CC BY
37
УДК 612.112.95:576.858-092.9
Л. Н. Уразова, Т. И. Кузнецова
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МАКРОФАГОВ НА ФОНЕ ТЕРАПИИ ВИРУСНЫМИ ВАКЦИНАМИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН, Томск
На модели карциномы легких Льюис показано, что механизмы противоопухолевой активности вакцинных штаммов вирусов базируются на модуляции отдельных параметров иммунной системы, в частности, цитостатической и супрессорной активности лимфоцитов. Отмечено усиление цитостатической активности перитонеальных макроцитов на фоне терапии вирусными вакцинами в сочетании с оперативным вмешательством, либо цитостатиками. Перитонеальные макрофаги животных-опухоленосителей, инфицированных вирусными вакцинами, проявляли выраженное цитостатическое действие, которое превышало аналогичный показатель опухолеассоциированных макрофагов.
Ключевые слова: макрофаги, вирусные вакцины, терапия.
В последние годы в число наиболее перспективных противоопухолевых воздействий входят модификаторы биологических реакций, такие как цитокины, препараты с высоким иммуно- и гемо-поэтическим потенциалом [1-4]. Неоднократно предпринимались попытки применения в качестве необластомных препаратов инфекционных агентов, в частности вирусов, способных индуцировать изменения антигенной и иммуногенной характеристик опухолевых клеток и их лизис, стимулировать выработку эндогенного ИФН, а также неспецифически модулировать иммунные реакции организма [5, 6]. Нами показана возможность применения вакцинных штаммов вирусов в терапии злокачественных опухолей в эксперименте [7]. Несмотря на многочисленные публикации, посвященные этой проблеме, вопрос о механизмах, обеспечивающих их противоопухолевый эффект, практически не освещен. Макрофаги (МФ), составляющие до 90 % всех инфильтрирующих опухоль иммунокомпетент-ных клеток, способны подавлять пролиферацию и лизировать опухолевые клетки с помощью цитокинов и цитотоксических факторов. Как известно, пусковым механизмом их активации является воздействие ИФН-а, что также делает МФ компетентными в отношении селективного связывания с опухолевыми клетками [8]. Показано, что индукторы эндогенного ИФН способны стимулировать цитотоксическую активность перитонеальных МФ в различных условиях in vivo [9]. Так как ИФН входит в число ключевых
регуляторов функциональной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов, которые осуществляют неспецифическую противоопухолевую защиту организма [10], представляет интерес оценка роли макрофагов в реализации противоопухолевых потенций вирусов — природных индукторов эндогенного ИФН, что и является целью настоящей работы.
Методика
Эксперименты проводили в осенне-зимний период, на мышах-самках линии С57В1/6 массой 18-20 г, полученных из питомника научноисследовательской лаборатории экспериментальных биомоделей ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Мыши содержались в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных. По окончании эксперимента животных забивали методом цервикальной дислокации с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных приказом МЗ России. В исследованиях использовали перевиваемую карциному легких Льюис (LLC). Опухоль получена из лаборатории опухолевых штаммов РОНЦ РАМН (Москва).
Вакцинные штаммы:
1) венесуэльского энцефаломиелита лошадей (вакцинный препарат живой, сухой, производство НПО «Вирион», Томск);
2) паротита (вакцина живая, сухая, производства акционерного общества «Д. Мазай и Ко», Москва);
3) осповакцины (вакцина живая, сухая, производства НПО «Вирион», Томск).
В моно- и комплексной терапии экспериментальных опухолей применялись алкилирующий цитостатик циклофосфан (Минмедздравпром, Россия), который вводился внутрибрюшинно в суммарной дозе 180 мг/кг на 3, 5, 7-е сутки после имплантации опухоли, а также алкалоид винбластин из растения барвинок розовый (Lilly, Франция), который в дозе 0,4 мг/кг вводился животным внутрибрюшинно на 3, 10, 17-е сутки.
Перитонеальные макрофаги (ПМ) выделяли по стандартной методике R. Hester и W. Walker (1981). Цитотоксическую активность макрофагов по отношению к клеткам карциномы легких Льюис определяли по методу В. И. Селедцова с соавт. (1987). Цитостатическую активность спленоцитов определяли по методике G. Gadiot et al. (1982) в модификации И. В. Богдашина [11]. В качестве мишеней использовали клетки мастоцитомы Р-815 либо аутологичные опухолевые клетки.
Математическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики с использованием стандартного пакета программ STATISTICA 6,0. Статистическую значимость различий между двумя независимыми выборками, если распределение изучаемого признака неизвестно, оценивали по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни.
Результаты и обсуждение
Оценку функциональной (цитостатической и цитотоксической) активности МФ, а также их суточных супернатантов проводили на 10, 17, 20-е сутки эксперимента. В качестве тест-мишеней использовали клетки мастоцитомы Р-815 и эритромиелолейкоза К-562.
Показано, что на 10-е сутки наблюдения цитостатическая активность как перитонеальных МФ, так и их суточного супернатанта в группах животных, получивших терапию вирусными вакцинами, значительно превышала аналогичные показатели у животных-опухоленосителей (табл. 1). При этом необходимо отметить увеличение индекса цитостазиса у мышей-опухо-леносителей в сравнении с интактными. На 17-е сутки опухолевого роста только вирус паротита индуцировал увеличение цитостати-ческой активности ПМФ, при этом вирус ВЭЛ вызывал значимое угнетение этого показателя. Цитостатическая активность супернатантов ПМФ мышей, получавших терапию вирусными вакцинами, не имела существенных различий с уровнем активности МФ мышей-опухоленосите-лей, но превышала соответствующий показатель у интактных животных (табл. 1).
Исследовалось влияние комплексной терапии вирусными вакцинами и циклофосфаном (ЦФ) на функциональную активность перитонеальных МФ экспериментальных животных. Было показано, что на 17-е сутки наблюдения супернатанты ПМФ мышей-опухоленосителей
Таблица 1
Влияние вирусных вакцин на цитостатическую активность ПМФ (X±m)
Группы мышей Индекс цитостазиса, %
Перитонеальные макрофаги Суточный супернатант ПМФ
10-е сутки
Интактные 7,7±0,97** 25,7±8,56**
LLC 49,8±0,75* 66,4±0,86*
LLC + вирус паротита 58,7±2,74*** 55,5±3,83*
LLC + вирус осповакцины 64,2±1,87*** 96,4±0,32***
LLC + вирус ВЭЛ 61,32±1,0*** 84,12±0,51***
17-е сутки
Интактные 41,3±6,37** 55,8±3,62
LLC 87,2±1,1* 79,6±2,44*
Интактные + вирус паротита 74,2±1,62* 74,8±2,59
LLC + вирус паротита 92,4±1,05*** 59,7±3,98**
LLC + вирус ВЭЛ 48,0±0,8** 56,7±0,81**
Интактные + вирус осповакцины н.д. 75,8±0,1*
LLC + вирус осповакцины н.д. 79,2±3,47
Примечание. Здесь и далее ЬЬС - карцинома легких Льюис; ВЭЛ - венесуэльский энцефаломиелит; уровень значимости различий с группой: * - интактных мышей; ** - опухоленосителей ЬЬС (р<0,05); н.д. - нет данных.
Таблица 2
Влияние вирусных вакцин и циклофосфана (ЦФ) на цитостатическую активность
перитонеальных МФ (X±m)
Группы животных Индекс цитостатической активности перитонеальных макрофагов, %
17-е сутки 20-е сутки
Интактные мыши 55,8±3,6 13,1±6,3
LLC 79,6±2,4* 74,5±3,9*
Интактн. + вирус паротита 74,8±2,6* н.д.
Интактн.+ вирус осповакцины 75,8±0,1* н.д.
LLC+ вирус паротита 60±3,0** 73,2±6,4*
LLC + вирус осповакцины 79,2±3,5* 80,6±6,7*
LLC + ЦФ 73,9±2,1* 81,3±2,6*
LLC + вирус паротита + ЦФ 64±1,8*** 74,3±4,9*
LLC + вирус осповакцины + ЦФ 97±0,5*** 67,4±5,0
оказывают более выраженное по сравнению с интактными животными, цитостатическое действие на клетки-мишени (табл. 2). Циклофосфан умеренно снижал индекс цитостазиса супернатанта перитонеальных МФ у мышей с опухолью, однако введение вируса осповакцины на этом фоне существенно усиливало цитостатическую активность самих макрофагов. Вирус паротита не оказывал подобного действия.
Однако следует отметить, что при монотерапии мышей-опухоленосителей вирусными вакцинами вирус осповакцины не изменял, а вирус паротита уменьшал цитостатическую активность макрофагов. Введение вирусных вакцин здоровым животным приводило к усилению функциональной активности перитонеальных МФ. В более поздние сроки наблюдения (20-е сутки) изучаемые агенты не оказывали достоверного влияния на цитостатическую активность клеток. Полученные результаты согласуются с мнением исследователей, отмечающих кратковременный характер цитотоксической и цитостатической активации макрофагов, часто сменяемый их ростстимулирующей активностью: до 6-7-х суток у интактных животных и опухоленосителей при любом активирующем воздействии иммунотроп-ными препаратами; до 96 ч — при вирусной инфекции [12-14].
Таблица 3
Влияние вакцины вируса ВЭЛ и винбластина на цитостатическую активность перитонеальных макрофагов
Изучая функциональную активность перитонеальных МФ на фоне сочетанного применения в терапии карциномы Льюис вируса ВЭЛ и винбластина (V), мы показали статистически значимое увеличение их цитостатической активности (табл. 3).
Известно, что действие экстремальных факторов, в частности операции, приводит к снижению естественной резистентности организма, что, как правило, сопровождается стимуляцией процессов опухолевого роста и метастазирова-ния. При оценке влияния вирусных вакцин на цитостатическую активность перитонеальных МФ на фоне оперативного вмешательства нами было показано, что введение препаратов оспы и паротита мышам с карциномой легких Льюис на фоне удаления первичного опухолевого узла привело к существенному возрастанию способности ПМФ ингибировать пролиферацию опухолевых тест-клеток (табл. 4). Ранее нами сообщалось, что оперативное вмешательство приводило к увеличению массы метастазов в легких у мышей с карциномой Льюис [7]. По-видимому, удаление опухолей в сочетании с антибластомной активностью исследуемых вирусов вызывает усиление противоопухолевой активности макрофагов, что вносит свой вклад в выраженное снижение послеоперационного метастазирования у животных, инфицированных вирусом. Показано (на фоне оперативного вмешательства) статистически значимое повышение цитотоксической активности макрофагов в группе мышей, леченных вирусом оспы (табл. 5).
При оценке цитотоксической активности перитонеальных макрофагов по отношению к клеткам-мишеням К-562 установлено, что на 17-20-е сутки эксперимента не наблюдается
Группы животных ИЦС, %
Интактные 55,80±3,62
LLC 79,60±2,44*
LLC + ВЭЛ 56,70±0,81**
LLC + винбластин 82,90±1,56*
LLC +ВЭЛ + винбластин 85,70±1,13***
Таблица 4
Влияние вирусных вакцин и оперативного вмешательства на функциональную активность
перитонеальных МФ (X±m)
Группы Интактные LLC LLC + вирус паротита LLL + вирус осповакцины
Супернатант, 17-е сутки, индекс цитостатической активности, %
1 55,8±3,6** 79,6*±2,4 59,7±4,0** 79,2±3,5*
2 69,1±2,8 64,0±1,1 92,1±0,0*** 88,5±0,1***
Супернатант, 17-е сутки, индекс цитотоксической активности, %
1 7,70±1,91 31,20±4,43* 20,8±2,8*** 13,90±1,92**
2 19,4±0,5 21,0±1,3 16,1±4,7 27,8±3,2***
Примечание. 1 - группы неоперированных животных; 2 - группы животных с оперативным вмешательством.
Таблица 5
Влияние вирусных вакцин и оперативного вмешательства на цитотоксическую активность
перитонеальных макрофагов (X±m)
Группы мышей Индекс цитотоксической активности, 17-е сутки, %
интактные LLC LLC + паротит LLC + оспа
1 7,70±1,91 31,20±4,43* 20,8±2,8*** 13,90±1,92**
2 19,4±0,5 21,0±1,3 16,1±4,7 27,8±3,2***
Примечание. 1 - группы неоперированных животных; 2 - группы животных с оперативным вмешательством.
Таблица 6
Влияние вирусных вакцин и циклофосфана на цитотоксическую активность ПМФ (X±m)
Группы животных Индекс цитотоксической активности ПМФ, %
17-е сутки 20-е сутки
Интактные 7,72±1,90 9,9±1,9
LLC 31,2±4,4 20,1±1,5
LLC + вирус паротита 20,8±2,8* 15,3±1
LLC + вирус осповакцины 13,9±1,9** 15,00±2,05
LLC + ЦФ 18,8±3,9* 5,7±1,4**
LLC + ЦФ + вирус паротита 4,2±1,3** н.д.
LLC + ЦФ + вирус осповакцины н.д. 22,0±1,7*
однонаправленного влияния на изучаемый показатель вирусных вакцин при монотерапии либо в сочетании с циклофосфаном. Однако в ряде случаев отмечено некоторое снижение активности ПМФ в опытных группах (табл. 6). Эти данные согласуются с полученными ранее при изучении влияния вирусных вакцин на противоопухолевую активность цитостатиков. Было показано, что совместное применение вируса ВЭЛ с ЦФ практически не изменяло эффективность последнего в отношении первичной опухоли карциномы Эрлиха и меланомы В16 у мышей, а также его антиметастатическую активность [15].
Попытки выявления роли МФ в опухолевом узле не привели к однозначным результатам. Как правило, активированные различными агентами МФ приобретают способность к выраженному цитотоксическому действию на опухолевые клетки, которое, обычно, отсутствует у
нативных клеток. Однако наряду с возрастанием противоопухолевого потенциала появляется способность поддерживать пролиферацию и обеспечивать выживание опухолевых клеток путем секреции определенных факторов.
Для оценки функциональной активности инфильтрирующих опухоль макрофагов мы определяли их цитостатическую активность по отношению к клеткам мастоцитомы Р-815 у мышей-опухоленосителей с карциномой легких Льюис, леченных вирусами паротита и осповак-цины, а также получивших комплексную терапию с ЦФ (табл. 7). На 17-е сутки наблюдения отмечено достоверное снижение изученного показателя в группе мышей, инфицированных вирусом паротита, и отсутствие изменений под действием вируса осповакцины. Монотерапия ЦФ достоверно повышала цитостатический индекс МФ. Дополнительное введение вируса
Таблица 7
Влияние вирусных вакцин на функциональную активность опухолеассоциированных макрофагов (X±m)
Показатель Группы животных (17- е сутки)
LLC LLC + оспа LLC + паротит LLC + ЦФ LLC + ЦФ + оспа
ИЦС, % 35,0±3,4 33,3±3,9 21,5±4,1* 74,1±4,6* 54,8±9,7*
ИЦТ, % 26,2±2,6 22,1±2,3 21,5±4,1* н.д. н.д.
Примечание. * - различия статистически значимы с группой «LLC» (р<0,05); ИЦС - индекс цитостатической активности; ИЦТ - индекс цитотоксической активности.
осповакцины несколько ингибировало этот эффект, но изменения изученного показателя оставались тем не менее, статистически значимыми. Таким образом, наряду с некоторой стимуляцией вирусными вакцинами функциональной активности иммунокомпетентных клеток ряд экспериментов показал отсутствие цитотоксического действия МФ, ассоциированных с карциномой легких Льюис, в отношении клеток-мишеней К-562 и цитостатического действия на Р-815. Это не противоречит имеющимся в литературе данным об уменьшении либо отсутствии противоопухолевого действия у макрофагов, инфильтрирующих опухоль [4]. К тому же следует отметить, что представленные данные отражают состояние исследуемых клеток в период максимального роста и метастазирова-ния опухоли, что также не могло не сказаться на полученных результатах.
В настоящее время четко показана амбивалентность функциональных проявлений макрофагов при злокачественном росте, а также охарактеризована их своеобразная реакция на любое активирующее воздействие, которая предполагает фазную смену продукции субстанций с преимущественной цитотоксической либо рост-стимулирующей активностью [16]. В частности, при использовании активаторов макрофагов in vivo и in vitro на 15-е сутки цитотоксическая фаза сменяется фазой продукции цитокинов с преобладающей ростстимулирующей активностью [12]. Аналогичная ситуация — отсутствие цитотоксичности у макрофагов опухоленоси-телей и появление выраженного фидерного эффекта при действии цитостатиков — показана нами в отдельных экспериментах [7].
Заключение
Установлено, что механизмы противоопухолевой активности вирусных вакцин базируются, помимо прямого цитодеструктивного действия, на модуляции отдельных параметров иммунной системы, в частности цитостатической и супрес-
сорной активности макрофагов. Полученные данные указывают на корригирующее влияние вирусных вакцин, которое обусловлено, по всей вероятности, активирующим действием интерферона на неспецифические эффекторы иммунной системы и факторы, ответственные за формирование специфического иммунного ответа на опухоль.
FUNCTIONAL STATE OF MACROPGAGES DURING THERAPY WITH VIRAL VACCINES IN EXPERIMENT
L. I. Urazova, T. I. Kuznetsova
It was shown on the model of Lewis’s lung carcinoma that the mechanisms of anti-tumor activity of virus vaccine strains were based on modulation of immune system parameters, in particular, on cytostatic and suppressive activities of lymphocytes. Enhancement of cytostatic activity of peritoneal macrophages was detected during therapy with viral vaccines in combination with surgery or cytostatic drugs. Peritoneal macrophages of tumor-bearing animals infected with viral vaccines showed the pronounced cytostatic activity exceeding the corresponding values of tumor-associated macrophages.
Литература
1. Разина Т. Г., Зуева Е. П., Лопатина К. А. и др. Роль биологически активных веществ лекарственных растений в повышении эффективности цитостатической терапии перевиваемых опухолей // БЭБиМ. - Прил. 1. 2005. - С. 35-41.
2. Хансон К. П., Имянитов Е. Н. Онкоген ERBB2/ HER2: от молекулярной к клинической онкологии // Вопр. онкологии. - 2002. - Т. 48, - № 2. - С. 137-145.
3. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака // Рус. биотерапевт. журн. - 2002. - Т. 1, -№ 3. - С. 5-14.
4. Yang C. p14(arf) modulates the cytolytic effect of onyx-015 in mesothellioma cells with wild-type p53 // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61. - P. 5959-5963.
5. Markert J. Conditionally replicating herpes simplex virus mutant, G207 for the treatment of malignant glioma: results of a phase l trial // Gene Ther. - 2000. - Vol. 7. -P. 867-874.
6. Papanastassiou V. The potential for efficacy of the modified (ICP34.5(-) herpes simplex virus HSV11716 following intratumoural injection into human malignant glioma: a proof of principle study // Gene Ther. - 2002. -Vol. 9. - P. 398-406.
7. Уразова Л. Н., Кузнецова Т. И., Видяева И. Г. Опыт применения вирусных вакцин в терапии экспериментальных злокачественных опухолей // Рос. биотерапевт. журн. - 2004. - № 2. - С. 9-10.
8. Ершов Ф. И. Система интерферона в норме и при патологии / Ф. И. Ершов. - М., 1996.
9. Литвяков Н. В., Чердынцева Н. В., Белявская В. А. и др. Роль макрофагов в реализации антибластом-ного действия рекомбинантного пробиотика субалина // Вопр. онкологии. - 2001. - Т. 47, - № 1. - С. 86-89.
10. Gavilondo I., Larrick J., Borrebaeck C. Human antibodies therapy // Immunologist. - 2000. - Vol. 8. -P. 58-65.
11. Богдашин И. В. Исследование механизмов цитоста-тических взаимодействий клеток системы иммунитета
с опухолевыми клетками: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Томск, 1989. - 23 c.
12. Зубова С. Г., Данилов А. С., Окулов В. Б. и др. Синтез и экспрессия транформирующего фактора роста бета-активированными макрофагами // Вопр. онкологии. - 1996. - Т. 42, - № 5. - С. 80-86.
13. Окулов В. Б. Актуальные проблемы иммунотерапии опухолей в контексте эволюционно закрепленной реакции макрофага на повреждение тканей // Вопр. онкологии. - 1997. - Т. 43, - № 1. - С. 102-106.
14. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и патологии // Иммунология. - 1997. - № 3. - С. 4-7.
15. Urazova L., Gromova A. Antimetastatic activity of a vaccinal strain of Venezuelan encephalomyelitis virus // J. of B.U.ON. - 1997. - Vol. 2. - N 4. - P. 363-366.
16. Mantovani А., Bottazzi В., Colotta F., et al. The origin and function of tumor-associated macrophages // Immunol. Today. - 1992. - Vol.13. - P. 265-279.
