CC BY
69
ИЗМЕНЕНИЕ пАрАМЕТро!
биологических тканей животных-опухолЕноситЕЯЕ! на фоне совместного введения доксорубицина и озона
УДК 591.2—006—073.584:612.014.464 Поступила 21.03.2011 г.
О.В. Красникова, аспирант кафедры физиологии и биохимии человека и животных1;
A.С. Гордецов, д.х.н., профессор, зав. кафедрой общей химии2;
К.Н. Конторщикова, д.б.н., профессор, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики2;
B.Н. Крылов, д.б.н., профессор, зав. кафедрой физиологии и биохимии человека и животных1;
А.И. Сазанов, аспирант кафедры клинической лабораторной диагностики2
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского — Национальный исследовательский университет,
Н. Новгород;
Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород
Цель исследования — поиск корреляционной зависимости параметров инфракрасных (ИК) спектров биологических тканей жи-вотных-опухоленосителей от изменения концентраций некоторых фосфорсодержащих метаболитов на фоне комплексного введения озона и доксорубицина (ДР).
Материалы и методы. Экспериментальным животным — белым нелинейным крысам-самкам (n=45) со штаммом опухоли РМК-1 (рак молочной железы) внутрибрюшинно вводили озонированный физиологический раствор (ОФР) (с дозой озона 20 мкг на особь, 6 процедур через день), чередуя его с введением ДР (в дозе 0,04 мг на особь, 5 процедур через день). Животных включали в эксперимент на 45-е сутки после перевивки опухоли.
Исследование проводили с помощью метода ИК-спектроскопии биологических тканей.
Заключение. Введение ОФР, ДР, комплекса ДР+ОФР животным со штаммом опухоли РМК-1 изменяет параметры ИК-спектров печени, почек, легких, мозга, опухоли этих животных. Комплекс ДР+ОФР обладает более высоким терапевтическим эффектом в отличие от монохимиотерапии. Следовательно, озон можно рассматривать как химический агент, модифицирующий действие цитотического вещества и усиливающий поражение опухолевых клеток, что подчеркивает целесообразность проведения химиотерапии совместно с озонотерапией.
Ключевые слова: инфракрасная спектроскопия, рак молочной железы, доксорубицин, озонированный физиологический раствор.
English
The change of infrared spectrum parameters of biological tissues of animals-carriers of tumours against the background of combined administration of doxorubicin and ozone
О.V. Krasnikova, Postgraduate, the Department of Human and Animal Physiology and Biochemistry1;
As. Gordetsov, D.Ch.Sc., Professor, Head of the Department of General Chemistry2;
K.N. Kontorstchikova, D.Bio.Sc., Professor, Head of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics2;
V.N. Krylov, D.Bio.Sc., Professor, Head of the Department of Human and Animal Physiology and Biochemistry1;
M sazanov, Postgraduate, the Department of Clinical Laboratory Diagnostics2
1Nizhny Novgorod State University named after N.I. Lobachevsky — National Research University, Nizhny Novgorod;
2Nizhny Novgorod State Medical Academy, Nizhny Novgorod
The aim of the study is the search of correlation dependence of infrared (IR) parameters of biological tissues of animals-carriers of tumours on concentration changes of some phosphorus-containing metabolites against the background of complex administration of ozone and doxorubicin (DR).
Для контактов: Красникова Ольга Владимировна, тел. моб. +7 908-165-72-88; e-mail: [email protected].
Materials and methods. Experimental animals, white non-pedigree female rats (n=45), with tumour strain BC-1 (breast cancer) were administered intraperitoneal introduction of ozonized physiological saline (OPS) (ozone dose: 20 mg per an animal, 6 procedures every other day) interchanging it with DR administration (dosage: 0.04 mg per an animal, 5 procedures every other day). The animals were involved into the experiment on the 45th day after tumour subinoculation.
The research was carried out using the technique of IR-spectroscopy of biological tissues.
Conclusion. The administration of OPS, DR and OPS+DR complex to the animals with tumour strain BC-1 changes the parameters of IR spectra of the liver, kidneys, lungs, brain, tumour of these animals. OPS+DR complex has higher therapeutic effect compared to monochemotherapy. Therefore, ozone can be considered as a chemical agent modifying the cellular element action and enhancing tumour cells damage that emphasizes the feasibility of chemotherapy performed in combination with ozone therapy.
Kew words: infrared spectroscopy, breast cancer, doxorubicin, ozonized physiological saline.
Метод инфракрасной (ИК) спектроскопии широко используется в экспериментальной органической химии с середины прошлого века. Однако в клинической лабораторной диагностике он практически не применяется в связи с необычайной сложностью состава и строения биологических структур. В настоящее время известно лишь сравнительно небольшое количество научных работ, посвященных целенаправленному изучению ИК-спектров биологических жидкостей и тканей [1]. Вместе с тем метод ИК-спектроскопии может быть использован не только для идентификации отдельных химических соединений в сложных смесях, но и для оценки эффективности терапевтического воздействия лекарственных средств, озона или их комплексного применения [2]. Поскольку современные виды химических препаратов и особенно озон активно влияют на энергетические процессы в организме [3], изучение ИК-спектров биоптатов тканей в области поглощения фосфор-кислородных связей, содержащихся в макро-эргических соединениях, фосфорилированных белках, фосфолипидах и других фосфатах [1], приобретает большое значение.
Цель исследования — поиск корреляционной зависимости параметров ИК-спектров биологических тканей животных-опухоленосителей от изменения концентраций некоторых фосфорсодержащих метаболитов на фоне комплексного введения озона и док-сорубицина.
Материалы и методы. Экспериментальная часть исследования выполнена на лабораторных животных — белых нелинейных крысах-самках (75 особей) массой 200±10 г. Эксперимент проводился в соответствии с требованиями нормативных правовых актов, регламентирующих выполнение исследований по безопасности и эффективности фармакологических веществ в РФ (Приказ МЗ РФ «Об утверждении правил лабораторной практики» №267 от 19.06.2003 г.), и международных правовых и этических норм использования животных.
Модель неоплазии создавали путем перевивки опухолевого штамма рака молочной железы крысы (РМК-1), приобретенного в Онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). Кусочки опухолевой ткани (диаметром 1 мм) с физиологическим раствором (0,5 мл) вводили подкожно в область правой подмышечной впадины крысе-реципиенту. Животных включали в эксперимент на 45-е сутки после
перевивки опухоли, объем которой к этому времени достигал 6—8 см3.
Животные были разделены на 5 групп по 15 особей в каждой:
1-я группа (интактная) — здоровые животные;
2-я группа (контрольная) — крысы с неоплазией, не подвергавшиеся каким-либо лечебным воздействиям;
3-я группа (опытная 1) — крысы с неоплазией, получавшие в качестве лечебного средства химиопрепарат доксорубицин (ДР) в дозе 0,04 мг на особь через день, всего 5 процедур; препарат вводился внутри-брюшинно;
4-я группа (опытная 2) — крысы с неоплазией, которым внутрибрюшинно вводили озонированный физиологический раствор (ОФР) в объеме 0,02 мл с дозой озона 20 мкг, всего выполнялось 6 процедур через день;
5-я группа (опытная 3) — крысы с неоплазией, которым вводили внутрибрюшинно через день 5 доз ДР и 6 инъекций ОФР.
ОФР получали барботированием 0,9% NaCl озо-но-кислородной смесью с использованием серийного отечественного генератора озона фирмы «Квазар» (Н. Новгород). Концентрацию озона в физиологическом растворе определяли с помощью серийного отечественного анализатора концентраций «ИКОЖ-5» (ОАО «Электромашиностроительный завод Лепсе», г. Киров).
На 11-е сутки после начала эксперимента под эфирным наркозом осуществляли декапитацию животных и забор тканей: печени, почек, легких, мозга, опухолей.
Исследование проводили с помощью метода ИК-спектроскопии. Для обезвоживания тканей применяли диметилформамид (ДМФА) [4]. Кусочек каждой ткани в количестве 0,05—0,5 г помещали в пробирку с 2 мл ДМФА, нагревали на водяной бане при 100—140°С в течение 1—2 ч, удаляли растворитель, промывали образцы диэтиловым эфиром, высушивали на воздухе при комнатной температуре, снимали ИК-спектры поглощения в области 1170—1025 см-1 на спектрофотометре Specord 75 ^, в виде суспензии с вазелиновым маслом в окошках из ZnSe. За спектроскопические параметры принимали частные, полученные в результате деления высот пиков полос поглощения друг на друга: Х=1125/1100, Y=1165/1080, Z=1080/1070 [5]. Для оценки параметров ИК-спектра выбраны относительные условные единицы (отн. усл. ед.).
Полученные данные обработаны с помощью пакетов
84 СТМ J 2011 - 3 О.В. Красникова, А.С. Гордецов, К.Н. Конторщикова, В.Н. Крылов, А.И. Сазанов
прикладных программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel с использованием методов одномерной статистики.
Результаты представлены в виде М±т, где М — среднее арифметическое, m — стандартное отклонение. Достоверность различий средних значений определяли по t-критерию Стьюдента. Выборки считались принадлежащими к разным генеральным совокупностям при p<0,05.
Результаты и обсуждение. В ходе исследования были изучены параметры ИК-спектров печени, почек, легких, мозга, опухолей крыс-опухоленосителей на фоне введения ОФР (с дозой озона 20 мкг на особь, 6 процедур через день), ДР (в дозе 0,04 мг на особь, 5 процедур через день), комплекса ОФР+ДР (6 и 5 инъекций соответственно через день) (табл. 1—5).
Расчет параметров ИК-спектров печени (табл. 1) показал, что значения параметров X1, Y1 в контрольной группе статистически значимо (р^0,05) выше по сравнению с группой здоровых животных, а параметра Z1 — ниже. Введение исследуемых препаратов снижает параметры X1, Y1 и приводит к повышению параметра Z1. В рабочем атласе А. Norman (1978) показано, что полосе поглощения при 1125 см-1 соответствует глюкоза [6]. Таким образом, введение исследуемых веществ способствует уменьшению концентрации в печени глюкозы по сравнению с контролем, приближая ее к показателям нормы.
Известно, что в печени глюкоза окисляется по пен-тозофосфатному пути превращения, обеспечивающего клетки рибозой для синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов [7]. Высокая концентрация глюкозы в печени животных контрольной группы приводит к увеличению выработки этих нуклеотидов, необходимых для синтеза макроэргических соединений, чем, возможно, и объясняется повышение параметра Y1 по отношению к здоровым животным. Предполагается, что полоса поглощения при 1165 см-1 является частью спектра нуклеозидтрифосфатов (аденозинтрифос-фата — АТФ, гуанозинтрифосфата — ГТФ, уридин-трифосфата — УТФ, инозинтрифосфата — ИТФ, тимидинтрифосфата — ТТФ), так как содержание именно нуклеозидтрифосфатов снижается на фоне патологических процессов в организме при одновременном накоплении монофосфатов в плазме. Увеличение
Таблица 1
Значения параметров Х1, Y1, Z1 ИК-спектров печени экспериментальных животных на фоне введения ДР,
ОФР, ДР+ОФР, отн. усл. ед.
* — различия статистически значимы по сравнению с группой интактных животных (р^0,05); ** — по сравнению с группой контрольных животных (р^0,05).
Таблица 2
Значения параметров Х2, У2, Z2 ИК-спектров почек экспериментальных животных на фоне введения ДР, ОФР, ДР+ОФР, отн. усл. ед.
Группы О О ю сч >< О 00 о ю со О г«' О О ОО о inT
Интактная 0,50±0,04 0,88±0,01 0,59±0,01
Контрольная 0,75±0,03* 0,60±0,12* 0,75±0,02*
Опытная 1 0,89±0,01** 2,16±0,02** 0,58±0,01**
Опытная 2 0,22±0,02** 0,09±0,01** 1,11±0,01**
Опытная 3 0,33±0,02** 0,91±0,01** 0,86±0,02**
* — различия статистически значимы по сравнению с группой интактных животных (р^0,05); ** — по сравнению с группой контрольных животных (р^0,05).
параметра Y1 в контрольной группе по сравнению со здоровыми животными, возможно, объясняется также уменьшением интенсивности полосы поглощения при 1080 см-1, которую на данном этапе исследований отнести к какому-либо определенному фосфорсодержащему соединению не представляется возможным. Логично также предположить, что полоса поглощения при 1070 см-1 является частью спектра монофосфатов (аденозинмонофосфата — АМФ, гуанозинмонофос-фата — ГМФ и др.), так как содержание именно нук-леозидмонофосфатов увеличивается при нарушении энергетического обмена. Как видно из табл. 1, параметр Z1 в контрольной группе уменьшается, а значит, уменьшается частное от деления высоты пика поглощения при 1080 см-1 на высоту пика при 1070 см-1, т.е. содержание монофосфатов возрастает. Введение комплекса препаратов ДР+ОФР максимально приближает параметр Y1 к показателю нормы, и содержание монофосфатов в клетках печени значительно уменьшается. Эффект ОФР на фоне цитостатического воздействия на метаболизм клеток печени, по всей видимости, обусловлен влиянием озона и его радикальных форм, образующихся в физиологическом растворе, на обменные процессы в организме и опосредованно — на метаболические показатели клеток печени. Возможно также непосредственное воздействие на клетки печени радикальных форм озона, образующихся в растворе, и продуктов озонолиза. Существует мнение, что пероксиды — наиболее вероятные молекулы трансдукции сигнала озона на метаболизм клеток других органов при его системном влиянии на организм [8]. Также показан корригирующий эффект ОФР на функциональные изменения в клетках печени крыс-опухоленосите-лей на модели «саркома-45» [9]. Установлено, что под действием ОФР происходит нормализация содержания общих липидов, свободных жирных кислот в печени животных, а также возрастает уровень АМФ, АДФ в клетках печени крыс. Есть данные [10], что применение для оксигенации крови собак ОФР в процессе длительного исскуственного кровообращения благоприятно влияет на состояние сосудистой стенки, снижая глубину нарушения микроциркуляции в печени.
Анализ ИК-спектров почек крыс показал, что значения параметров Х2, Z2 в контрольной группе статисти-
Группы X, (1125/1100) Y1 (1165/1080) Z1 (1080/1070)
Интактная 0,86±0,02 0,26±0,01 0,70±0,02
Контрольная 1,55±0,03* 0,67±0,02* 0,65±0,01*
Опытная 1 0,92±0,01** 0,57±0,02** 0,93±0,01**
Опытная 2 0,63±0,02** 0,52±0,01** 0,69±0,01**
Опытная 3 0,41±0,03** 0,34±0,01** 1,01±0,03**
чески значимо выше (р^0,05), а параметра Y2 — ниже (р^0,05) по сравнению с группой здоровых животных. Таким образом, уровень глюкозы в почках животных-опухоленосителей достоверно выше нормы при одновременном снижении уровня нуклеозидтрифосфатов и повышении монофосфатов. Введение исследуемых препаратов влияет на изменение параметров неоднозначно: ДР увеличивает параметры Х2, Y2, а ОФР их резко снижает. Комплекс ДР+ОФР максимально приближает параметры Х2, Y2 к значениям нормы. ОФР и комплекс ДР+ОФР способствуют снижению уровня монофосфатов в почках животных с окислительным стрессом, улучшая оксигенацию ткани, и обеспечивают стабилизацию клеточных мембран.
Значения параметров Х3, Y3, Z3 в ИК-спектрах мозга животных (табл. 3) в контрольной группе статистически значимо (р^0,05) выше по сравнению с группой здоровых животных. Это значит, что у животных с неоплази-ей концентрация глюкозы и нуклеозидтрифосфатов в мозге выше, чем их концентрация у здоровых организмов, при одновременном снижении уровня АМФ, ГМФ и других. Это объясняется тем, что высока скорость потребления головным мозгом глюкозы и кислорода, сопряженного с интенсивным образованием макроэр-гических соединений [11]. В целом соотношение адени-новых нуклеотидов в тканях мозга и печени примерно одинаково. Введение комплекса ДР+ОФР максималь-
Таблица 3
Значения параметров Х3, У3, Z3 ИК-спектров мозга экспериментальных животных на фоне введения ДР, ОФР, ДР+ОФР, отн. усл. ед.
Группы 2 № О О у 6 № О СО О ОО О О 00 О м
Интактная 0,10±0,07 0,26±0,01 0,59±0,03
Контрольная 0,60±0,13* 0,30±0,02* 0,71±0,02*
Опытная 1 0,45±0,02** 0,19±0,02** 0,65±0,01**
Опытная 2 0,94±0,10** 0,26±0,01** 0,64±0,01**
Опытная 3 0,40±0,03** 0,24±0,02** 0,91±0,05**
* — различия статистически значимы по сравнению с группой интактных животных (р^0,05); ** — по сравнению с группой контрольных животных (р^0,05).
Таблица 4
Значения параметров Х4, У4, Z4 ИК-спектров легких экспериментальных животных на фоне введения ДР, ОФР, ДР+ОФР, отн. усл. ед.
Группы Х4 (1125/1100) У4 (1165/1080) Z4 (1080/1070)
Интактная 1,44±0,02 0,51±0,02 0,65±0,01
Контрольная 2,17±0,10* 0,67±0,02* 0,51±0,02*
Опытная 1 0,33±0,01** 0,46±0,02** 0,67±0,01**
Опытная 2 1,00±0,11** 0,39±0,01** 0,78±0,02**
Опытная 3 0,30±0,02** 0,30±0,02** 1,02±0,10**
* — различия статистически значимы по сравнению с группой интактных животных (р^0,05); ** — по сравнению с группой контрольных животных (р^0,05).
Таблица 5
Значения параметров Х5, У5, Z5 ИК-спектров опухолей экспериментальных животных на фоне введения ДР, ОФР, ДР+ОФР, отн. усл. ед.
Группы Х5 (1125/1100) уУ 6 / 0 со ) Z5 (1080/1070)
Контрольная 0,97±0,03 0,63±0,02 0,74±0,02
Опытная 1 0,88±0,01* 0,73±0,02* 0,50±0,01*
Опытная 2 0,92±0,02* 0,38±0,01* 0,89±0,01*
Опытная 3 0,81±0,03* 0,48±0,01* 0,74±0,01*
* — различия статистически значимы по сравнению с группой контрольных животных (р^0,05).
но приближает параметры Х3, Y3 к значениям нормы, способствует снижению уровня монофосфатов в мозге животных с неоплазией.
Значения параметров Х4, Y4 ИК-спектров легких (табл. 4) в контрольной группе статистически значимо (р^0,05) выше, а параметра Z4 — ниже (р^0,05) по сравнению с группой здоровых животных, а значит, у животных-опухоленосителей концентрация глюкозы и нуклеозидтрифосфатов в легких выше, чем их концентрация у здоровых животных, при одновременном увеличении уровня АМФ, ГМФ. Введение исследуемых препаратов снижает параметры Х4, Y4 и увеличивает параметр Z4. Таким образом, ОФР способствует нормализации уровня глюкозы в ткани легких животных с онкогенезом, введение ДР нормализует уровень нуклеозидтрифосфатов; ДР+ОФР уменьшает концентрацию монофосфатов.
Введение исследуемых препаратов снижает параметр Х5 ИК-спектров опухоли (табл. 5), параметр Y5 увеличивается при введении ДР и уменьшается при введении ОФР, ДР+ОФР; параметр Z5 снижается при введении ДР, увеличивается при ОФР и не меняется при введении комплекса ДР+ОФР. Таким образом, вводимые препараты уменьшают уровень глюкозы в опухолевой ткани; ОФР, ДР+ОФР снижают уровень нуклеозидтрифосфатов; ДР приводит к увеличению АМФ, ГМФ в опухоли, тем самым нарушая энергетический обмен опухолевой ткани, разрушая ее структуру, что было также показано в работе [12]. Наличие нарушения нормальных биоэнергетических процессов в раковой клетке влечет за собой глубокие повреждения во всех звеньях обмена веществ. Возникающие продукты метаболизма раковых клеток, являющиеся для организма патологическими, существенным образом влияют на состояние обмена веществ в органах и тканях животных — носителей опухоли, непосредственно не поврежденных раковыми клетками, что и было установлено в данном исследовании. Противогипоксичес-кое действие озона увеличивает поступление химиотерапевтического вещества к опухолевым клеткам.
Заключение. Введение озонированного физиологического раствора с дозой озона 20 мкг на особь, 6 процедур через день, доксорубицина в дозе 0,04 мг на особь, 5 процедур через день, комплекса ДР+ОФР — 6 и 5 инъекций соответственно, через день, животным со штаммом опухоли РМК-1 изменяет параметры ИК-
86 СТМ | 2011 - 3 О.В. Красникова, А.С. Гордецов, К.Н. Конторщикова, В.Н. Крылов, А.И. Сазанов
спектров печени, почек, легких, мозга, опухоли этих животных. Комплекс ДР+ОФР обладает высоким терапевтическим эффектом в отличие от монохимиотерапии. Следовательно, озон можно рассматривать как химический агент, модифицирующий действие цитоти-ческого вещества и усиливающий поражение опухолевых клеток, что подчеркивает целесообразность проведения химиотерапии совместно с озонотерапией.
Литература
1. Гордецов А.С. Инфракрасная спектроскопия биологических жидкостей и тканей. Соврем технол мед 2010; 1: 84—98.
2. Гордецов А.С. Диагностическая ИК-спектроскопия. Настоящее и будущее. Нижегородский мед журнал 2002; 4: 95—98.
3. Щербатюк Т.Г. Современное состояние озонотерапии в медицине. Перспективы примения в онкологии. Соврем технол мед 2010; 1: 99—106.
4. Кукош В.И., Гордецов А.С, Скобелева С.Е., Павлова Е.К., Учугина А.Ф., Латяева В.Н., Мамаев Ю.П., Дергунов Ю.И. Способ подготовки биоптата для регистрации инфракрасных спектров при диагностике рака легкого. Патент №1803990 РФ, МПК 61 В10/00, G01N33/48. 1994.
5. Игнатьев А.А, Лаврова О.Л., Насонов С.В., Веселова О.Н., Веселова Ю.В., Терентьев И.Г., Буланов Г.А., Гордецов А.С, Петров А.Б., Фатыхов Р.Р. Способ диагностики рака молочной железы. Патент РФ №2249216 РФ, МПК A61B10/00. 2005.
6. Norman A. Working atlas of infrared spectroscopi. Boston; 1978; 73 p.
7. Северин Е.С., Алейников Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия. М: Медицина; 2000; 168 с.
8. Карева Н.Н. Нарушения антиоксидантного статуса у больных лимфомами и возможности его коррекции. Бюллетень СО РАМН 2005; 3: 30—33.
9. Клинцова Е.С. Исследование эффективности озона,
5-фторурацила и доксорубицина в терапии экспериментальных опухолей. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Старая Купавна; 2007.
10. Алехина С.П. Озонотерапия: клинические и экспериментальные аспекты. Н. Новгород: Литера; 2003; 240 с.
11. Ашмарин И.П., Антипенко А.Е., Ашапкин В.В. Нейрохимия. М: Медицина; 2001; 153 с.
12. Алясова А.В., Конторщикова К.Н., Терентьев И.Г., Иванова И.П., Кузнецов С.С., Сазанов А.И. Влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на терапевтический патоморфоз опухоли в эксперименте. Соврем технол мед 2010; 4: 27—32.
