CC BY
35
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2016 УДК 577.12:612.35.015.348
ИЗМЕНЕНИЕ СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ ПРОДУКТОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВ ПЕЧЕНИ КРЫС В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА РАЗЛИЧНОЙ ВЫРАЖЕННОСТИ
С.А. ТЕПЛОВ, Ю.В. АБАЛЕНИХИНА, М.А. ФОМИНА, ИВ. МАТВЕЕВА
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань
CHANGES INTHESPECTRUMOFABSORPTIONOFOXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS IN RAT LIVER WITH SHORTAGE OF NITRIC OXIDE SYNTHESIS OF DIFFERENT EXPRESSIONS
S.A. TEPLOV, Y.V. ABALENIHINA, MA. FOMINA, IV. MATVEEVA Ryazan State Medical University, Ryazan
Изучено влияние L-NAME в дозе 25 и 200 мг/кг на окислительную модификацию белков печени крыс. Установлено, что при использовании N-нитро^-аргининметилового эфира в дозе 25 мг/кг уровень карбонильных производных белков печени крыс увеличивается по сравнению с контролем. Важно отметить, что статистически значимо увеличивается количество альдегид- и кетон-динитрофенил-гидразонов в ультрафиолетовой области спектра, что свидетельствует о повреждении остатков аминокислот, обладающих нейтральными свойствами. Под действием L-NAME в дозе 200 мг/кг уровень карбонильных производных белков печени крыс уменьшается по сравнению с контролем, что является следствием снижения синтеза оксида азота. Так же отмечается увеличение резервно-адаптационного потенциала, что указывает на явные адаптационные и регенеративные способности печени.
Ключевые слова: окислительная модификациябелков, L-NAME, печень.
Influence of L-NAME in a dose of 25 and 200 mg/kg on oxidizing modification of proteins of a liver of rats is studied. It is established that when using N-nitro - L-arginine methyl ester in a dose of 25 mg/kg the level of proteins carbonyl derivative of a liver of rats increases in comparison with control. It is important to note that the quantity of aldehyde -and ketone-dinitropheniylhydrazons in ultra-violet area of a range statistically significantly increases that testifies to damage of the remains of the amino acids possessing neutral properties. Under the influence of L-NAME in a dose of 200 mg/kg the level of carbonyl derivative proteins of a liver of rats decreases in comparison with control that is a consequence of reduction of synthesis of nitrogen oxide. Also the increase in reserve and adaptation potential is noted that points to obvious adaptation and regenerative abilities of a liver.
Keywords: oxidative modification of proteins, L-NAME, liver.
Актуальность
Оксид азота является универсальным биологическим месседжером благодаря своим физико-химическим свойствам. Универсальность действия N0 проявляется в способности регулировать многие физиологические и патофизиологические процессы [3]. Однако, при рассмотрении конкретного действия отмечается двойственность проявления эффектов, например, оксид азота способен как индуцировать [13], так и замедлятьокис-лительные процессы [11]. Nю-нитро-L-аргинин-метиловый эфир (L-NAME) является неселективным ингибитором ин-дуцибельной N0-синтазы, механизм действия которого основан на конкурентных взаимоотношениях с субстратом за активный центр фермента [2]. Данные изменения происходят в тканях, имеющих специфические эстеразы, такие как: печень, эндотелий [10, 12]. В связи с этим, особый интерес представляет исследование окислительной модификации белков печени в условиях экспериментального ингибиро-вания синтеза оксида азота [5].
Цель исследования Оценить спонтанную окислительную модификацию и резервно-адаптационный потенциал белков печени крыс под действием L-NAME в дозе 25 и 200 мг/кг Материалы и методы Исследование проводили на 24 конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 280-320 граммов, которые были разделены на контрольную и экспериментальные группы.
Животным экспериментальной группы №1 (п = 8) ежедневно, в течение 7 дней внутрибрюшинно вводили L-NAME дозе 25 мг/кг [9], экспериментальной группы №2 (п=8) - в дозе 200 мг/кг [14].
Животным контрольной группы (п = 8) в те же сроки осуществляли внутрибрюшин-ное введение физиологического раствора.
Содержание животных в виварии соответствовало «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических
клиник» от 06.04.1993. Все манипуляции с животными, в том числе и выведение из эксперимента осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.).
Немедленно после выведения животных из эксперимента из ткани печени путём двойного ультрацентрифугирова-нияполучали чистую цитоплазматическую (неседиментируемую) фракцию [4].
Окислительную модификацию белков оценивали по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой, после осаждения нуклеиновых кислот 10 %-м раствором стрептомицина сульфата [6].
Оценка спонтанной и металл-зависимой окислительной модификации белков на различных длинах волн поглощения может осуществляться и трактоваться раздельно, однако наибольшую информацию предоставляет параллельное осуществление указанных вариантов с последующим подсчетом отношения результатов измерения продуктов спонтанного окисления к индуцированному по реакции Фентона, принимая результаты индуцированного измерения за 100%, что характеризует резервно-адаптационный потенциал [7].
Карбонильные производные окисленных белков регистрировали на спектрофотометре при следующих длинах волн: 254, 270, 280, 356 нм (альдегид-динитрофенилгидразоны нейтрального характера - АДНФГн ), 363 и 370 нм (ке-тон-динитрофенилгидразоны нейтрального характера - КДНФГн ), 428 и 430 нм (альдегид-динитрофенилгидразоны основного характера - АДНФГо ) и 434, 524, 530, 535 нм (кетон-динитрофенилгидра-зоны основного характера КДНФГо ). Перечисленные длины волн выбраны в соответствии с диапазонами, в которых регистрируются динитрофенилгидразоны [8].
По полученным значениям экстинк-ций строили спектр поглощения продуктов окислительной модификации белков и подсчитывали площадь под кривой, вы-
раженной в условных единицах на грамм белка (у.е./г белка).
Для оценки достоверности различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест).
Результаты и их обсуждение
Площади под кривой спектра ДНФГ-дериватов окисленных белков печени крыс составили: в контрольной группе - 3,044 [2,515; 3,367]; в экспериментальной группе - 5,740 [4,854; 7,265]. Из полученных данных, следует, что под действием L-NAME в дозе 25 мг/кг уровень карбонильных производных белков печени увеличивается по сравнению со значения-миконтрольнойгруппы. Важно отметить, что статистически значимое увеличение наблюдается в ультрафиолетовой области спектра (рис. 1), а именно в диапазонах: 254-356 нм, что соответствует АДНФГн; 363-370 нм, соответствует КДНФГн.
Известно, что существует несколько путей образования карбонильных производных белков, одним из которых является прямое воздействие на аминокислотные остатки боковых цепей белков активных форм кислорода, генерация которых в условиях угнетения синтеза оксида азо-та(П) может происходить за счет подавления антиоксидантной системы, например, каталазы и а-токоферола. Известно, что перекисное окисление липидов также ин-
гибируется благодаря взаимодействию NO с алкилпероксильными и алкоксиль-ными радикалами. Возможно поэтому под действием L-NAME в дозе 25 мг/кг образование карбонильных производных может происходить за счет взаимодействия продуктов свободнорадикального окисления липидов с остатками аминокислот в составе белков [6] и металлами переменной валентности [1].
Что же касается L-NAME в дозе 200 мг/кг, то площади под кривой спектра ДНФГ-девирватов окисленных белков печени крыс составили: в контрольной группе - 3,044 [2,515; 3,367]; в экспериментальной группе - 0,659 [0,570; 1,023]. Из полученных данных следует, что под действием L-NAME в дозе 200 мг/кг уровень карбонильных производных белков печени уменьшается по сравнению со значениямиконтрольной группы. Важно отметить, что статистически значимое уменьшение динитрофенилгидразонов отмечено на длинах волн 230 и 356 нм, что составляет АДНФГн; 363 и 370 нм -КДНФГн; 428 и 430 нм - АДНФГо; 434 и 520 нм -КДНФГо (рис. 1).
Из этого следует, что снижение образование карбонильных производных белков, под действием L-NAME в дозе 200 мг/кг, является, следствием снижения синтеза оксида азота (II).
Рис. 1. Спектр поглощения продуктов окислительной модификации белков печени крыс (*- статистически значимые различия от контрольной группы; #- статистически значимые различия экспериментальной группы №1 от экспериментальной группы №2 (р<0,05))
Резервно-адаптационный потенциал отражает возможностикакого-либо уровня организации живой структуры (субклеточного, тканевого, органного, системного, целостного организма) приспосабливаться к постоянно изменяющимся условиям окружающей среды. Чем выше уро-
вень резервно-адаптационного потенциала, тем большие способности имеет организм к нивелированию неблагоприятных воздействий.
Результатыполученные при оценке данного показателя представлены на рисунке 2.
шоо печени
Рис. 2. Резервно-адаптационный потенциал белков печени (*- статистически значимые различия от контрольной группы (р<0,05))
Из данных, приведённых на рисунке, следует, что для печени с увеличением дозы L-NAME происходило увеличение резервно-адаптационного потенциала, что объясняется повышенной устойчивостью и адаптацией данного органа к неблагоприятным факторам среды.
Выводы
1. №нитро- L-аргининметиловый эфир в дозе 25 мг/кг способствует образованию карбонильных производных белков, при этом резервно-адаптационный потенциал печени увеличивается.
2. №нитро- L-аргининметиловый эфир в дозе 200 мг/кг способствует снижению образования карбонильных производных белков, при этом резервно-адаптационный по-тенциалне изменяется относительно значений контрольной группы и экспериментальной группы L-NAME 25 мг/кг.
Литература
1. Абаленихина Ю.В. Влияние модуляторов синтеза оксида азота на актив-
ность и аутопроцессингкатепсина в имму-нокомпетентных органов крыс в условиях in vitro / Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина // Наука молодых (Eruditio Juvenium). -2014. - №1. - С. 53-60.
2. Влияние ультрадисперсных порошков меди на окислительную модификацию белков сердца крыс / Ю.В. Абаленихина [и др.] // Наука молодых (Eruditio Juvenium). - 2015. - №1. - С. 18-25.
3. Исследование эндотелио и карди-опротективных эффектов комбинаций основных групп антигипертензивных средств с L-аргинином при экспериментальной эндотелиальной дисфункции / Т.Г. Покровская [и др.] // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2008. - №2. - С. 126-131.
4. Лущак В.И. Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма / В.И. Лущак // Биохимия. - 2007. - Т. 72, вып. 8. - С. 995-1017.
5. Окислительная модификация белков и изменение активности катепсинаL селезенки крыс в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота / Ю.В. Абаленихина [и др.] // Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. - 2013. - №1. - С. 45-49.
6. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод её определения / Е.Е. Дубинина [и др.] // Вопр. мед. химии. - 1995. - Т. 41, № 1. -С. 24-26.
7. Фомина М.А. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях: методические рекомендации / М.А. Фомина, Ю.В. Аба-ленихина; ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава. - Рязань: РИО РязГМУ, 2014. - 60 с.
8. Характеристика продуктов окислительного повреждения белков миокарда на фоне гипергомоцистеинемии / И.С. Ильичева, М.А. Фомина, Д.В. Медведев // Наука молодых (Eruditio Juvenium). -2014. - №4. - С. 37-44.
9. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании и дефицита окиси азота / М.В. Покровский [и др.] // Эксперим. и клинич. фармакология. -2008. - Т. 71, № 2. - С. 29-31.
10. Direct and Indirect Antioxidant Effects of Nitric Oxide: Radically / LaskinJ.D. [et al.] // Antioxidants & Redoxsignaling. -2001. - №3. - P. 261-271.
11. Nyström T. Role of oxidative car-bonylation in protein quality control and senescence / T. Nyström // The EMBO Journal.
- 2005. - Vol. 24. - P. 1311-1317.
12. Scibior, D. Arginine - metabolism and functions in the human organism / D. Scibior, H. Czeczot // Postepy Hig. Med. Dosw. - 2004. - Vol. 58. - P. 321-332.
13. Teale F.W.J. Ultraviolet fluorescence of proteins in neutral solution / F.W.J. Teale // Biochem. J. - 1960. - Vol. 76, № 2.
- P. 381-388.
14. Wang Zun-Yi. Role of nitric oxide (NO) in ocular inflammation/ Zun-Yi British Wang // Journal of Pharmacology. - 1995. -Vol. 116. - P. 2447-2450.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Теплов Семён Александрович - студент 4 курса, 1 группы, лечебного факультета ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань. E-mail: [email protected]
Абаленихина Юлия Владимировна - ст. преп. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань. E-mail: [email protected]
Фомина Мария Алексеевна - к.м.н., доц. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань. E-mail: [email protected]
Матвеева Ирина Васильевна - к.м.н., зав. кафедрой биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань. E-mail: [email protected]
