CC BY
20
T.A.Grishkina, E.V.Timofeyeva, V.A.Spiridonov
Assessment of the Effects of Long Storage on Glanders Pathogen Museum Collection Stains
Volgograd Anti-Plague Research Institute
Twenty one Burkholderia mallei strains were studied to demonstrate that the lyophilization and drying method makes it possible to conserve rare collectional cultures for long periods of time (up to 24 years). All the most
important biologic properties are retained under these conditions. If any of the characters are lost or colony morphology is changed, the original phenotype can be restored as a result of repeated subculturing on complete nutritional media. B. mallei strains vary in their sensitivity to drying procedures, repeated lyophilization cycles being apt to cause deceleration in the activity of the microbial cultures thus diminishing their value as reference strains.
Поступила 03.04.03
УДК 616.932:577.1
С.П.Заднова, Н.Д.Исаев, Н.П.Коннов, Т.Л.Захарова, Н.И.Смирнова
БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДВУХ ФЕНОТИПИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ КЛОНОВ ШТАММА VIBRIO CHOLERAE ДАККА35 01
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
В работе представлены данные по биохимическому анализу двух фенотипически различных клонов (токси-генного и нетоксигенного) штамма Vibrio cholerae Дакка35 классического биовара, которые отличаются не только по продукции холерного токсина, но и гемагглютинин/протеазы и подвижности. На поверхности нетоксигенного клона впервые обнаружен дополнительный слой полисахаридной природы, отсутствующий у токси-генных клонов, с которым связано изменение его морфологии колоний. Полученные данные наряду с продукцией нетоксигенными клонами белка внешней мембраны OmpU, обладающего защитными свойствами, позволили предположить, что названные клоны формируются в популяции штамма Дакка35 при попадании из орга-
низма человека в неблагоприятные условия внешней
Холера - опасное эпидемическое заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Vibrio cholerae. Холерный вибрион является одним из самых давних и изменчивых видов, приспособленный к существованию в разных экологических системах -в поверхностных водоемах и кишечнике человека. Переход из одной среды обитания в другую сопровождается изменением метаболизма клеток, а также структуры и функции его генома.
При обитании в водной среде холерный вибрион подвергается воздействию различных неблагоприятных факторов, но, обладая уникальной вариабельностью, может адаптироваться к их воздействию путем изменения фенотипических свойств. К числу таких приспособительных реакций относятся защитная модификация клеточной стенки, выражающаяся в изменении ее гидрофобности, синтез дополнительных полисахаридных слоев и капсулы и т.д. При попадании в организм человека у холерных вибрионов происходят изменения экспрессии генов, связанных с синтезом факторов агрессии (токсинов, ферментов), что отражается на их фенотипе [5, 12].
В ранее опубликованных работах сообщалось об обнаружении токсигенного штамма классического биовара V. cholerae Дакка35 Огава, выделенного в 1958 г. в Пакистане от больного человека, продуцирующего 10-12 мкг/мл холерного токсина в среду выращивания. При изучении популяции указанного штамма установлено, что она гетерогенна и состоит из двух типов колоний: продуцирующих (Тох+) и не продуцирующих (Тох~) холерный токсин. При этом колонии Тох+ и Тох" заметно отличались друг от друга по морфологии и размерам. Клетки Тох формировали мелкие прозрачные колонии, тогда как колонии
среды.
клеток Тох~ были более крупные и мутные [3].
Цель нашей работы заключалась в сравнительном изучении биохимических свойств токсигенных и нетоксигенных клонов штамма классического биовара V. cholerae Дакка35.
Материалы и методы
В качестве питательных сред использовали бульон и агар Хоттингера (pH 7,2), LB-бульон и агар. Белковый спектр клеток определяли, используя электрофорез в полиакриламидном геле по U.K.Laemmli [8]. Выделение экзополисахаридного материала с поверхности клеток штамма Дакка35 осуществляли по модифицированной методике [4]. Для этого бактерии токсигенного и нетоксигенного вариантов штамма Дакка35 выращивали в течение суток при 37 °С. Выросшую культуру центрифугировали при lOOOOg в течение 30 мин, затем бактериальные клетки ресуспендировали в 25 объемах стерильного физиологического раствора, обрабатывали на Vortex в течение 2 мин и для отделения антигенов, расположенных на поверхности клеток, центрифугировали. Осадок клеток отбрасывали, а к на-досадочной жидкости, содержащей растворенный полисахаридный материал, добавляли медленно с покачиванием три объема 95 % этанола. Образовавшийся преципитат, состоящий из полисахаридов, центрифугировали при 3000g в течение 30 мин, дважды отмывали этиловым спиртом и еще один раз -абсолютным этанолом, высушивали при комнатной температуре и анализировали методом тонкослойной хроматографии. Хромосомную ДНК выделяли по методу, описанному в пособии по молекулярному клонированию [2]. Полимеразную цепную реакцию
в
* 1
Рис. 1. Бактерии штамма V. с/ю1егае Дакка35:
А - токсигенный клон; В - нетоксигенный. Стрелкой показан дополнительный полисахаридный слой, присутствующий на внешней поверхности клеток нетоксигенного клона. хЗОООО
(ПЦР) проводили согласно методу К.НозЫпо ег а1. [7]. Электронную микроскопию проводили методом негативного контрастирования [10].
Результаты и обсуждение
Методом ПЦР установлено, что геном клеток как Тох+, так и Тох“ несет одни и те же структурные гены вирулентности, расположенные на мобильных генетических элементах, - с1хАВ, гог и асе, кодирующие синтез трех различных токсинов и входящие в состав профага СТХ; щА и папН, определяющие, соответственно, продукцию основного фактора колонизации и нейраминидазы, и локализованные на «островах патогенности» \Ф1 и УР1-2. Кроме того, в их хромосомах присутствуют два ключевых регуляторных гена юхЯ и ЮхТ.
В то же время при электронно-микроскопиче-ском изучении поверхности токсигенных и нетокси-генных клонов штамма V. ско1егае Дакка35 обнаружено, что Тох“ клетки окружены рыхлым слоем, который отсутствует у Тох клонов (рис. 1). Для определения природы данного слоя проанализирован белковый спектр Тох“ и Тох+ клонов штамма Дак-ка35. Оказалось, что нетоксигенные клоны отличаются от токсигенных по продукции белков внешней мембраны. Бактерии Тох" синтезируют два белка внешней мембраны - Отри, и ОтрТ, продукция которых непосредственно контролируется глобальным регуляторным геном юхИ, тогда как у Тох+ клонов присутствует только ОтрТ белок. Эти данные указывают, во-первых, на нетипичный механизм регуляции генов отрО и отрТ белком ТохЯ в данном штамме, так как в типичных токсигенных штаммах белок ТохЯ активирует ген отри и репрессирует отрТ [9]. Во-вторых, возникло предположение, что, возможно, именно присутствие белка Отр11 способствует изменению морфологии колоний у нетоксигенных клонов штамма V. скок-
гае Дакка35,' так как в литературе описаны штаммы, у которых при изменении морфологии колоний происходят изменения в белковом спектре - прозрачные вирулентные Т-колонии V. с1го1егае 3083 Огава биовара эльтор синтезировали белок с молекулярной массой 49 Юа, который отсутствовал у авирулентных непрозрачных О-вариантов, но при этом были обнаружены отличия не только в белках внешней мембраны, но и в структуре липополиса-харида [5]. При дальнейших исследованиях Тох' и Тох+ клонов обнаружено, что при введении конъю-гативной плазмиды с клонированными генами холерного токсина в Тох+ клоны происходит переключение в синтезе белков Отри и ОтрТ, и токси-генные клоны штамма V. с1го1егае Дакка35 начинают продуцировать белок Отри вместо ОтрТ, но при этом не происходят изменения морфологии колоний данных клонов [1]. Очевидно, более плотная непрозрачная морфология Тох- клонов обусловлена другими поверхностными структурами. Поэтому на следующем этапе были получены цельноклеточные лизаты бактерий штамма Дакка35 Тох+ и Тох- клонов, обработанные протеиназой К, которая обладает протеолитическим действием, расщепляя белки и ДНК, но не разрушая липополисахарид [6]. При окраске полиакриламидных пластин после электрофореза ионами серебра для обнаружения полисахаридов выявлены существенные отличия между Тох" и Тох+ клонами. У Тох” регистрировалась мощная нижняя зона полисахарида, которая отсутствовала у Тох+ клонов (рис. 2). Полисахаридный материал выделен с поверхности клеток Тох" и Тох+ клонов с использованием этанола, как указано выше. При проведении сравнительного анализа моносахарид-ного состава, полученного полисахаридного слоя методом тонкослойной хроматографии в препарате из нетоксигенного клона, при сравнении со стандартными углеводными метчиками, в значительном количестве выявлены рамноза, глюкоза, галактоза,
1 2
Рис. 2. Электрофореграмма клеточных лизатов штамма V. скокгае Дакка35, обработанных протеиназой К и окрашенных раствором азотнокислого серебра для выявления полисахаридов:
1 -V. сЬокгае Дакка35 - токсигенный клон (8 мкг);
2 - V. сИокгае Дакка35 - нетоксигенный (8 мкг)
гексозамин. В аналогичном препарате из токсиген-ного клона указанные сахара присутствовали в следовых количествах (рис. 3). Таким образом, нами обнаружено, что при переходе в нетоксигенную форму у бактерий штамма V. ско1егае Дакка35 на внешней поверхности клетки синтезируется дополнительный слой полисахаридной природы, с которым, видимо, и связано появление мутных колоний у Тох” клонов.
При дальнейшем изучении экспрессии различных генов патогенности обнаружено, что между клонами Тох+ и Тох” существуют заметные различия в продукции гемагглютинин/протеазы. Нетоксиген-ные клоны продуцируют в два раза больше данного фермента, чем токсигенные клоны. У нетоксиген-ных клонов утрата продукции холерного токсина сопровождается также повышением подвижности. Эти данные являются основанием для предположения о том, что Тох” клоны формируются в популяции высокотоксигенного штамма Дакка35 при попадании его из организма человека в водную экосистему, в которой белок Огпри способен защищать клетки от действия различных повреждающих факторов [9, 11]. Можно полагать также, что повышенная подвижность препятствует уничтожению этих Тох'-клеток простейшими, а впервые выявленный у классических вибрионов дополнительный полисахаридный слой, вероятнее всего, выполняет защитную функцию подобно экзополисахаридному слою,
Рис. 3. Моносахаридный состав полисахаридного материала, выделенного с поверхности двух клонов V. cholerae Дакка35:
I - метчики полисахаридов (рамноза, ксилоза, рибоза, манноза, глюкоза, галактоза); 2 - токсигенный клон; 3 - нетоксигенный
обнаруженному у холерных вибрионов биовара эль-тор, присутствие которого способствует выживанию бактерий при воздействии перекиси водорода и повышенной концентрации хлорида натрия [12].
Таким образом, при смене среды обитания у возбудителя холеры происходит координированное изменение генной активности. Дальнейшая работа в этом направлении будет способствовать изучению механизмов регуляции экспрессии ключевых генов вирулентности и персистенции.
Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-1531.2003.4) и гранта РФФИ № 03-04-48438.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.3аднова СП., Топорков А.В., Смирнова Н.И.// ЖМЭИ. - 2001. - №2. - С. 3-6. - 2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. - М., 1984. - 480 с. - 3. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Еро-шенко Г. А. // ЖМЭИ. - 1990. - № 5. - С. 6-9. - 4. Evans L.R., Linker А. // J. Bacteriol. - 1973. - Vol. 116. - P. 915-924.- 5. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein М., Chang Y. et al. II Infect. Immun. - 1992. - Vol. 60. - P. 472-478. - 6. Hitchock P.J., Brown T.M.//J. Bacteriol. - 1983. -Vol. 154, N 1. - P. 269-277. - 7. Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A.K. et al. II FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1998. - Vol. 20. - P. 201-207. - 8. Laemmli U.K. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685. - 9. Merrell D.SBailey C., Kaper J.B., Camilli A. // J. Bacteriol. - 2001. -Vol. 183, N9. - P. 2746-2754. - lO.Mudd S., Anderson T.F. // J. Exp. Med . - 1942. - Vol. 76. - P. 103-107. - 11. Pro-venzano D., Klose K.E. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. - Vol. 97. - P. 10220-10224. - 12. Wai S.N., Mizunoe Y., Takade A. et al. H Appl. Environ. Microbiol. - 1998. — Vol. 64, N 10.-P. 3648-3655.
S.P.Zadnova, N.D.Issayev, N.P.Konnov, T.L.Zakharova, N.I.Smirnova.
i
Biochemical Analysis of Two Phenotypically Distinct Clones of Vibrio cholerae Strain Dakka 35 01
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov
Described in the work are the results of biochemical studies of two phenotypically distinct clones (toxinogenic and non-toxinogenic) of Vibrio cholerae Dakka 35 strain, classical biovariant, differing not only in the production of cholera toxin, but also in hemagglutinin/protease synthesis and
their motility characteristics. The non-toxinogenic clone was, for the first time, shown to contain an additional layer (polysaccharide in its nature) absent in toxinogenic clones, which could be associated with the alterations in colony morphology. These observations together with the ability of non-toxinogenic clones to produce an outer-membrane protein, OmpU, manifesting protective activities, may be suggestive of a possibility for such kind of clones to develop among the population of Dakka 35 strain due to the unfavourable environmental conditions outside the human organism.
Поступила 27.02.04
УДК 616.932.576.809.7
И.М.Кобкова, Л.Ф.Ливанова, А.В.Осин, Н.И.Смирнова
ПОЛУЧЕНИЕ АВИРУЛЕНТНОГО ШТАММА ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА 0139-СЕРОГРУППЫ, ПРОДУЦИРУЮЩЕГО ИММУНОГЕННУЮ В-СУБЪЕДИНИЦУ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
С помощью конъюгационных скрещиваний на основе авирулентного штамма V. с}го1егае 170 Н1у~ 0139-серогруппы сконструирован штамм с высоким уровнем биосинтеза В-субъединицы холерного токсина и 0139-антигена, которые обеспечивают, соответственно, формирование антитоксического и антибактериального иммунитета при холере. Созданный пггамм V. сНокгае 170 Н1у”(р1ЕМЗ) может быть использован в качестве носителя других генов протективных антигенов и в качестве продуцента для получения В-субъединицы холерного токсина, входящей в состав диагностических тест-систем, позволяющих выявлять токсигенные клоны холерно-
го вибриона разных серогрупп.
Неожиданное появление в 1992 г. в Индии и Бангладеш нового варианта возбудителя холеры 0139-серогруппы (синоним Бенгал), имеющего ранее неизвестные поверхностные антигены (0139-антиген и полисахаридную капсулу), обусловило необходимость создания холерных вакцин нового поколения, способных предотвратить возникновение эпидемий, вызванных бенгальскими штаммами [12, 15].
К настоящему времени уже описан ряд живых и инактивированных вакцин против холеры, вызываемых Vibrio cholerae 0139 [1, 7, 14]. Однако эти вакцины малоэффективны или характеризуются остаточной реактогенностью, вызывая у части вакцинированных развитие диареи.
Цель нашей работы - создание авирулентного штамма V. cholerae 0139 с высоким уровнем биосинтеза В-субъединицы холерного токсина, которая обеспечивает формирование антитоксического иммунитета при холере.
Материалы и методы
В работе использовали нетоксигенный штамм 0139-серогруппы V. cholerae 170 Н1у+ с полисахаридной капсулой, выделенный в 1999 г. из воды открытых водоемов (Московская обл.), а также штамм Escherichia coli KS164(pIEM3) KjnrTcr.
Для введения мутации в ген ЫуА клетки штамма V. cholerae 170 обрабатывали нитрозогуаниди-ном [6]. Присутствие в геноме штамма V. cholerae 170 генов вирулентности определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием различных пар праймеров для тестирования фрагментов генов ctxA, асе, zot и регуляторных ге-
нов 1срА, юхТ, юхЯ, ПхА, ИарА, а также нуклеотидной последовательности аШ181 [4, 8]. Конъюгаци-онные скрещивания, определение продукции В-субъединицы холерного токсина и 0139-антиге-на, резистентность штамма к антибиотикам, популяционный анализ осуществляли по общепринятым методам [3, 9].
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы с помощью ПЦР-ана-лиза определено отсутствие в хромосоме структурных генов МхА, асе, го?, кодирующих биосинтез различных токсинов и входящих в состав профага СТХ. Кроме того, в геноме не обнаружено присутствия генов 1срА, определяющих биосинтез второго ключевого фактора вирулентности - токсин-корегу-лируемых пилей адгезии, а также регуляторного гена ЮхТ, локализованных на острове патогенности УР! Этот штамм лишен и последовательности аиЯ81.
Из анализа полученных данных очевидно, что из-за отсутствия токсин-корегулируемых пилей адгезии, служащих рецептором для фага вирулентности СТХф, а также аиЛБ 1 -сайта, штамм V. сЬо1егае 170 Н1у+не может реверсировать в токсигенный путем фаговой конверсии.
В то же время штамм V. сИокгае 170 продуцировал значительное количество гемолизина, который согласно данным последних исследований, является сильным цитотоксином [5]. Для получения Н1у~-клона клетки штамма V. ско1егае 170 Н1у+обработаны нитрозогуанидином. В результате среди выживших клеток был обнаружен штамм Н1у“, лишенный гемолитической активности (рис. 1). Этот штамм
