CC BY
50
БИОЛОГИЯ
УДК 616-006
ИЗМЕНЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ИК-СПЕКТРОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЖИВОТНЫХ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ НА ФОНЕ КОМПЛЕКСНОГО ВВЕДЕНИЯ ДОКСОРУБИЦИНА И ОЗОНА
© 2011 г. О.В. Красникова 1 , А.С. Гордецов 2, К.Н. Конторщикова 2,
В.Н. Крылов 1, А.И. Сазанов 2
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
2 Нижегородская государственная медицинская академия
Поступила в редакцию 04.08.2011
Проведен поиск корреляционной зависимости параметров инфракрасных спектров плазмы крови животных-опухоленосителей от изменений концентраций некоторых фосфорсодержащих метаболитов на фоне комплексного введения озона и доксорубицина.
Ключевые словн: инфракрасная спектроскопия, рак молочной железы, доксорубицин, озонированный физиологический раствор.
Введение
Инфракрасная (ИК) спектроскопия - раздел молекулярной оптической спектроскопии, изучающий спектры поглощения и отражения электромагнитного излучения в ИК-области, т.е. в диапазоне длин волн от 10-6 до 10-3 м [1]. Данный метод используется в экспериментальной органической химии, а также начинает применяться в клинической лабораторной диагностике [1]. Метод ИК-спектроскопии плазмы крови позволяет оценить эффективность воздействия лекарственной терапии [2]. Аналитически информативными показателями в данном методе являются полосы поглощения ИК-спектра, соответствующие связям фосфор - кислород (Р - О) фосфорсодержащих соединений [2], однако ранее проведенные исследования не позволяют дать однозначный ответ в установлении химической природы этих соединений [1]. По литературным данным [3] к фосфорсодержащим соединениям плазмы крови относятся: неорганические фосфаты, фосфолипиды (фосфатидил-холин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидил-инозитол), фосфор кислоторастворимый эрит-роцитарный (нуклеозидтри(ди, моно)фосфор-ные кислоты и их производные). На содержание фосфорсодержащих веществ в плазме крови влияет как физиологическое состояние организма, так и экзогенное введение лекарственных препаратов (витаминов, гормонов, биологически активных добавок и т. д.).
В настоящее время не представляется возможным ответить на вопрос, изменение содержания каких именно фосфорсодержащих соединений меняет параметры ИК-спектра плазмы крови при развитии патологических процессов в организме, т. к. ИК-спектры этих соединений перекрываются и полосы поглощения этих веществ накладываются друг на друга. Тем не менее, метод ИК-спектроскопии позволяет регистрировать изменение соотношений фосфорсодержащих веществ в крови [4] и её плазме [2, 4].
Одним из видов заболеваний, которые могут быть диагностированы методом ИК-спектроскопии плазмы крови, является патология молочной железы [5].
Рак молочной железы (РМЖ) - одна из самых актуальных проблем современной клинической онкологии, т.к. данная патология занимает первое место в структуре заболеваемости женщин, а частота его неуклонно растет. Постоянно увеличивается и смертность от этой формы рака [6]. В связи с этим диагностика и лечение данного заболевания превратились в важнейшую социальную и медицинскую проблему.
В настоящее время для лечения онкологических больных применяются три основных метода: хирургическое вмешательство, лучевая терапия, полихимиотерапия [7]. Однако данные методы несовершенны и имеют ряд
побочных эффектов. Таким образом, остается актуальным поиск методов повышения эффективности лечения онкобольных с минимальным отрицательным воздействием на нормальные клетки. Одним из таких методов является озонотерапия - активно развивающееся направление как клинической, так и профилактической медицины [8]. Использование этого метода способствует повышению качества жизни онкологических больных, обеспечивает снижение частоты побочных эффектов химио-лучевой терапии, оптимизирует проведение основного лечения. Индивидуальный подбор доз озона в составе озоно-кислородной смеси позволяет избежать развития в организме окислительного стресса и делает метод безопасным для применения в клинической практике. Доказана эффективность применения озонотерапии в комплексном и комбинированном лечении больных РМЖ [9]. Полученные результаты свидетельствуют, что использование озонированного физиологического раствора (ОФР) достоверно снижало проявления побочных токсических эффектов химиопрепаратов. По мнению авторов, в результате обеспечиваются лучшие условия для проведения курсов полихимиотерапии, при этом не требуется сокращения доз вводимых цитоста-тических препаратов, сохраняется запланированная интенсивность проводимой терапии, значительно снижается количество поддерживающих препаратов. Авторы отметили потенцирующее действие низких терапевтических доз озона в отношении противоопухолевого эффекта цитостатиков и лучевой терапии [8].
Низкие концентрации активных форм кислорода (АФК) влияют на энергетические процессы в организме [8], а значит должны меняться и параметры ИК-спектра плазмы крови. Таким образом, методом ИК-спектроскопии плазмы крови можно оценить эффективность совместного применения озона и химиопрепарата при неоплазии.
Цель работы - поиск корреляционной зависимости параметров инфракрасных спектров плазмы крови животных-опухоленосителей с изменением концентраций некоторых фосфорсодержащих метаболитов на фоне комплексного введения озона и доксорубицина (ДР).
Экспериментальная часть
Экспериментальная часть исследования выполнена на лабораторных животных - белых нелинейных крысах-самках (75 особей) массой 200±10 г. Модель неоплазии создавали путем перевивки опухолевого штамма рака молочной
железы крысы (РМК-1), приобретенного в Онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (г. Москва).
Кусочки опухолевой ткани (диаметр 1 мм) с физиологическим раствором (0.5 мл) вводили подкожно в область правой подмышечной впадины крысе-реципиенту. Животных включали в эксперимент на 45-е сутки после перевивки опухоли, объем которой к этому времени достигал 6-8 см3.
Животные были разделены на 5 групп по 15 особей в каждой:
1 группа (интактная) - здоровые животные;
2 группа (контрольная) - крысы с неоплазией, не подвергавшиеся каким-либо лечебным воздействиям; 3 группа (опытная— 1) - крысы с не-оплазией, получавшие в качестве лечебного средства химиопрепарат ДР в дозе 0.04 мг на особь через день, всего 5 процедур. Препарат вводили внутрибрюшинно; 4 группа (опытная— 2) - крысы с неоплазией, которым внутрибрю-шинно вводили озонированный физиологический раствор в объеме 0.02 мл с дозой озона 20 мкг. Всего выполнялось 6 процедур через день; 5 группа (опытная—3) - крысы с неоплазией, которым вводили внутрибрюшинно через день 5 доз ДР и 6 инъекций ОФР.
ОФР получали барботированием 0.9%-ного раствора NaCl озоно-кислородной смесью с помощью серийного отечественного генератора озона фирмы «Квазар» (Н. Новгород). Концентрацию озона в физиологическом растворе определяли с помощью серийного отечественного анализатора концентраций.
На 11-й день после начала эксперимента под эфирным наркозом осуществляли декапитацию животных. Исследованию подвергалась плазма крови, полученная путём центрифугирования цельной гепаринизированной крови в течение 15 минут при 3000 оборотов в минуту.
Исследование проводили с помощью метода ИК-спектроскопии плазмы крови [1]. Для исследования плазму крови высушивали в течение двух дней при комнатной температуре. Образец готовили в виде суспензии в вазелиновом масле. Регистрацию спектров производили на спектрофотометре «Specord 75 IR», в диапазоне волновых чисел 1170-1025 см-1. За ИК-спект-роскопические параметры принимали частные, полученные в результате деления высот пиков полос поглощения друг на друга: X = 1125/1100, Y = 1165/1080, Z = 1080/1070 [5]. Для оценки параметров ИК-спектра были выбраны относительные условные единицы (о. у. е.).
Полученные данные были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica-6.0 (Windows 98) и Microsoft
Таблица
Значения параметров X, Y, Z ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных на фоне введения ДР, ОФР, ОФР+ДР
Отношение полос поглощения, о.у.е. Группа X (112З/1 lGG), о. у. е. Y (l^/^G), о. у. е. Z (1G8G/1G7G), о. у. е.
Интактная G.83±G.G4 l.42±G.ll G^G^
Контрольная 6.47±G.l3* 2.42±G.l2* G.67±G.G2*
Опытная-l G.67±G.Gl** l.G9±G.G2** G.48±G.Gl**
Опытная-2 l^G^** l.GG±G.Gl** G.ЗG±G.Gl**
Опытная-3 l^G^** l.G3±G.Gl** G.8З±G.G3**
* Различия достоверны по сравнению с группой интактных животных (р < 0.05).
* * Различия достоверны по сравнению с группой контрольных животных (р < 0.05).
Excel с использованием методов одномерной статистики.
Результаты представляли в виде М±т, где М
- среднее арифметическое, m - стандартное отклонение. Достоверность различий средних значений определяли по t-критерию Стьюдента. Выборки считались принадлежащими к разным генеральным совокупностям приp < G^.
Результаты и их обсуждение
В ходе исследования были изучены параметры ИК-спектров плазмы крови крыс-опухолено-сителей на фоне введения ОФР (с дозой озона 2G мкг на особь, 6 процедур через день), ДР (в дозе G.G4 мг на особь, З процедур через день), комплекса ОФР+ДР (6 и З инъекций соответственно, через день).
Рассчитаны значения параметров ИК-спектров плазмы крови экспериментальных групп животных. Результаты представлены в таблице.
Из результатов исследований видно, что исследуемые вещества изменяют значения параметров ИК-спектров плазмы крови у животных-опухоленосителей. В настоящей работе отмечено, что параметры X, Y в опытных группах по отношению к контролю достоверно ниже, т.е. частное от деления высоты пика поглощения i І2З, ІІ6З см-1 соответственно на высоты пиков поглощения ilGG, 1G8G см-1 уменьшается, а значит, снижается интенсивность полос поглощения при ІІ2З, ІІ6З см-1. Согласно литературным данным [3], в роли фосфорсодержащих соединений плазмы крови могут выступать нуклео-зидтри(ди, моно)фосфорные кислоты и их производные. Логично предположить, что полоса поглощения при ІІ6З см-1 является частью спектра нуклеозидтрифосфатов (аденозинтри-фосфата (АТФ), гуанозинтрифосфата (ГТФ), уридинтрифосфата (УТФ), инозинтрифосфата (ИТФ), тимидинтрифосфата (ТТФ)), так как содержание именно нуклеозидтрифосфатов
снижается при патологических процессах в организме, при одновременном накоплении монофосфатов в плазме крови. Увеличение параметра Y в контрольной группе по сравнению со здоровыми животными, возможно, объясняется уменьшением интенсивности полосы поглощения при 1080 см-1, которую на данном этапе исследований отнести к какому-либо определенному фосфорсодержащему соединению не представляется возможным. В опытных группах наблюдается снижение концентрации нуклеозидтрифосфатов, т.е. происходит нормализация их уровня в плазме крови животных-опухоленосителей.
В данном исследовании установлено достоверное изменение параметра Z: снижение данного параметра при введении ДР и озона и увеличение - при введении комплекса озона и ДР. Авторами данного сообщения предполагается, что полоса поглощения при 1070 см-1 является частью спектра монофосфатов (адено-зинмонофосфата - АМФ, гуанозинмонофосфата
- ГМФ и др.), так как содержание именно нук-леозидмонофосфатов увеличивается при нарушении энергетического обмена. Таким образом, введение озона и ДР способствует накоплению монофосфатов в плазме крови жи-вотных-опухоленосителей. Точный механизм действия противоопухолевого действия ДР остается неясным. Предполагается, что основные механизмы противоопухолевого действия ДР связаны с индукцией апоптической гибели опухолевых клеток, а также данный механизм может быть обусловлен способностью ДР связываться с липидами клеточных мембран, образовывать в клетках свободные радикалы [10]. В результате этого происходит разрушение мембран, сопровождающееся накоплением нуклеозидмонофосфатов. Увеличение уровня монофосфатов в плазме при введении озона, возможно, связано со способностью озона взаимодействовать с -С=С-связями органиче-
ских соединений и катионами щелочных и щелочноземельных металлов, содержащихся в плазме крови и во внеклеточной жидкости, поддерживающих осмотическое давление и поляризацию клеточных мембран. Продуктами такого взаимодействия являются озониды [11], способные к разрушению клеточных мембран, сопровождающемуся увеличением концентрации монофосфатов. Этот факт нашел подтверждение в исследованиях Перетягина С.П. [12], когда при озонолизе цельной крови было установлено значимое увеличение концентрации АМФ в эритроцитах. В то же время автор установил снижение уровня АТФ, связанного с усилением работы мембранных АТФ-аз, обеспечивающих процессы окислительного дефосфорилирования в клетке. Совместное применение озона и ДР способствует резкому снижению концентрации монофосфатов, а значит способствует стабилизации клеточных мембран, снижает их разрушение при неоплазии. На основании разработанного исследователями Канзасского университета подхода к повышению избирательности существующих химиотерапевтических веществ можно предположить, что усиление противоопухолевого эффекта может быть также обусловлено способностью озона защелачивать среду [13]. По мнению Крайза, метод заключается в придании молекулам химиопрепаратов «основных» (щелочных) свойств. Здоровые клетки не пропускают щелочные соединения через клеточную мембрану; в отличие от них, в силу повышенной кислотности внутриклеточной среды, злокачественные клетки активно поглощают молекулы, обладающие основными свойствами, и в полной мере испытывают на себе оказываемый ими токсический эффект. Таким образом, введение совместно с ДР озонокислородной смеси, способность которой к за-щелачиванию среды доказана также работами Перетягина С.П. [12], может быть одним из механизмов не только усиления противоопухолевого эффекта, но и защиты нормальных тканей организма от токсического действия цитостати-ков, в связи с чем происходит нормализация основных метаболических показателей опухо-леносителя.
В рабочем атласе А. Нормана показано, что полосе поглощения при 1125 см-1 соответствует глюкоза [14]. Введение озона, ДР и их совместного комплекса способствует уменьшению концентрации в плазме крови глюкозы по сравнению с контролем, т.е. нормализации её концентрации. Таким образом, применение исследуемых веществ приводит к ослаблению системного действия злокачественного новообразования на организм хозяина, сопровождающе-
муся нормализацией уровня глюкозы, возможно, в результате индуцирования пероксидами каскада реакций, которые приводят в действие пентозофосфатный шунт, способствующий восстановлению процессов гликолиза и нормализации метаболизма глюкозы.
Заключение
Введение исследуемых веществ, а именно ОФР (с дозой озона 20 мкг на особь, 6 процедур через день), ДР (в дозе 0.04 мг на особь, 5 процедур через день), комплекса ОФР+ДР (6 и 5 инъекций соответственно, через день), животным с РМК-1 изменяет параметры ИК-спектров плазмы крови экспериментальных животных. При этом, введение ОФР совместно с цитоста-тическим средством прекращает дезорганизацию обмена веществ организма, вызванную ростом злокачественного новообразования, нормализуя соотношение нуклеозидтри(моно)фос-форных кислот, уровень глюкозы, в то время как проведение монохимиотерапевтического воздействия, по данным ИК-спектров, оказывало менее корригирующее влияние на метаболические процессы.
Список литературы
1. Гордецов А.С. Инфракрасная спектроскопия биологических жидкостей и тканей // Современные технологии в медицине. 2010. № 1. С. 84-98.
2. Гордецов А.С. Диагностическая ИК-спектрос-копия. Настоящее и будущее // Нижегородский медицинский журнал. 2002. № 4. С. 95-98.
3. Лифшиц В.М., Сидельникова В.И. Медицинские лабораторные анализы. Справочник. М: Триада-Х, 2000. 312 с.
4. Балаховский И.С. Инфракрасная спектроскопия в клинической лабораторной диагностике // Клиническая лабораторная диагностика. 1995. № 4.
С. 24-29.
5. Игнатьев А.А., Лаврова О.Л., Насонов С.В.,
Веселова О.Н. и др. Способ диагностики рака молочной железы. Патент № 2249216 РФ, МПК
А61В10/00. 2005.
6. Аксель Е.М., Двойрин В.В. Статистика злокачественных новообразований: заболеваемость, смертность, тенденции, социально-экономический ущерб, продолжительность жизни. М.: Изд-во ВОНЦ, 1992. 122 с.
7. Чисова В.И. Онкология. М: ГЭОТАР-Медиа, 2006. 701 с.
8. Щербатюк Т.Г. Современное состояние озоно-терапии в медицине. Перспективы примения в онкологии // Современные технологии в медицине. 2010. № 1. С. 99-106.
9. Алясова А.В., Конторщикова К.Н. Озонотера-пия в онкологической клинике // Нижегородский медицинский журнал. 2006. № 4. С. 69-74.
10. Карасева В.В. Противоопухолевые препараты. // Практическая онкология. 1996. № 5. С. 45-47.
11. Большая российская энциклопедия / Под ред. А.М. Прохорова. М.: Советская энциклопедия, 1992. Т. 3. С. 658-659.
12. Перетягин С.П. Патофизиологическое обоснование озонотерапии постгеморрагического перио-
да. Автореферат. ... дис. д-ра мед. наук. Казань, 1991. 30 с.
13. Клинцова Е.С. Исследование эффективности озона, 5-фторурацила и доксорубицина в терапии экспериментальных опухолей. Дис. ... канд. биол. наук. Старая Купавна, 2007. 147 с.
14. Norman A. Working atlas of infrared spectroscopy. Boston: SPIE, 1978. Р. 73.
THE CHANGE IN PARAMETERS OF BLOOD PLASMA IR SPECTRA OF TUMOUR-BEARING ANIMALS ON THE BACKGROUND OF DOXORUBICIN AND OZONE COMPLEX ADMINISTRATION
O. V. Krasnikova, A.S. Gordetsov, K.N. Kontorshchikova, V.N. Krylov, A.I. Sazanov
A correlation is sought between the parameters of blood plasma IR spectra of tumour-bearing animals and the concentration of some phosphorus-containing metabolites on the background of doxorubicin and ozone complex administration.
Keywords: infrared spectroscopy, breast cancer, doxorubicin, ozonated saline.
