CC BY
16
УДК 616.932:537.533.35
Н.П.Коннов, С.П.Заднова, О.С.Кузнецов
ИССЛЕДОВАНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ ДВУХ ФЕНОТИПИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ КЛОНОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА МЕТОДАМИ ТРАНСМИССИОННОЙ И СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Представлены данные по изучению ультраструктуры двух фенотипически различных клонов (токсигенного и нетоксигенного) штамма Vibrio cholerae Дакка 35 методами электронной микроскопии. На поверхности бактерий у нетоксигенного клона обнаружен дополнительный слой (капсула) полисахаридной природы (отсутствующий у токсигенного), который способствовал изменению морфологии колоний.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, токсигенные и нетоксигенные клетки, экзополисахаридный слой, трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия.
N.P.Konnov, S.P.Zadnova, O.S.Kuznetsov
Examination of the Ultrastructure of Two Phenotypically Different Clones of V cholerae by Means of Transmission and Scanning Electron Microscopy
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Submitted are the data of examination of the ultrastructure of two phenotypically different clones (toxigenic and non-toxigenic) of V cholerae Dakka35 strain by means of electron microscopy. Additional layer (capsule) of polysaccharide nature is identified on the surface of non-toxigenic clone bacteria. This layer (absent in toxigenic clone) alters colony morphology.
Key words: Vibrio cholerae, toxigenic and non-toxigenic cells, exopolysaccharide layer, transmission and scanning electron microscopy.
Несмотря на глубокие биологические и генетические исследования возбудителя холеры, многие свойства этого патогена остаются малоизученными. В частности, в настоящее время установлено, что популяция холерных вибрионов выделенных из различных сред обитания (от больных холерой, вибриононосителей, внешней среды) является гетерогенной [5, 6]. При изучении популяционного состава природных штаммов холерного вибриона классического биовара, выделенных на территории Пакистана и Индии в 1942-1969 гг. и хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий института «Микроб», были выявлены штаммы, в популяции которых присутствовали как типичные мелкие прозрачные Т-колонии (от англ. translucent), так и формирующие атипичные опалесцирующие мутные О-колонии (от англ. opaque). По данным ряда авторов [2, 7], изменение морфологии колоний таких штаммов коррелировало с изменением их признаков, в частности, они отличались по продукции ряда факторов патогенности, вирулентности и персистенции.
Существование различий в морфологии колоний могло быть связано с изменением биосинтеза поверхностных структур клетки, включая белки внешней мембраны, и экзополисахаридного слоя, обнаруженного у холерных вибрионов эльтор [4, 9]. Более того, появление клонов с атипичной морфологией могло быть следствием избирательной активности набора различных генов, в том числе и генов вирулентности [11].
В ранее проведенных исследованиях были обна-
ружены штаммы Vibrio cholerae классического био-вара - Дакка 35, 9361 и B1307, популяции которых содержали колонии двух типов, отличающихся друг от друга не только по морфологии, продукции растворимой гемагглютинин/протеазы, подвижности, но и по уровню синтеза холерного токсина. По данным реакции пассивного иммунного гемолиза (РПИГ), T-колонии указанных штаммов продуцировали холерный токсин (Тох+ фенотип), тогда как O-клоны не синтезировали этот белок (Тох- фенотип) [2]. Поскольку различия между колониями по четырем свойствам были наиболее выражены у штамма Дакка 35 серогруппы O1 классического биовара, то именно этот штамм был выбран в качестве модельного для последующих экспериментов.
В связи с вышеизложенным, целью наших исследований было изучение особенностей ультраструктуры бактерий Vibrio cholerae Дакка 35 и образуемых ими колоний методами трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии.
Материалы и методы
В качестве питательных сред использовали бульон и агар Хоттингера (рН 7,2), LB-бульон и агар (рН 6,8). Бактерии токсигенного и нетоксигенного вариантов штамма Дакка 35 выращивали в течение суток при 37 °С. Трансмиссионную электронную микроскопию проводили, применяя следующие варианты исследований: метод ультратонких срезов, негативного контрастирования, электронно-
Зб
А Б
Рис. 1. Электронограмма поверхности клеток Т- (А) и О- (Б) клонов штамма V ско1егае Дакка 35.
Стрелкой показан дополнительный слой, присутствующий на внешней поверхности клеток О-клона.
Негативное контрастирование ФВК. Увеличение *30000
гистохимический метод, а также сканирующую электронную микроскопию [3]. Препараты просматривали в электронном микроскопе Ни-12А и его сканирующей приставке ЖЕ-2 («НйасЫ», Япония).
Результаты и обсуждение
Для выявления особенностей клеточных структур, участвующих в изменении морфологии колоний в штаммах холерного вибриона, методом негативного контрастирования была изучена поверхность клеток и содержание в них поли-Р-гидроксибутирата модельного штамма V. ско!егае Дакка 35 классического биовара, имеющего в популяции Т- и О-клоны. При этом было установлено, что клетки Т- и О-клонов не содержали электронно-плотных гранул поли-Р-гидроксибутирата. В то же время при изучении двух фенотипически измененных вариантов V. ско!ете Дакка 35 было выявлено, что на поверхности и между клетками О-вариантов присутствует рыхлый слой, который отсутствует у Т-клонов (рис. 1).
Обнаруженный дополнительный слой был выделен с поверхности двух фенотипически разных вариантов штамма V. ско!егае Дакка 35, и при биохимическом исследовании было установлено, что он имеет полисахаридную природу [1].
Для подтверждения факта наличия у штамма V. ско!егае Дакка 35 экзополисахаридного слоя бак-
А Б
Рис. 2. Электронограмма двух фенотипически разных вариантов V. ско1егае Дакка 35, окрашенных рутением красным. Негативное контрастирование:
А - Т-клоны, не синтезирующие экзополисахарид;
Б - О-клоны, продуцирующие экзополисахарид; стрелкой отмечен экзополисахаридный слой. Увеличение *35000
А Б
Рис. 3. То же, что на рис. 2. Ультратонкие срезы.
Стрелками показан экзополисахаридный слой.
Увеличение *30000
терии Т- и О-клонов были исследованы электронногистохимическим методом после их обработки красителем рутением красным, применяемым для обнаружения экзополисахарида у грамотрицательных бактерий [8, 10]. При изучении популяции клеток в электронном микроскопе было выявлено, что действительно между клетками О-варианта Дакка 35 выявляется аморфный электронно-плотный слой окрашенных экзополисахаридов, тогда как у Т-варианта такой слой отсутствовал (рис. 2, 3).
На следующем этапе работы было высказано предположение, что присутствие дополнительного экзополисахаридного слоя на поверхности клеток О-вариантов может привести к изменению структуры колоний. Для проверки данного предположения было проведено изучение двух фенотипически разных вариантов штамма V. ско!егае Дакка 35 в сканирующем электронном микроскопе. Исследование показало, что О-колонии V. ско1егае Дакка 35 имели рыхлую поверхность с отпочкованными островковы-ми структурами (микроколонии, рис. 4, А, стрелка). расположенными на ее поверхности. В основной своей массе, клетки были покрыты слизистой оболочкой в результате продукции экзополисахарида. Иное строение колоний было у популяции Т-клонов (рис. 4, Б). Поверхность размножающихся бактерий имела гладкую форму, клетки расположены упорядоченно в центре колонии и хаотично по ее краям.
В итоге, с помощью трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии было подтверждено наличие экзополисахаридного слоя у О-холер-ных вибрионов классического биовара, который способствовал изменению морфологии колоний. Таким образом, экзополисахаридный слой обеспечивает
А Б
Рис. 4. Сканограммы колоний V. ско1егае Дакка 35:
А - колонии О-варианта; Б - колонии Т-варианта
защиту возбудителя в неблагоприятных условиях внешней среды.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Заднова С.П., Топорков А.В., Исаев Н.Д. Фенотипический анализ гетерогенного штамма Vibrio cholerae Дакка 35 Огава. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004; 3:86-8.
2. Исаев Н.Д., Лозовский Ю.В., Заднова С.П., Смирнова Н.И. Популяционная неоднородность природных штаммов Vibrio cholerae классического биовара: координированное изменение морфологии колоний, подвижности, токсигенности и ферментативных свойств. Пробл. особо опасных инф. 2005; 1(89):43-6.
3. Кутырев В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Возбудитель чумы: ультраструктура и локализация в переносчике. М.: Медицина; 2007. 224 с.
4. Ali A., Rashid M.H., Karaolis D.K. High-frequency rugose exopolysaccharide production by Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 2002; 68(1):5773-8.
5. Beyhan S., Yildiz F.H. Smooth to rugose phase variation in Vibrio cholerae can be mediated by a single nucleotide change that targets c-di-GMP signalling pathway. Mol. Microbiol. 2007; 63(4):995-1007.
6. Faruque S.M., Nair G.B. Vibrio cholerae genomics and molecular biology. Norfolk, UK: Caister Academic Press 2008. 218 p.
7. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Sengupta DTK., Page W.J., Stranley C.M., Phillips T.E. Colonial opacity variations among the choleragenic vibrios Microbiology. 1997; 143(1):23-34.
8. Johnson J.A., PanigrahiP., Morris J.G. Non-O1 Vibrio cholerae NRT36S produces a polysaccharide capsule that determines colony morphology, serum resistance, and virulence in mice. Infect. Immun. 1992; 60(3):864-9.
9. Yildiz F.H., Schooinik G.K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(7):4028-33.
10. YildizF.H., Dolganov N.A., Schooinik G.K. VpsR, a member of the response regulators of the two-component regulatory systems, is required for expression of vps biosynthesis genes and EPS(ETr)-associated phenotypes in Vibrio cholerae O1 El Tor. J. Bacteriol. 2001; 183(5):1716-26.
11. Yildiz F.H., Lie X.S., Heydorn A., Schooinik G.K. Molecular analysis of rugosity in a Vibrio cholerae O1 El Tor phase variant. Mol. Microbiol. 2004; 53(2):497-515.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation in the original article)
1. Zadnova S.P., Toporkov A.V., Isaev N.D. [Phenotypical analysis of heterogenic Vibrio cholerae strain Dacca 35 Ogawa]. Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. 2004; 3:86-8.
2. Isaev N.D., Lozovsky Yu.V., Zadnova S.P., Smirnova N.I. [Populational heterogeneity of natural Vibrio cholerae strains of classical biovariant: coordinated changes in colony, morphology, motility, toxigenicity, and enzymatic characteristics]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2005; (89):43-6
3. Kutyrev V.V, Konnov N.P., Volkov Yu.P. [The Causative Agent of Plague: Ultrastructure and Localization in a Vector]. M.: Meditsina; 2007. 224 p.
Authors:
Konnov N.P., Zadnova S.P., Kuznetsov O.S. Russian Research AntiPlague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia. E-mail: [email protected]
Об авторах:
Коннов Н.П., Заднова С.П., Кузнецов О.С. Российский научноисследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: [email protected]
Поступила 27.10.11.
