINE AND WITH VENEZUELAN ENCEPHALOMYELITIS VIRUS VACCINE STRAIN
E.A. Rogozin, L.N. Urazova, V.Yu. Serebrov
The treatment by the virus VEE has an antotumor activity. We investigated the influence of vincristine and virus VEE in common and separately action on Ehrlich’s carcinoma. We estimated the mitotic index, level of quantity va-cuolizated cells and contents of immunocites in ascitic Erlich carcinoma. The research has demonstrated that the complex application of virus VEE and vincristine in therapy of Ehrlich’s carcinoma causes authentic reduction in mitotic activity of cells at the early stages of tumor process and authentic increase in mmunocites at all stages of experimental tumor process.
ЛИТЕРАТУРА
1. Авцын А.П., Шахламов В.А. Ультраструктурные основы патологии клетки. М., 1979.
2. Бродский Р.А., Явор Т., Бондурко Л.Н. и др. Влияние винкристина на морфофункциональное состояние тонкой кишки крыс // Вопр. онкол. 1984. Т. 30. №
8. С. 95-101.
3. КуриненкоБ.М., СобчукЛ.И., Хайбуллина С.А., Булгакова Р.Ш. Экспериментальное исследование противоопухолевой эффективности РНКазы Bac. Inter-medius // Экспер. онкол. 1988. Т. 10. № 6. С. 54-57.
4. Марченко И.М., Подоплёкин Б.Д., Соляник Р.Г., Фёдоров Ю.В. Некоторые свойства аттенуированных вариантов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей // Арбовирусы: Материалы XVI научной сессии института полимиелита и вирусных энцефалитов. М., 1969. Т. 2. С. 235-237.
5. Мовсесян М.А., Адамян Р.Т., Маркосян К.М. Влияние туляремийной живой вакцины на эффект кон-расупрессии лимфоцитов крови у больных раком тела матки в процессе комбинированного лечения и в отдаленные сроки//Вопр. онкол. 1999. Т. 45. № 5. С. 528-532.
6. Моисеенко В.М. Биотерапия солидных опухолей // Там же. 1998. Т. 44. № 1. С. 120-126.
7. Нейфах А.А., Серпинская А.С. Выявление клеток с пониженной чувствительностью к цитостатикам с помощью флюоресцентных красителей // БЭБиМ. 1988. № 6. С. 684-686.
8. Рогозин Е.А., Уразова Л.Н., Ильинских Н.Н. Влияние вируса венесуэльского энцефаломиелита на жизнеспособность и уровень цитогенетических нарушений в клетках карциномы Эрлиха in vitro // Экспер. онкол. 1999. Т. 21. № 1. С. 70-72.
9. Сидорова Т.А., Волкова М.А. Накопление 3Н-винк-ристина in vitro как возможный маркер чувствительности лейкозных клеток животных и человека к препарату//Там же. 1988. Т. 10. № 6. С. 50-53.
10. Стороженко И.В., Сергеева Н.С., Чиссов В.И., Скотникова О.И. Влияние верапамила на рост и чувствительность к винкристину опухолей человека, трансплантированных под капсулу почки мышей//БЭБиМ. 1996. №6. С. 681-683.
11. Уразова Л.Н., Громова А.Ю., Перельмутер В.М. Иммунологические механизмы в противоопухолевом эффекте вакцинного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита // Экспер. онкол. 1998. Т. 20. С. 60-65.
12. Уразова Л.Н., Рогозин Е.А., Ильинских Н.Н. Изменение жизнеспособности и цитогенетических параметров клеток асцитного рака Эрлиха под действием вакцинных штаммов РНК-вирусов в системе in vitro // БЭБиМ. 1999. Прилож. 1. С.107-109.
13. Уразова Л.Н., Громова А.Ю. Комбинированная терапия экспериментальных опухолей вакцинным штаммом вируса венесуэльского энцефаломиелита // Вопр. онкол. 2001. Т. 47. № 1. С. 78-81.
14. ФердатА.К., Муцениеце А.Я. Механизмы противоопухолевого действия вирусов и проблема иммунотерапии опухолей // Там же. 1988. Т. 34. №
11. С. 1294-1300.
15. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / Под ред. Софьиной
З.П., Сыркина А.Б., Голдина А., Кляйна А. М., 1980.
16. Gupta M., Majumder U.K., Roy M.R., Mukhopadhyay D.K. Inhibition of experimental murine tumors by a new compound isolated from mutated penicillium nigricans // Exper. oncol. 1999. Vol. 21. № 2. P. 150-153.
