CC BY
47
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 2013 УДК 616.12-001-073.97:615.894.19
ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ
КАТЕПСИНА Ь СЕЛЕЗЕНКИ КРЫС В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ДЕФИЦИТА СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА
Ю.В. Абаленихина, М.А. Фомина, С.А. Исаков
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань
Изучено влияние ингибитора КО-синтазы на окислительную модификацию белков и активность катепсина Ь в селезенке крыс. Установлено, что в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота снижается количество альдегид-динитрофенилгидразонов нейтрального и основного характера, при этом увеличивается количество кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального характера. Указанные изменения сопровождаются увеличением активности катепсина Ь.
Ключевые слова: окислительная модификация белка, катепсин Ь, ингибитор N0-синтазы.
Катепсин L относится к группе лизо-сомальных цистеиновых протеиназ, которые участвуют не только в деградации белковых молекул, но и в формировании иммунного ответа [11]. Одним из важнейших иммунокомпетентных органов является селезенка, в ней концентрируются супрессорные, хелперные и часть эф-фекторных клеток, здесь же происходят процесс активного антителообразования и продукция гуморальных медиаторов [7].
В формировании защитных эффектов адаптации вовлечены практически все основные системы организма, в том числе и иммунная. Одним из регуляторов физиологических процессов организма является оксид азота (II) [2]. При взаимодействии NО с супероксидным анион-радикалом (О2-) образуется высокоактивное соединение пероксинитрит (ОNОО-), который может реагировать с белками и изменять их свойства [13]. Модифицированные формы протеинов деградируют быстрее, чем их нативные аналоги под действием протеиназ [3].
Угнетение синтеза NO при некоторых патологических состояниях должно приво-
дить к уменьшению его повреждающего действия на клетки. Одним из антагонистов синтеза оксида азота является ^нитро-Ь-аргининметиловый эфир (Ь-КАМЕ), представляющий собой неселективный ингибитор индуцибельной NO-синтазы.
В связи с этим актуальным представляется изучение активности катепси-на Ь селезенки в сочетании с оценкой окислительной модификации белков в условиях дефицита синтеза оксида азота.
Материалы и методы
Исследование проводили на 16 конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 280-320 г. Экспериментальной группе крыс (п=8) в течение 7 дней внутрибрюшинно вводили Ь-ЫЛМЕ в дозе 25 мг/кг [9]. Контрольной группе животных (п=8) в те же сроки осуществляли внутрибрюшинное введение физиологического раствора. Содержание и выведение животных из выполняли в соответствии с правилами, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ №267 от
19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Немедленно после выведения животного из эксперимента точную навеску ткани селезёнки помещали в холодный
0,25 М раствор сахарозы в соотношении 1/100 и гомогенизировали в течение 35 секунд при 900 об/мин в гомогенизаторе Potter S. Описанные процедуры проводили при температуре не выше 40С.
Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 1000 g для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Надосадочную жидкость центрифугировали 15 мин при 14000 g для удаления митохондрий, а затем полученный супернатант - дополнительно при 20000 g в течение 30 мин для получения чистой цитоплазматической (неседиментируемой) фракции. Осадок, представляющий собой грубую фракцию лизосом (седиментируе-мая фракция), ресуспендировали в 0,25 М сахарозе с добавлением Тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1%.
Активность катепсина L определяли спектрофлуориметрическим методом по A.J. Barrett и H. Kirschke [10] в седимен-тируемой и неседиментируемой фракциях гомогената и обозначали как седименти-руемую и неседиментируемую активность (СА и НСА). Общую активность (ОА) рассчитывали как сумму СА и НСА. Данный показатель использовался для расчёта коэффициента лабильности лизосомаль-ной мембраны (К лаб), представляющего собой процентное соотношение НСА/ОА.
Для определения степени аутокаталитической активации катепсина L реакционную смесь, включающую 8 мМ ДТТ, 2 мМ ЭДТА и 0,1 мл гомогената селезенки, преинкубировали в течение 15 минут при 370 С, после чего к ней добавляли 20 мкМ N-CBZ-Phe-Arg-7-амидо-4-метилку-марина и инкубировали 60 минут при 370 C [1]. Степень аутокаталитической активации катепсина L оценивалась по коэффициенту отношения значения активности фермента после прекаталитической инкубации к параллельно определяемому значению активности без преинкубации (коэффициент активации).
Окислительную модификацию белков (ОМБ) оценивали по методу R. L. Levine в модификации Е. Е. Дубининой [2], после осаждения нуклеиновых кислот 10%-ным раствором стрептомицина сульфата. Степень окислительной модификации белков выражали в единицах оптической плотности, отнесенных на 1 грамм белка в пробе.
Статистический анализ данных проводили по U-критерию Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение
Изменение активности катепсина L селезенки крыс под влиянием ингибитора NO-синтазы. При сопоставлении активности катепсина L контрольной и экспериментальной группы была отмечена однонаправленная тенденция увеличения активности и коэффициента лабильности (табл. 1).
Таблица 1
Значения активности катепсина Ь селезенки крыс контрольной _______________и экспериментальной групп (М±$)_________________________
нмоль/с*г белка нмоль/с*г ткани
НСА 1,516±0,444 0,135±0,015
контроль СА 8,222±2,271 0,166±0,008
(П = 8) ОА 9,738±2,613 0,300±0,015
) 6х 15,701±2,696 44,769±3,183
НСА 3,606±1,119* 0,312±0,043*
L-NAME СА 12,064±2,875* 0,166±0,011
(n = 8) ОА 15,669±3,429* 0,478±0,040*
) 6х 23,059±5,083* 65,167±3,870*
Примечание: * - статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05).
Из приведенных данных следует, что под действием Ь-ЫАМЕ общая активность катепсина Ь возрастает преимущественно за счёт внелизосомальной фракции.
Коэффициент лабильности характеризует проницаемость лизосомальной мембраны и косвенно говорит о распределении катепсина Ь между первичными и вторичными лизосомами. Данный показатель в экспериментальной группе статистически значимо повышается по сравнению с контрольной. Поэтому представляется вероятным, что увеличение неседиментируемой активности объясняется увеличением уровня секреции катепсина Ь.
К настоящему времени аутокаталитический механизм активации был описан для многих цистеиновых протеиназ, в том числе и для катепсина Ь [9]. Результаты изучения активации катепсина Ь в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота, показывают, что Ь-ЫАМЕ в дозе 25 мг/кг оказывает влияние на аутопроцессинг данного катепсина. Оценка аутокаталитической акти-
вации катепсина Ь продемонстрировала однонаправленную тенденцию: коэффициент активации для экспериментальной группы оказался статистически значимо ниже показателя контрольной группы как для НСА (0,667 ± 0,064 против 1,275 ± 0,185 соответственно, р<0,05), так и для СА (0,357 ± 0,097 и 1,037 ± 0,082 соответственно р<0,05). На основании полученных данных можно предположить, что большая по сравнению с контролем часть молекул катепсина Ь при данной модели находится в активной форме.
Оценка степени окислительной модификации белка в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота.
На рисунке 1 представлены данные об уровне спонтанной ОМБ в контрольной и экспериментальной группах. Статистически значимые различия отмечены на длинах волн 530 нм, 254 и 270 нм, что свидетельствует об увеличении кетон-динитрофенилгидразонов и снижении алифатических альдегид-динитрофенил-гидразонов [5].
«контроль I - ЬЫате 25
нм нм нм нм нм нм нм нм
Рис. 1. Значения спонтанной ОМБ в контрольной и экспериментальной группах
Карбонильные производные белков
- это стабильные продукты, которые образуются при участии аминокислотных остатков лизина, цистеина и гистидина [6], наиболее реактивные из них альдегидные формы [12]. Важным следствием окислительной модификации белков является инактивация ферментов альдегидами. Отмечено, что альдегиды способны связываться с остатками цистеина в со-
ставе ряда ферментов, что приводит к утрате их активности [6]. Таким образом, увеличение активности цистеиновой про-теиназы катепсина Ь может объясняться снижением ингибирующего воздействия альдегидных форм.
В последние годы было обнаружено, что N0' при низкой концентрации вызывает гиперполяризацию клеточной мембраны. В результате наблюдается увели-
чение уровня цитозольного Ca++, что сопровождается активацией протеолитиче-ских ферментов [2]. Активность ферментов, в том числе и протеолитических, сильно меняется при изменении состава микроокружения. Активность протеаз изменяется в присутствии ряда катионов и анионов, среди активаторов наибольшее внимание уделяют катионам кальция [4]. Повышение уровня цитозольного Ca++ и неконтролируемый запуск каскада Са++-зависимых реакций вызывает гибель клетки (апоптоз и некроз) [2].
Таким образом, возможно, что наблюдаемое нами повышение активности катепсина L является ответом на развитие воспалительных процессов и апоптоза клеток, причём мишенью действия катепсина L при данной модели являются окисленные белки. Это приводит к быстрому устранению поврежденных макромолекул и усилению их обновления за счет синтеза.
Выводы
Воздействие ингибитора синтеза NO приводит к повышению активности катепсина L преимущественно за счет вне-лизосомальной фракции, с увеличением доли активных молекул. Указанные изменения могут объясняться снижением инактивирующего влияния продуктов окислительной модификации белков.
Литература
1. Борискина М.А. Изменение активности лизосомальных цистеиновых про-теиназ у больных хроническими лейкозами в динамике заболевания: дис. ... канд. мед. наук / М.А. Борискина. -Рязань, 1996. - С. 45-46.
2. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток / Е.Е. Дубинина. - СПб.: Медицинская пресса, 2006. - 400 с.
3. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях / Е.Е. Дубинина, А.В. Пустыгина // Укр. бюх1м. журн. - 2008. - Т. 80, №6. - С. 5-15.
4. Лысенко Л.А. Протеолитическая регуляция биологических процессов / Л.А.
Лысенко, Н.Н. Немова, Н.П. Канцеро-ва. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2011. - 482 с.
5. Окислительная модификация белков и олигопептидов у больных хроническими дерматозами с синдромом эндогенной интоксикации / Т.В. Копытова [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2009. - №6. - С. 25-29.
6. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования / Л.Е. Муравлева [и др.] // Фундаментальные исследования. - 2010. -№1. - С. 74-78.
7. Шапкин Ю.Г. Значение селезенки в иммунном статусе организма / Ю.Г. Шапкин, В.В. Масляков // Анналы хирургии. - 2009. - №1. - С. 9-12.
8. Эндотелиопротекторные эффекты L-аргинина при моделировании дефицита окиси азота / М.В. Покровский [и др.] // Эксперим. и клинич. фармакология. - 2008. - Т. 71, №2. - С. 29-31.
9. Autocatalytic processing of recombinant human procathepsin L. Contribution of both intermolecular and unimolecular events in the processing of procathepsin L in vitro / R. Menard [et al.] // J Biol Chem. - 1998. - Vol. 273, №8. - P. 4478-4484.
10. Barrett A.J. Cathepsin B, Cathepsin H, cathepsin L / A.J. Barrett., H. Kirschke // Methods in Enzymol. - 1981. - Vol. 80.
- P. 535-561.
11. Conus S. Cathepsins and their involvement in immune responses / S. Conus, S. Hans-Uwe // Swiss medical weekly. - 2010. - Р. 1-12.
12. Oxidative stress and covalent modification of protein with bioactive aldehydes / P.A. Grimsrud [et al.] // The journal of biological chemistry. - 2008. - Vol. 283, № 32. - P. 21837-21841.
13. Glyanko A.K. Physiological role of nitric oxide (NO) at vegetative organisms / A.K. Glyanko, N.V. Mitanova, A.V. Stepanov // Journal of stress physiology & biochemistry. - 2009. - Vol. 5, №3. -P. 33-52.
OXIDIZING UPDATING OF PROTEINS AND CHANGE OF ACTIVITY CATHEPSIN L RATS SPLEEN IN THE CONDITIONS OF MODELING DEFICIENCY OF NITRIC OXIDE SYNTHESIS
J. V. Abalenihina, M.A. Fomina, S.A. Isakov
Influence inhibitor synthesis NO-synthase on activity cathepsin L and oxidising updating of proteins in a spleen of rats is studied. It is established that in the conditions deficiency of nitrogen oxide synthesis the quantity aldehyde-dinitrofenilgidrazons of neutral and basic character decreases, the quantity keton-dinitrofenilgidrazons neutral character with one-stage increase in activity cathepsin L thus increases.
Keywords: oxidative modification of protein, cathepsin L, nitrogen oxide.
Абаленихина Ю.В. - ассист. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9.
E-mail: [email protected].
Фомина М.А. - к.м.н., доц. кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
