Исследование трансформации бутил-2-феноксипропионата клеточными катализаторами Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 579.66:547.94

A. Н. Шакиров (асп.), Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.), С. С. Вершинин (к.х.н., доц.),

B. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)

Исследование трансформации бутил-2-феноксипропионата

клеточными катализаторами

Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]

A. N. Shakirov, N. I. Petukhova, L. H. Khalimova, S. S. Vershinin, V. V. Zorin

Research of butyl 2-phenoxypropionate transformation

by cellular catalysts

Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str.,450062 Ufa, Russia;Phone: (347) 243-19-35; е-mail: [email protected]

Исследован процесс гидролиза (Л,5)-бутил-2-феноксипропионата с помощью клеток микроорганизмов в системах буфер-ацетон, содержащих 20—50 % органического растворителя. Найден перспективный штамм Bacillus sp. К-3-2 для разработки метода кинетического разделения рацемического бутил-2-феноксипропионата.

Ключевые слова: биотрансформация; клеточные биокатализаторы; микроорганизмы; энан-тиоселективный катализ.

The process of hydrolysis of racemic butyl 2-phenoxypropionate by microorganisms in buffer-acetone systems contained 20-50% organic solvent was studied. The promising strain Bacillus sp. K-3-2 for development of kinetic resolution of racemic butyl 2-phenoxypropionate was found.

Key words: biotransformation; cellular bio-catalysts; enantioselective catalysis; microorganisms.

2-Феноксипропионовая кислота является прекурсором ряда системных селективных регуляторов роста растений 1. В частности, ее производные (1—111) применяют для подавления сорняков, устойчивых к 2,4-Д и 2М-4Х, в посевах зерновых культур, хлопчатника, картофеля и др.

Однако гербицидную активность проявляют в основном (^)-энантиомеры этих соединений, в то время как (5)-антиподы малоактивны ', и их использование приводит только

к загрязнению окружающей среды. Для производства нужных энантиомеров указанных гербицидов требуется (^)-2-феноксипропионовая кислота.

Одним из перспективных подходов получения оптически чистых энантиомеров хираль-ных кислот является кинетическое разделения рацемических смесей их сложных эфиров с помощью ферментов или клеток микроорга-

низмов

2,3,4

OC4H9

O

H3C O

CF3

N-

I - флуазифопбутил

Дата поступления 26.11.09

CH3 O

O

OH

OH O ' H3C

CH3

Cl

II - мекопроп (ранкотекс, 2М-4ХП)

H3C O

III - иллоксан (дихлорфопметил)

С целью поиска эффективных биокатализаторов был исследован процесс гидролиза рацемического бутил-2-феноксипропионата с помощью клеток микроорганизмов, обладающих липолитической или эстеразной активностью (табл. 1).

Было обнаружено, что все исследованные микроорганизмы способны гидролизовать (^,5)-бутил-2-феноксипропионат в системе буфер—ацетон (30%) (табл. 1), но в изученных условиях реакция протекает неселективно.

.COOBu

OPh бутил-2-феноксипропионат

микроорганизмов буф!

COOH OPh

2-феноксипропионовая

7

Я 6

ö 1 Д 1

-К-3-2

-77-32R

-77-32S

-НС-1113

-77-7

-78-5

-77-9

-77-7-2

10 20 30 Ацетон, %

40

50

С целью поиска подходов к увеличению селективности процесса было исследовано влияние концентрации ацетона на трансформацию эфира. Установлено, что увеличение содержания ацетона в реакционной смеси с 20 до 30 % приводит к существенному ускорению гидролиза бутил-2-феноксипропионата в присутствии всех исследованных биокатализаторов, что, вероятно, обусловлено увеличением растворимости субстрата в буфере (рисунок 1).

Однако при более высоком содержании ацетона происходит существенное замедление исследуемых процессов и при 40%-ной концентрации растворителя многие биокатализаторы практически теряют свою активность. Вместе с тем, обнаружено, что 4 биокатализатора (Bacillus sp. К-3-2, Rhodococcus spp. 77-32R, 77-32S и 78-5) проявляют достаточно высокую активность в данной системе растворителей (рис. 1).

Исследование динамики конверсии субстрата в ходе трансформации биокатализаторами, способными работать в системе, содержащей 40% ацетона, показало, что большинство из них работает неселективно, конвертируя субстрат на 70—90 % (рис. 2).

Рис. 1. Зависимость начальной скорости трансформации бутил-2-феноксипропионата от содержания ацетона в реакционной смеси.

Условия реакции: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 40% ацетона — 1 мл, бутил-2-феноксипропионат — 5 мг/мл, биокатализатор — 30 мг/мл, температура — 30 оС, перемешивание — 180 об./мин.

100

80 -

60 -

40 -

20

—0—78-5

ж 77-32R —й—77-32S —»--К-3-2

200

Время, мин

400

Рис. 2. Конверсия бутил-2-феноксипропионата клетками микроорганизмов в системе, содержащей 40 % ацетона. Условия реакции:

0.1 М фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 40% ацетона — 1 мл, субстрат — 5 мг/мл, биокатализатор — 30 мг/мл, температура — 30 оС, перемешивание — 180 об./мин.

В тоже время было обнаружено, что штамм Bacillus sp. К-3-2 при высокой начальной скорости реакции, превышающей

Таблица 1

Биокатализируемый гидролиз рацемического бутил-2-феноксипропионата с помощью клеток микроорганизмов

Штаммы Конверсия, % Штаммы Конверсия, %

Bacillus sp. К-1-1 100 Rhodococcus sp. 77-32S 95

Bacillus sp. К-3-2 85.2 Serratia sp.HC-1113 100

Microbacterium sp. 77-9 100 77-7 93

Rhodococcus sp. 78-5 87.7 77-7-2 100

Rhodococcus sp. 77-32R 100 -

Условия реакции: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 30% ацетона — 1 мл, субстрат 5 мг/мл, биокатализатор — 30 мг/мл, температура — 30 оС, перемешивание - 180 об./мин, время — 3

0

0

Н2О

0

0

в 1,7—3 раза скорости остальных микроорганизмов, трансформирует субстрат менее, чем на 50%, проявляя кинетику, характерную для энантиоселективного процесса (рис.2).

Таким образом, найден перспективный штамм Bacillus sp. К-3-2 для разработки метода кинетического разделения рацемического бутил-2-феноксипропионата.

Материалы и методы

Рацемический бутиловый эфир 2-фенок-сипропионовой кислоты получали реакцией бутил-2-бромпропионата, синтезированного по методике 5, с фенолятом натрия в ДМФА. Фенолят натрия получали взаимодействием гидроксида натрия со спиртовым раствором фенола и последующим упариванием водно-спиртового раствора при пониженном давлении на глицериновой бане (t~120 оС). Взаимодействие бутил-2-бромпропионата с фенолятом натрия проводили в осушенном ДМФА, при мольном соотношении реагентов 1:1.2 и температуре кипения реакционной смеси, в течение 4 ч. Выход бутил-2-феноксипропионата составил 98%.

Спектр ЯМР 1Н (8,м.д.): 0.9 т (3Н, СНз(СН2)3О), 1.2-1.4 м (4Н, СН3(СН2)2 СН2О), 1.65 д (3Н, СНзСНСОО), 4.2 м (2Н, СН2О), 4.75 к (Н, СНОРЬ), 6.85-7.4 м (5 H, Ph) (рисунок). Спектр ЯМР 13С (8, м.д.): 13.66 (СНз(СН2)3О), 18.71 (СНдСНСОО), 19.0 (СН3СН2(СН2)2О), 30.61 (СН3СН2СН2 СН2О), 65.07 (СН2О), 72.61 (СНОРЬ), 115.13 (2a-C, Ph), 121.57 (у-С, Ph), 129.57 (2ß-C, Ph), 157, 172.48 (COO).

Микроорганизмы выращивали на агари-зованном панкреатическом гидролизате рыбной муки СР-1 (35 г/л). Питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС. Выращивание микроорганизмов проводили в чашках Петри в термостате при 30 оС в течение 24—72 ч.

Биомассу микроорганизмов, предварительно отмытую фосфатным буфером, заливали ацетоном (1:3 (об/об)), перемешивали, выдерживали 15 мин. Затем центрифугировали

при 6000 об/мин в течение 10 мин. Процедуру повторяли три раза. Полученные обезвоженные клетки микроорганизмов высушивали при комнатной температуре.

Гидролиз эфира с помощью обезвоженных клеток микроорганизмов осуществляли в системах 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0) -ацетон с различным содержанием органического растворителя (20—50 %) при температуре 30 оС и перемешивании (180 об./мин). Биокатализатор вносили в концентрации 30 мг/мл. Исходная концентрация субстрата составляла 5,0 г/л. По окончании реакции клетки отделяли от реакционной среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об./мин.

Изменение концентрации субстрата трансформации контролировали в предварительно осветленных пробах методом ГЖХ на хроматографе ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором. Режим хроматографи-ческого анализа: колонка 3000 х 3 мм с неподвижной жидкой фазой SE-30 5% на хроматоне N-AW, расход газа-носителя (азота) — 30— 37 мл/мин), расход водорода — 30 мл/мин, расход воздуха - 300 мл/мин, температура колонки — 180 оС, температура испарителя — 250 оС.

Литература

1. Химическая защита растений /Под ред. Г. С. Груздева.— М.: Агропромиздат, 1987.— 415 с.

2. Зорин В. В., Петухова Н. И., Халимова Л. Х. Регио- и стереоселективная биотрансформация органических соединений /В кн. «Панорама современной химии России. Современный органический синтез»: Сб. обзорных статей.— М.: Химия, 2003.- С. 439.

3. Зорин В. В., Петухова Н. И. Клетки микроорганизмов как катализаторы в энантиоселективной трансформации органических соединений /В кн. «Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов»: Сб. обзорных статей. М.: Химия.- 2006.- С. 280.

4. Faber K. Biotransformation in Organic Chemistry.- Berlin: Springer, 2000.- 218 p.

5. Vogel A. I. Practical organic chemistry.-London: Longman, 1974.- 1188 p.

Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы), проект №2.1.2/5048 «Создание научных основ хемо-, регио- и энантионаправленной биотрансформации органических соединений и биоокисления сульфидов металлов»