CC BY
30
УДК 616.12-008.331.1-085.225.5:546.172.6-31:611.018.834
ИЗМЕНЕНИЕ NO-ЕРГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙРОНОВ МОЗГОВОГО ВЕЩЕСТВА НАДПОЧЕЧНИКОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ И ЕЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ
Екатерина Валерьевна Елисеева1, Инесса Валерьевна Дюйзен2, Анна Владимировна Тыртышникова1, Елена Филипповна Романченко1
1ГОУ ВПО Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава 690002, г. Владивосток, пр. Острякова, 2
Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН 690041, г. Владивосток, ул. Пальчевского, 17
В условиях экспериментальной нефрогенной гипертензии у крыс исследована гистохимическая активность син-тазы оксида азота (NOS) в нейронах мозгового вещества надпочечников и установлена динамика активности фермента на фоне коррекции экспериментальной нефрогенной гипертензии ß-адреноблокаторами, ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), антагонистами кальциевых каналов. Предполагается наличие NO-ергического компонента в реализации фармакологических эффектов исследованных препаратов.
Ключевые слова: надпочечник, NO-синтаза, гипертензия, гипотензивные препараты.
Несмотря на наличие большого количества гипотензивных препаратов различных классов, лечение артериальной гипертензии (АГ) остается трудной задачей, что обусловлено многообразием патофизиологических механизмов, участвующих в повышении артериального давления (АД). Одним из важнейших патогенетических звеньев в развитии АГ и формировании ее осложнений (включая структурное ремоделирование сердечнососудистой системы) является увеличение тонуса симпатоадреналовой системы [1, 2].
Открытие биологического роли оксида азота (NO) в нейрогенной, гуморальной и эндотелиальной регуляции АД предоставило широкие возможности для разработки новых подходов к фармакологической коррекции гипертензивного синдрома. Известно, что взаимодействие симпатоадреналовой и NO-ергической систем на разных уровнях нейроэндокринного контроля АД имеет специфические черты и может проявляться развитием как антагонистических, так и синергических модулирующих эффектов. Известно, например, что в катехолами-нергических ядрах гипоталамуса, нейронах голубоватого пятна и каудальных отделов продолговатого мозга животных с синдромом артериальной гипертензии происходит активация синтеза NO; при этом ингибиторы нейрональной NOS, угнетая активность центров нейрогенного контроля АД, способствуют развитию гипотензивного эффекта [3]. Активность нейрональной NOS кардиомиоцитов потенцирует развитие p-адренергических эффек-
тов на сердце [4]. В то же время повышение АД неизменно сопровождается снижением активности NOS в эндотелии сосудов, что и определяет выраженный антигипертензивный эффект доноров или предшественников синтеза NO [5]. Механизмы влияния NO на ткань мозгового вещества надпочечников при гипертензии и проведении гипотензивной терапии до настоящего времени остаются малоизученным и противоречивыми и касаются, в основном, анализа его ингибиторных [6] либо активирующих [7] эффектов в моделях in vitro.
В настоящем исследовании для уточнения роли адреномедуллярного NO при гипертензии и развитии антигипертензивных эффектов препаратов была использована экспериментальная модель реноприв-ной гипертензии. С помощью гистохимической реакции на NADPH-диафоразу у экспериментальных животных была изучена динамика активности NO-синтазы в нейронах мозгового вещества надпочечников при АГ и при использовании препаратов следующих групп: ингибиторов АПФ, р-блокаторов и антагонистов кальциевых каналов.
Материал и методы
Учитывая этический аспект производимого экспериментального исследования, мы пытались максимально сократить количество используемых в эксперименте животных, оставаясь в рамках статистически репрезентативной группы. При этом было одномоментное изучение всех органов-мишеней, которые вовлечены при формировании АГ, что устраняло необходимость повторного проведения
Елисеева Е.В. — д.м.н., проф. кафедры общей и клинической фармакологии, e-mail: [email protected].
Дюйзен И.В. — д.м.н., проф., ст.н.с. лаборатории фармакологии, e-mail: [email protected]
Тыртышникова А.В. — ассистент кафедры общей и клинической фармакологии, e-mail: [email protected] Романченко Е.Ф. — ассистент кафедры общей и клинической фармакологии, e-mail: [email protected]
эксперимента. В данной статье рассматривается только фрагмент всей экспериментальной работы.
Исследование выполнено на 80 белых нелинейных крысах-самцах массой 200—220 г в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977) и Стандартом отрасли «Правила проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации» ОСТ 42-511-99 (утв. МЗ РФ 29.12.1998). Животных содержали в виварии в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальнобиологических клиник» (от 06.04.1993), кормили в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР от 10.03.1996 № 163.
Всем животным экспериментальных групп формировали модель нефрогенной гипертензии путем введения 0,1 мл 10% раствора формалина в передний полюс правой и левой почек [8]. Преимуществами модели являются простота выполнения (не требует тяжелой полостной операции, как предусматривается при удалении почки или перевязке аорты или почечных артерий) и постепенность повышения АД, приводящего к структурным, функциональным и патологическим изменениям органов-мишеней. Систолическое АД у крыс контрольной группы до операции составляло 120 ± 3,7 мм рт.ст., к концу 1 недели — 128 ± 3,4 мм рт.ст., через 2 недели — 156 ± 2,7 мм рт. ст., через 4 недели — 181 ± 5,2мм рт.ст. и сохранялось на высоком уровне до 8 недели эксперимента. Измерение АД у экспериментальных животных проводили ежедневно в утренние часы с помощью устройства для неинвазивного мониторинга АД Medlab —U/4c 501 (Китай).
В 1 группу были включены животные (группа АГ), не получавшие лекарственных препаратов. Начиная с 28 дня после операции, животным 2—4 групп проводили фармакологическую коррекцию: крысам 2 группы ежедневно вводили внутримышечно p-блокатор пропранолол (2 мг/кг), 3 группы — внутрибрюшинно ингибитор АПФ эналаприлат (0,3 мг/кг/6 часов), 4 группы — внутримышечно антагонист кальциевых каналов ве-рапамил (0,1 мг/кг). Животных выводили из эксперимента на 7, 14, 28 и 42 сутки после начала фармакологической коррекции (по 5 крыс в каждой точке). В качестве контроля использовали 5 ложнооперированных крыс, которым аналогичным способом в почки вводили физиологический раствор. Изучение состояния NOS проводилось на серийных продольных срезах надпочечников с помощью гистохимического метода, предложенного Hope [9]. Исследуемый материал в течение 4 часов фиксировали в охлажденном, приготовленный на
0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) 4% растворе параформальдегида, затем сутки промывали при той же температуре в 30% забуферном растворе сахаро-
зы. Из замороженных в криостате образцов изготавливали срезы надпочечников толщиной 25 мкм и помещали в среду, состав и конечная концентрация которой были следующими: 50 мМ трис-буфер (рН 8,0), 1 мМ NADPH (Sigma, США), 0,5 мМ ни-тросинего тетразолия (Sigma, США) и 0,2 % тритона Х-100 (ICN, США). Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37 °С, после чего срезы ополаскивали в дистиллированной воде, обезвоживали по стандартной методике и заключали в бальзам.
Количественную оценку плотности преципитата проводили с использованием видеокомпьютерной системы, смонтированной на микроденситометре Vickers М-85 (Vickers Instruments Ltd., UK). Цифровую обработку изображения проводили с помощью программ Adobe Photoshop 7.0 и Im-ageJ. Активность фермента выражали в условных единицах оптической плотности (ЕОП), плотность распределения гистохимически-позитивных структур выражали числом клеток на 5 мм2 ткани, число NADPH-d-позитивных нейронов — в % по отношению к общему числу нейронов в параллельных срезах, окрашенных по Нисслю.
Для статистической обработки результатов использовали пакеты прикладных программ Statis-tica 6.0 и Microsoft Excel 97. Анализ полученных данных проводили методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической величины (М) и среднеквадратического отклонения (а), относительной величины (Р), ошибки средних арифметических и относительных величин (m). Оценку значимости различий двух независимых и зависимых совокупностей выполняли с помощью критерия Стьюдента (t), показателя вероятности различий (p).
Результаты и обсуждение
Мозговое вещество надпочечников представляет собой нервный ганглий, в котором локализуются хромаффиноциты и локальные интернейроны. Хромаффинные клетки мозгового вещества синтезируют катехоламины — эпинефрин, норэпинеф-рин и дофамин, которые депонируются и выделяются в кровоток. Медуллярные интернейроны имеют различный химический фенотип и выполняют в ганглии модулирующую роль в отношении секреторной активности хромаффинных клеток и параметров внутриорганного кровотока [10].
В мозговом веществе надпочечников контрольных животных при постановке реакции на NADPH-диафоразу выявлялась небольшая популяция нервных клеток, одиночные или сгруппированные в пучки нервные волокна, единичные хромаффино-циты мозгового вещества, а также фрагменты ми-кроциркуляторного русла. Нейроны отличались от диафораза-позитивных хромаффинных клеток значительно более высоким уровнем гистохимической активности и мультиполярной формой клеточных тел, от которых отходили 2—5 первичных отростков. Плотность расположения нейронов в срезе площа-
дью 5 мм2 достигала 2,88 ± 0,21, что составляло 72 % от общего числа нейронов, окрашенных по Нисслю. Гистохимическая активность диафораза-позитивных клеток равнялась 101,88 ± 2,1 ЕОП.
При формировании экспериментальной рено-привной гипертензии (группа АГ) динамика активности КО-синтазы носила фазовый характер и проявлялась в изменении как числа позитивных нейронов, так и показателей их гистохимической активности (рис. 1). Наиболее выраженные изменения в состоянии фермента регистрировались к концу 1 недели эксперимента. В этот период у крыс группы АГ происходило статистически достоверное (р < 0,001) повышение активности КАОРН-диафоразы и числа КО-позитивных нейронов (до 95 % от общей популяции нейронов). Увеличение активности фермента в нейронах сопровождалось и активацией биосинтетических процессов в их отростках, которые в мозговом веществе животных с АГ формировали густую фибриллярную сеть. На препаратах не всегда удавалось проследить связь нервных волокон с телом нейрона, поэтому мы не исключали, что в состав КАОРН-ё-позитивного нейропиля входят не только локальные аксоны, но и проводники преганглионарных нейронов.
Начиная со 2 недели, число КО-позитивных нейронов постепенно уменьшалось. Максимального снижения количество КО-позитивных нейронов (в 2 раза по сравнению с контрольной группой) достигло в концу 4 недели развития гипертензии, показатели их гистохимической активности, приобретая тенденцию к снижению, оставались выше контрольного уровня. Параллельно с этим у экспериментальных животных были зафиксированы стабильно высокие показатели системного систолического АД — до 180 мм рт.ст.
Повторный всплеск КО-ергической активности адреномедуллярных нейронов был зафиксирован на 6 неделе эксперимента и сопровождался
увеличением численности КО-позитивных нейронов (до 4,0 ± 0,47) при сохранении близких к контрольному уровню значений их гистохимической активности.
Введение экспериментальным животным лекарственных препаратов, сопровождаясь развитием антигипертензивного эффекта, изменяло динамику биохимической реакции КО-ергических нейронов мозгового вещества надпочечников на развитие артериальной гипертензии. При этом КО-ергический «ответ» нейронов при использовании препаратов различных групп имел специфические черты, приводя к уменьшению числа КО-позитивных нейронов, их гистохимической активности или сочетанной реализацией обоих этих изменений. Так, у крыс 2 группы на первой неделе введения пропранолола наблюдалось статистически достоверное (р < 0,05) снижение количества КО-позитивных нейронов; одновременно уменьшалась и активность фермента по сравнению с крысами контрольной группы и животными группы АГ. В дальнейшем, на 4—6 неделе коррекции пропранололом активность КАОРН-диафоразы в КО-позитивных нейронах возрастала до 104,75 ± 5,02 ЕОП, хотя популяция активных клеток не превышала 29 % от общего числа интернейронов ганглия (рис. 2 а, б).
В группе животных, получающих эналаприлат, на 1—2 неделе коррекции количество КО-позитивных нейронов снизилось до 38 % от контрольных значений, уменьшилась и активность КАОРН-диафоразы в них. В дальнейшем, в течение 4—6 недель коррекции эналаприлатом, наблюдалось постепенное увеличение количества нейронов до 54 % и их активности до 92,01 ± 2,67 ЕОП (рис. 2 а, б).
Наиболее выраженное КО-ингибирующее действие было характерно для верапамила на 2 неделе его применения (рис. 2 а, б). В надпочечниках животных 4 группы в течение всего периода коррекции количество КАОРН-ё-позитивных нейро-
1 нед
8 нед
2 нед 4 нед 6 нед Контроль Артериальная гипертензия
Рис. 1. Динамика числа (Ш, левая шкала) и активности (---, правая шкала) КО-позитивных нейронов
мозгового вещества надпочечников крыс с моделью экспериментальной ренопривной гипертензии (** — отличие от контроля достоверно при р < 0,0001)
Рис. 2. Динамика количества NO-позитивнъх нейронов мозгового вещества надпочечников (а) и активности NOS в нейронах (б) у крыс с моделью экспериментальной гипертензии (—) и при введении препаратов гипотензивного действия эналаприла (---), пропранолола (■■■■), верапамила (-■-); отличие от соответствующего показателя в контроле достоверно: * — при р < 0,05, ** — при р < 0,0001; отличие от соответствующего показателя на 4 нед. гипертензии без фармакологической коррекции достоверно: + — при р < 0,05, ++ — при р < 0,0001
нов было примерно в 3 раза меньше контрольного уровня и в 2 раза меньше аналогичного показателя у животных с АГ на данном сроке наблюдения.
До настоящего времени в литературе нет единого мнения относительно направленности эффектов NO на синтез и высвобождение катехоламинов. Ряд исследователей обосновывают стимулирующее влияние самого NO, его доноров или предшественников на уровень продукции биогенных моноаминов в мозге [11], симпатических ганглиях [12] и надпочечниках [13]. Другие авторы подтверждают сим-патоингибирующее действие NO [14] либо вообще отрицают участие NO в модуляции хромаффинной ткани [15]. Такая неоднозначная ситуация, очевидно, определяется разными условиями проведения эксперимента, сроками наблюдения и выбором экспериментальной модели. Не исключено также, что ингибирующие эффекты NO реализуются при совместной локализации NOS и тирозингидроксилазы в одном нейроне [14] или под влиянием эндотелиальной NOS [4], в то время как симпатоактивирую-щее действие NO проявляется при его ретроградном или антероградном влиянии на мишень [11, 13].
По данным [15, 16], в мозговом веществе надпочечников NADPH-диафораза маркирует исключительно NOS-позитивные структуры, к числу которых относятся собственные медуллярные интернейроны и пресинаптические волокна. NO-ергические нервные элементы на наших препаратах богато иннервировали мозговое вещество надпочечников, формировали многочисленные варикозные утолщения на телах NADPH-d-негативных хромаффинных клеток. Это позволяло предполагать, что высвобождаемый ими NO принимал уча-
стие в модуляции секреторной активности катехо-ламинергических клеток в норме, при патологии и ее фармакологической коррекции.
В настоящем исследовании было установлено, что повышение АД у крыс с повреждением паренхимы почек сопровождается динамическими изменениями NO-ергической активности нейронов мозгового вещества надпочечников. В развитии изменений NO-ергической активности можно выделить три периода. Первая фаза повышения активности фермента, очевидно, определялась региональной травмой и сопровождалась увеличением как числа NADPH-d-позитивных нейронов, так и показателей их гистохимической активности. Ко второму периоду, длящемуся до конца 4 недели, когда происходило последовательное уменьшение обоих этих показателей, мы склонны относить развитие компенсаторной реакции со стороны нейромедиа-торных систем мозгового вещества надпочечников. В течение последующих 4 недель формирование ги-пертензивного синдрома сопровождалось активацией NO-ергической популяции медуллярных нейронов, хотя их гистохимическая активность сохраняла тенденцию к снижению. Наиболее выраженное торможение NO-ергической активности медуллярных интернейронов зафиксировано нами при использовании антигипертензивных препаратов. Все использованные в эксперименте средства из различных фармакологических групп ф-адреноблокаторы, ингибиторы АПФ и блокаторы Са-каналов) развивали антигипертензивное действие на фоне динамического, дифференцированного и селективного угнетения активности синтеза NO в этих клетках. В литературе антигипертензивные эффекты пре-
паратов связывают преимущественно с активацией синтеза NO в эндотелии сосудов [17]. Мы также наблюдали экспрессию NO-синтазы в артериях мышечного и эластического типа, а также в некоторых ядрах головного мозга при использовании данных препаратов (собственные неопубликованные данные). Не исключено поэтому, что описанные в настоящей работе эффекты обусловлены спецификой функционирования внутриклеточных сигнальных каскадов в нервной ткани мозгового вещества надпочечников или возникают вторично за счет изменения нейромедиаторного баланса в пресинаптиче-ских нервных цепях.
Заключение
При патологии сердечно-сосудистой системы большое значение имеют изменения метаболической активности клубочковой и пучковой зон коры надпочечников, а также клеток хромаффин-ной ткани мозгового вещества. В совокупности эти элементы, а также модулирующие их нейроэндокринные механизмы формируют сложную разветвленную систему регуляции артериального давления. В настоящей работе установлено, что развитие экспериментальной АГ сопровождается реакцией со стороны NO-ергических нейронов мозгового вещества надпочечников. Эти клетки, выполняя функции локальных интернейронов, модулируют биохимическую активность хромаффиноцитов и могут принимать участие в реализации гипотензивных эффектов. Результаты настоящего экспериментального исследования подтверждали это предположение. Таким образом, механизмы реализации NO-модулирующего эффекта препаратов различных групп, а также значение NO-ергического компонента в спектре их фармакологических эффектов нуждаются в дальнейшем изучении.
Список литературы
1. Шляхт о В.В., Конради А.О. Причины и последствия активации симпатической нервной системы при артериальной гипертензии // Consilium medicum. 2003. 9. (3). 464—468.
Shlyakhto V.V., Konradi A.O. Causes and consequences of sympathetic nervous system activation under arterial hypertension // Consilium medicum. 2003. 9. (3). 464-468.
2. Huang P.L. Mouse models of nitric oxide synthase deficiency // Am. Soc. Nephrol. 2000. 11. Suppl.
16. S120-S123.
3. Shaohua Ye., Nosrati S., Campese V.M. Nitric oxide (NO) modulates the neurogenic control of blood pressure in rats with chronic renal failure (CRF) // J. Clin. Invest. 1997. 99. 540-548.
4. Wang H., Kohr M.J., Wheeler D.G., Ziolo M.T. Endothelial nitric oxide synthase decreases p-adrenergic responsiveness via inhibition of the L-type Ca2+ current // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2008. 294. 1473-1480.
5. Keymel S., Malte K., Petra K. Nitric oxide in the vascular system: Meet a challenge // Bioengineering in Cell and Tissue Research. Eds. G.M. Artmann,
S. Chien. Springer, 2008. 18. 451-468.
6. Torres M., Ceballos G., Rubio R.P. Role of nitric oxide in catecholamine secretion by chromaffin cells in the presence and absence of cultured endothelial cells // J. Neurochem. 1994. 63. 988-996.
7. Kumai T., Tanaka M., Tateishi T. et al. Effects of sodium nitroprusside on the catecholamine synthetic pathway in the adrenal medulla of rats // Jpn. J. Pharmacol. 1998. 77. (3). 205-210.
8. Тищенко О.В., Елисеева Е.В., Мотавкин П.А. Значение оксида азота в развитии гипертрофии сердца в условиях экспериментальной почечной гипертензии // Цитология. 2002. 44. (3). 263-269.
Tishenko O.V., Eliseeva E.V., Motavkin P.A. Significance of nitric oxide in development of heart hypertrophy under experimental renal hypertension // Tsitologiya. 2000. 44. (3). 263-269.
9. Hope V. T., Michael G.J., Knigge K.M. et al. Neuronal NADPH-diaphorase is a nitric oxide synthase // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 1991. 88. 2811-2814.
10. Barnes R.D., Ward L.E., Frank K.P. et al. Nitric oxide modulates evoked catecholamine release from canine adrenal medulla // Neuroscience. 2001. 104. (4). 1165-1173.
11. Kiss J.P. Role of nitric oxide in the regulation of monoaminergic neurotransmission // Brain Res. Bull. 2000. 52. (6). 459-466.
12. Navarro-Oliveira C.M., Vassilieff V.S., Cordel-lini S. The sympathetic adrenomedullary system, but not the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, participates in aorta adaptive response to stress: nitric oxide involvement // Auton. Neurosci. 2000. 83. 140-147.
13. Moro M.A., Michelena P., Sanchez-Garcia P. et al. Activation of adrenal medullary L-arginine: nitric oxide pathway by stimuli which induce the release of catecholamines // Eur. J. Pharmacol. 1993. 246. 213-218.
14. Li D., Wang L., Lee C.-W. et al. Noradrenergic cell specific gene transfer with neuronal nitric oxide synthase reduces cardiac sympathetic neurotransmission in hypertensive rats // Hypertension. 2007. 50. 69-74.
15. Marley P.D., McLeod J., Anderson C. et al. Nerves containing nitric oxide synthase and their possible function in the control of catecholamine secretion in the bovine adrenal medulla // J. Auton. Nerve System. 1995. 54. 184-194.
16. Alm P., Larsson B., Ekblad E. et al. Tmmuno-histochemical localization of peripheral nitric oxide synthase-containing nerves using antibodies raised against synthesized C- and N-terminal fragments of a cloned enzyme from rat brain // Acta Physiol. Scand. 1993. 148. 421-429.
17. Talman W.T. NO and central cardiovascular control: A simple molecule with a complex story // Hypertension. 2006. 48. 552-554.
DYNAMICS OF THE ADRENAL MEDULLAR NEURON NO-SYNTHASE ACTIVITY IN EXPERIMENTAL HYPERTENSION AND ITS PHARMACOTHERAPEUTICAL CORRECTION
Ekaterina Valeryevna ELISEEVA1, Inessa Valeryevna DYUIZEN2, Anna Vladimirovna TYRTYSHNIKOVA1, Elena Filippovna ROMANCHENKO1
1Vladivostok State Medical University 690002, Vladivostok, Ostryakov av., 2
2Institute of Marine Biology named after A.V. Zhirmunskiy FEB RAN 600041, Vladivostok, Pal’chevsky st., 17
Adrenal medullar neuron’s NO synthase histochemical activity has been studied in experimental rats with induced renoprive arterial hypertension. Positive NO-synthase dynamics was revealed under correction of experimental renal hypertension with p-adrenoreceptor blockers, inhibitors of angiotensin converting enzyme (ACE), and antagonists of calcium channels. The mechanism of antihypertensive drugs pharmacodynamics in renoprival arterial hypertension treatment was specified.
Key words: adrenals, NO synthase, arterial hypertension, antihypertensive drugs.
Eliseeva E.V. — doctor of medical sciences, professor of chair for basic and clinical pharmacology, e-mail: [email protected]
Dyuizen I.V. — doctor of medical sciences, professor, senior of laboratory of pharmacology, e-mail: [email protected] Tyrtyshnikova A.V. — assistant of chair for basic and clinical pharmacology, e-mail: [email protected] Romanchenko E.F. — assistant of chair for basic and clinical pharmacology, e-mail: [email protected]
