CC BY
36
УДК 612.015.36:577.175.64:618.36:616.523-036.65 И.В.Довжикова
ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ СИНТЕЗА ЭСТРОГЕНОВ В ПЛАЦЕНТЕ НА ФОНЕ ОБОСТРЕНИЯ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН,
Благовещенск
РЕЗЮМЕ
При гистохимическом исследовании 62 зрелых плацент от беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции, обнаружено снижение интенсивности работы дегидроэпианд-ростерондегидрогеназы и 170-
гироксистероиддегидрогеназы, отвечающих за синтез эстрогенов в плаценте. Нарушение процессов гормонообразования прямо отразилось на содержании эстрадиола и эстриола в периферической крови и гомогенате плаценты.
Ключевые слова: плацента, герпес, эстрогены, ферменты стероидогенеза.
SUMMARY
I.V.Dovzhikova
CHANGE OF ESTROGENS SYNTHESES ACTIVITY IN PLACENTA DURING
EXACERBATION OF HERPES VIRUS INFECTION
At histochemical study of 62 term placentas from patients with herpetic infection exacerbation was found out that 30-hydroxysteroid dehydrogenase activity and 170-hydroxysteroid dehydrogenase activity decreased. The disturbance of steroid hormone synthesis affected the concentration of estriol and estradiol in peripheral blood and placental homogenate.
Key words: placenta, herpes, estrogens, steroidogenesis enzymes.
Герпес-вирусная инфекция играет значительную роль в развитии различной акушерской и перинатальной патологии [5, 9], что связано с ее высокой встречаемостью и тенденцией к быстрому росту заболеваемости. При ее обострении формируются нарушения эмбриогенеза, врожденная патология новорожденных, а также осложнения беременности, такие как, фетоплацентарная недостаточность, практически всегда сопровождаемая нарушением гормонального баланса. По нашему мнению, необходимо выявление причин развивающейся патологии. Цель нашей работы - проанализировать процесс биосинтеза эстрогенов и влияние его изменения на содержание эстриола и эстрадиола в плаценте при обострении герпесвирусной инфекции во время беременности.
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования послужили 62 зрелые плаценты, взятые при родах от практически здоровых матерей (28 случаев, контрольная группа) и женщин, перенесших обострение герпетической инфекции в третьем триместре беременности (титр антител класса G - 1:12800) (34 случая).
Диагностику инфекции осуществляли путем определения антител класса М и G иммуноферментным методом с помощью стандартных тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Исследование стероидов (холестерин, эстриол, эстрадиол) в периферической крови и плацентарном гомогенате проводили методом иммуноферментного анализа, используя наборы «Новохол» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) и ЗАО «Алкор Био» (Санкт-Петербург) на спектрофотометре «Stat-Fax 2100» (США). Все пациентки обследовались в динамике по триместрам беременности (10-12 недель, 20-24 недели, 30-34 недели).
Плаценту забирали в течение 10-15 мин после родов. Её поверхность со стороны базальной пластинки отмывали большим количеством физиологического раствора (ФР). Плодовая часть плаценты срезалась скальпелем пластинками площадью 2-3 см и толщиной не более 1 мм. Кусочки ткани помещали в 200 мл ФР, отмывали от клеток крови, перемешивая 15 мин на магнитной мешалке. Для получения экстрактов, отмытые кусочки плаценты слегка подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали, растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной кремообразной массы. К полученному гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл ФР). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20°С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и центрифугировали при 4000 об/мин при температуре +4°С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения ИФА. Для определения чистоты образцов проводились соответствующие кон-троли.
Выявление дегидроэпиандростерондегидрогеназы и 17в-гидроксистероиддегидрогеназ производилось по методу З.Лойда [6] в модификации лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при НЗЛ ДНЦ ФПД СО РАМН. Субстратом для выявления являлись 0,1М растворы 5андростен-3р-ол-17он, 5андростен-17р-ол-3он. Для определения локализации энзима в качестве акцептора применялась соль тетразолия фирмы ICN Biomedicals в конечной концентрации 5мМ. Как кофактор использовали НАДФ в конечной концентрации 1мМ. Инкубационный раствор готовился на основе 0,1М фосфатного буфера рН 7,4. Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывали дистиллированной водой, фиксировали в 10%-м нейтральном формалине и заключали в глицерин-желатин. Для исключения участия других факторов в восстановлении тетразо-лиевой соли проводили контрольные опыты.
Количество образующихся продуктов реакции проводили путем подсчета на программе компьютерной цитофотометрии методом измерения на стандартную единицу площади 0,1 (зонд) в 100 различных точках объекта.
Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики с оценкой достоверности различий по (t) критерию Стъюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Изучение содержания эстрогенов в периферической крови беременных показало, что при обострении герпес-вирусной инфекции происходят существенные изменения по сравнению с показателями контрольной группы (табл. 1). В I триместре концентрация эстриола при выраженном обострении инфекционного процесса, сопровождающемся ростом титра антител класса G к вирусу герпеса (1:12800), снизилась более чем на 30%. Во втором и третьем триместрах изменения были не столь серьезными: значения показателей уменьшились на 14%.
Мы провели исследование гормона не только в периферической крови матери, но и в гомогенате плацент (табл. 2). В центральной зоне органа содержание эстриола (при титре антител класса IgG к вирусу простого герпеса 1:12800) уменьшилось на 30%, в периферической зоне - на 17% по сравнению с контрольной группой. Таким образом, наиболее сильное влияние герпес-вирусной инфекции на данный гормон отмечалось в центральной зоне плаценты.
Выявленный факт свидетельствовал о том, что вспышка герпес-вирусной инфекции в самом начале гестации приводила к самым серьезным последствиям и могла поставить под вопрос дальнейшее развитие беременности. Достаточное количество данного гормона необходимо для поддержания гравидарного гомеостаза. Эстриол, нейтрализуя действие эстрона и эстрадиола, снижает сократительную способность
матки. Он же является наиболее деятельным протектором роста матки. Недостаток его синтеза вызывает угрозу прерывания в первой половине беременности и угрозу преждевременных родов - во второй. По данным об этом стероиде во время беременности принято судить о ее течении и прогнозировать состояние здоровья будущих новорожденных [1, 2, 7], и совершенно явственно, что прогноз в случае обострения герпеса в гестационный период будет неблагоприятным.
Следующим эстрогеном, на котором мы остановили свое внимание, был эстрадиол. Он является самым активным эстрогеном и, несмотря на то, что при беременности его фракция по удельному весу самая малая, он отвечает за нормальное течение гестации. Гормон способствует развитию комплекса биохимических изменений, обеспечивающих миометрий пластическим материалом и энергетическими ресурсами. Обострение герпес-вирусной инфекции повлияло на содержание эстрадиола, точно таким же образом, как и на предыдущий половой гормон. Его количество уменьшалось как в периферической крови матери, так и в гомогенате плаценты. В первом триместре при титре антител к вирусу простого герпеса класса G 1:12800 произошло его снижение в периферической крови матери приблизительно на 5%, во втором триместре - на 16%, в третьем - на 40% по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Данному факту, по нашему мнению, можно дать следующее объяснение. Принимая во внимание то обстоятельство, что на начальных этапах беременности еще малая часть эстрогенов синтезируется плацентой, а большая - организмом матери (в яичниках), можно прийти к заключению, что активация герпес-вирусной инфекции затрагивала процесс стероидогенеза в основном в провизорном органе, и на содержании эст-радиола в периферической крови женщины это отразилось в меньшей степени.
Таблица 1
Содержание эстрогенов в периферической крови на различных этапах беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции (рост титра антител класса IgG 1:12800)
Течение беременности Эстрадиол, пмоль/л Эстриол, нмоль/л
Сроки гестации Г руппы
I триместр Контрольная группа 29065,1±147,29 37,6±4,31
Обострение герпеса 27638,1±156,14 р<0,001 26,3±1,11 р<0,05
II триместр Контрольная группа 29789,2±167,43 48,6±0,91
Обострение герпеса 25149,1±159,99 р<0,001 37,4±0,59 р<0,01
III триместр Контрольная группа 31958,5±185,13 53,9±1,30
Обострение герпеса 19073,5±109,28 р<0,001 36,8±0,51 р<0,001
Примечание: здесь и далее р - достоверность различий по сравнению с контролем
Таблица 2
Содержание эстрогенов в гомогенате плаценты при обострении герпетической инфекции (повышение титра антител класса IgG до 1:12800)
Показатели Обострение герпеса Контрольная группа
Зоны плаценты
периферическая центральная периферическая центральная
Эстрадиол, пмоль/л Ї820Ї,2±Ї24,5Ї р<0,05 2Ї346,2±ЇЇ0,33 р<0,05 29Ї38,7±Ї02,73 32325,9±Ї25,87
Эстриол, нмоль/л Ї69,5±7,57 р>0,05 Ї77,9±6,ЇЇ р<0,05 Ї98,6±7,89 25Ї,Ї±9,02
При исследовании гомогената плацент, полученных от матерей, перенесших обострение герпесвирусной инфекции во время беременности, отмечалось уменьшение содержания эстрадиола на 34% в центральной зоне этого органа, и на 40% - в периферической зоне (табл. 2).
Продукция эстрогенов находится в прямой зависимости от наличия предшественников, вырабатываемых в организме матери и плода [7]. Основным прекурсором эстриола и эстрадиола (также как и других стероидных гормонов) является холестерин. Во время гестации, протекающей на фоне активации герпес-вирусной инфекции, наблюдались резкие изменения в концентрации стероида. В периферической крови матери в первом триместре количество холестерина достоверно снизилось до 5,01±0,09 ммоль/л (на 11%), во втором триместре - до 5,88±0,12 ммоль/л (на 14%) и в третьем триместре -до 6,33±0,11 ммоль/л (на 19%) по сравнению с контрольной группой, в которой оно составляло 5,61±0,11 ммоль/л (р<0,001); 6,78±0,13 ммоль/л (р<0,001) и 7,79±0,12 ммоль/л (р<0,001), соответственно. Примечательно, что данный факт отмечался не только в крови матери, но и непосредственно, в самом органе, где происходит основной процесс сте-роидогенеза во время беременности. При обострении герпес-вирусной инфекции наблюдалось достоверное снижение количества холестерина в гомогенате зрелых плацент, полученных при родах в срок до 1,46±0,096 моль/л (в контрольной группе -3,14±0,091 моль/л, р < 0,001).
Падение концентрации гормонов могло свидетельствовать о нарушении хода их образования из холестерина. Для получения подтверждения этого, было решено проанализировать ферментативную активность биосинтеза эстрогенов и провести гистохимические реакции на выявление ряда энзимов, принимающих участие в эстрогеногенезе.
Первой из гидроксистероиддегидрогеназ, катализирующих непосредственно синтез эстрогенов в плаценте, является фермент, преобразующий дегидро-эпиандростерон в андростендион - дегидроэпиандро-стерондегидрогеназа (относящийся к группе 3ß-гидроксистероиддегидрогеназ) [10]. Мы выполнили гистохимическую оценку его интенсивности в плаценте. Продукт реакции хорошо выявлялся в синци-тиотрофобласте ворсин, интенсивность гистохимической реакции (по цитофотометрической оценке) со-
ставляла 5,22±0,299 усл. ед.. Активность дегидроэпи-андростерондегидрогеназы в плацентарных ворсинах от женщин, перенесших обострение герпесвирусной инфекции во время беременности была снижена. Цитофотометрический показатель уменьшился до 2,54±0,677 усл. ед. То есть, реакция на этот фермент подвергалась изменениям в своей интенсивности под влиянием токсических продуктов инфицирования вирусами. Подавление интенсивности данной гистохимической реакции в плацентах и ворсинчатых хорионах свидетельствовало о нарушении процесса биосинтеза эстрогенов из дегидроэпиандро-стерона.
Конечная стадия образования эстрогенов в плаценте осуществляется 17ß-гидроксистероид-дегидрогеназой I типа. Фермент катализирует синтез эстриола и эстрадиола из эстрона [10].
Энзим локализовался в контрольной группе в синцитиотрофобласте, цитофотометрически его активность составила - 7,03±0,091 усл. ед. В плацентах женщин, перенесших герпес, наблюдалось снижение интенсивности продукта гистохимической реакции, выявляющей фермент 17ß- гидроксистероиддегидро-геназу (3,73±0,071 усл. ед.).
Уменьшение продукта гистохимической реакции при обострении герпес-вирусной инфекции свидетельствовало о низкой степени активности процесса синтеза эстрогенов и на данной стадии. Изменения же гормонсинтетической функции приведет к уменьшению количества эстрогенов, что и было отмечено при изучении их концентрации, как в самой плаценте, так и в периферической крови женщины, перенесшей активацию герпес-вирусной инфекции.
Течение стероидегенеза, как и любого метаболического пути обусловливается также и адекватностью его регуляторных механизмов. Биосинтез стероидных гормонов в плаценте характеризуется отсутствием контроля со стороны тех веществ, которые осуществляли его у небеременной женщины. Установлено, что образование половых стероидных гормонов регулируется плацентарными белковыми гормонами, действующими через посредника - цАМФ [11]. Ферментом, отвечающим за образование этого нуклеотида, является аденилатциклаза. Ранее нами было выявлено, что присутствие вирусной инфекции уменьшало интенсивность работы энзима в ворсинах зрелой плаценты [3]. Это становилось причиной низкого содержания в цитоплазме цАМФ, что по нашему
мнению являлось фактором, влияющим на снижение процесса стероидогенеза.
Следующим аспектом, важным для биосинтеза эстрогенов является достаточная концентрация обязательного кофактора - НАДФ/НАД [8]. Полученные нами ранее данные [4] говорили о падении концентрации этого кофактора, что нашло отражение в снижении активности образования стероидных гормонов.
Выводы
1. Обострение герпес-вирусной инфекции существенно снижало содержание эстрогенов в периферической крови беременной и в плаценте на различных сроках гестации.
2. Выявленное изменение является закономерным результатом нарастающего недостатка базисного стероида - холестерина, и нарушения процесса синтеза стероидных гормонов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баграмян Э.Р. О гормональной регуляции гес-тационного процесса // Акуш. и гин. 1984. №4. С.8-12.
2. Богданович Р.Н., Берестовая Т.А., Лукьянов
П.А. Значение определения гормонов фетоплацентарной системы и трофобластического ß1-
гликопротеина у беременных с угрозой невынашивания для диагностики плацентарной недостаточности // Рос. вестн. акушера-гинеколога. 2005. Т.5, №6. С.З-
7.
3. Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика активности НАДФН-диафоразы (маркера NO-синтазы), аденилат- и гуанилатциклаз в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфек-
цией // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2003. Вып.15. С.14-19.
4. Довжикова И.В., Луценко М.Т. Активность процессов образования НАДФ в плаценте при беременности, осложненной обострением герпесвирусной инфекции // Якутский медицинский журнал. 2009. №2 (26). С.159-160.
5. Клинико-морфологические параллели фетоплацентарного комплекса при герпетической инфекции у беременных / Зайдиева 3.С. [и др.] // Вест. Рос. ассоц. акуш.-гин. 1999. №2. С.27-30.
6. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: Мир, 1982. 259 с.
7. Плацентарная недостаточность / Савельева Г.М. [и др.]. М.: Медицина, 1991. 276 с.
8. Agarwal A. K., Auchus R. J. Minireview: cellular redox state regulates hydroxysteroid dehydrogenase activity and intracellular hormone potency // Endocrinology. 2005. Vol.146, №6. P.2531-2538.
9. Herpes simplex virus infection in pregnancy and in neonate: status of art of epidemiology, diagnosis, therapy and prevention / Anzivino E. [et al.] // Virology J. 2009.Vol.6.URL:http://www.virologyj.com/content/6/1/4 0/abstract (дата обращения: 12.01.10).
10. Payne A.H., Hales D.B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones // Endocr. Rev. 2004. Vol. 25, №6. P. 947-970.
11. Tremblay Y. Beaudoin C. Regulation of 30-hydroxysteroid dehydrogenase and 170-hydroxysteroid dehydrogenase messenger ribonucleic acid level by cyclic AMP and phorbol myristate acetate in human choriocarcinoma cells // Molecular Endocrinology. 1993. Vol.7. P.355-364.
Поступила 17.08.2010
Инна Викторовна Довжикова, старший научный сотрудник, 675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22;
Inna V. Dovzhikova, 22 Kalinin Str., Blagoveschensk, 675000;
E-mail: cfpd@amur. ru
П □ □
