CC BY
40
Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), Р. Н. Шахмаев (к.х.н., доц.),
Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.), А. А. Загидуллин (студ.), А. Ш. Сунагатуллина (студ.),
В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Исследование кинетики гидролиза рацемической смеси додеканил-4-ацетата с помощью клеточных биокатализаторов
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
N. I. Petukhova, R. N. Shahmaev, L. H. Khalimova, A. A. Zagidullin,
A. S. Sunagatyllina, V. V. Zorin
Research of kinetics of dodecanyl-4-acetate racemic mixture hydrolysis by cellular biocatalysts
Ufa State Petroleum Technical University
1, Kosmonavtov Str.,450062 Ufa, Russia;Phone: (347) 2431935; е-mail: [email protected]
Исследована кинетика гидролиза рацемической смеси додеканил-4-ацетата с помощью клеточных катализаторов, полученных на основе биомассы бактерий Bacillus spp. 77-1 и 79-54, Pseudomonas spp. 77-33 и 77-47. Найден биокатализатор, гидролизующий субстрат с кинетикой, характерной для высокоэнантиоселектив-ного процесса кинетического разделения рацемических соединений.
Ключевые слова: 4-додеканол; додеканил-4-ацетат; липазы; микроорганизмы; энантиосе-лективный биокатализ.
The kinetics of dodecanyl-4-acetate racemic mixture hydrolysis by cellular biocatalysts Bacillus spp. 77-1 and 79-54, Pseudomonas spp. 77-33 and 77-47 was studied. The biocatalyst capable to hydrolyze a substrate with typical for high-enantioselective racemate separation kinetics was found.
Key words: 4-dodecanol; dodecanyl-4-acetate; enantioselective biocatalysts; lipases, microorganisms,
Энантиоселективные биокаталитические процессы с применением липаз, эстераз и клеток микроорганизмов широко используются для кинетического разделения рацемических смесей сложных эфиров вторичных спиртов и позволяют получать энантиомерно чистые син-тоны практически важных соединений 1-3.
В настоящей работе осуществлено исследование кинетики гидролиза рацемической смеси додеканил-4-ацетата с помощью клеток микроорганизмов с целью поиска перспективного биокатализатора для получения оптически чистых энантиомеров 4-додеканола, находящих применение в синтезе лекарственных веществ, жидких кристаллов, препаратов для
4
агрохимии .
Объектом исследования служили бактерии из коллекции культур кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, на основе которых ранее были
разработаны энантиоселективные биокатализаторы процессов кинетического разделения втор-бутилацетата (Bacillus spp. 77-1 и 79-54) 5 и парциального ацилирования гептанола-2 (Pseudomonas spp. 77-33 и 77-47) 6.
Было обнаружено, что клетки этих микроорганизмов способны трансформировать эфир с образованием додекан-4-ола в буфере, содержащем 20% ацетона.
"ОАс додеканил-4-ацетат
микроорганизмов буфер-ацетон (20%)
Однако, конверсия субстрата в этих условиях значительно превысила 50%-ый уровень, характерный для высокоэнантиоселективного процесса кинетического разделения, в котором один из энантиомеров рацемической смеси подвергается превращению, а другой остается не прореагировавшим (табл. 1).
Дата поступления 26.11.09
СНзСООН
Н2О
додекан-4-ол
Таблица 1 Конверсия додеканил-4-ацетата при гидролизе в присутствии различных биокатализаторов
Штаммы Конверсия 4-додеканилацетата, %
Bacillus sp. ll-1* 1GG
Bacillus sp. l9-54 1GG
Pseudomonas sp. ll-33 1GG
Pseudomonas sp. ll-4l 83.2
н
л
ч
rt
tr
rt
Я
-77-1
- 77-33
- 77-47
- 79-54
Исследование кинетики трансформации додеканил-4-ацетата в системе буфер-ацетон, содержащей 50% ацетона, показало, что три штамма (77-47, 79-54 и 77-33) по-прежнему работают неселективно (рис.2).
Условия реакции: 0.1 М фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 20% ацетона — 1 мл, субстрат — 5 мг/мл, биокатализатор (трехсуточная биомасса) — 30 мг/мл, температура — 30 оС, время — 24 ч;
* — суточная биомасса
Известно, что энантиоселективные свойства липаз и эстераз могут изменяться в присутствии некоторых органических растворителей. Кроме того, при использовании клеточных катализаторов, продуцирующих несколько изоферментов, с помощью органических растворителей иногда удается подавить «мешающий» фермент 1,2,3. В связи с этим было исследовано влияние ацетона на трансформацию додеканил-4-ацетата соединения микро-организмами. Было обнаружено значительное возрастание начальной скорости трансформации при увеличении содержания ацетона в случае штамма 77-1 до 30%, а в остальных случаях до 40% (рис. 1). Однако в системах с большим содержанием ацетона происходило снижение скорости реакции во всех вариантах. При 60%-ом содержании ацетона ни один из биокатализаторов не работал.
77-1
-77-47
-79-54
77-33
Ацетон, %
Рис.1. Зависимость начальной скорости гидролиза додеканил-4-ацетата от содержания ацетона в реакционной смеси. Условия реакции: 0.1 М фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий 20—60 % ацетона — 1 мл, субстрат — 5 мг/мл, биокатализатор — 30 мг/мл, температура — 30 оС, перемешивание — 180 об./мин.
Время, ч
Рис. 2. Кинетика трансформации додеканил-4-аце-тата в системе буфер-ацетон, содержащей50% ацетона. Условия реакции: 0.1 М фосфатный буфер (рН 7.0), содержащий 50% ацетона — 1 мл, субстрат — 5 мг/мл, биокатализатор — 30 мг/мл, температура — 30 оС, перемешивание — 180 об./мин.
В тоже время при трансформации додека-нил-4-ацетата штаммом 77-1 наблюдалась кинетика, характерная для высокоселективного процесса (рис. 2). Гидролиз субстрата прекращался по истечении 4 ч при конверсии, близкой к 50%, что позволяет рассматривать штамм 77-1 как перспективный биокатализатор для разработки эффективного метода кинетического разделения рацемической смеси додеканил-4-ацетата.
Материалы и методы
Додеканил-4-ацетат был синтезирован ацилированием 4-додеканола, полученного сочетанием по Гриньяру пропилмагнийбромида и 1-нонаналя. В качестве ацилирующих агентов использовали уксусный ангидрид и хло-рангидрид изовалериановой кислоты.
Для синтеза 4-додеканола к реактиву Гри-ньяра, полученному из 12.3 г (0.1 моль) про-пилбромида и 2.43 г (0.1 моль) магниевой стружки в 100 мл абс. диэтилового эфира, медленно при интенсивном перемешивании и охлаждении (1 ч, 0 оС) добавляли раствор 14.22 г (0.1 моль) 1-нонаналя в 50 мл абс. диэтилового эфира. Перемешивали при комнатной температуре 1 ч, охлаждали до 0 оС и осторожно приливали 50 мл воды. Органический слой отделяли, водный экстрагировали эфиром (3x50 мл). Объединенные органические слои сушили М^Б04, упаривали, остаток перегоняли
под вакуумом. Выход 14.67 г (79%), т. кип. 111—113 оС (5 мм рт. ст.). ИК спектр, V, см-1: 3342 ш (ОН), 2953, 2920, 2905, 2853, 1458, 1377, 1125, 1070, 999. Спектр ЯМР *Н, 8, м. д.: 0.84-0.93 м (6Н, 2СН3), 1.18-1.50 м (18Н, 9СН2), 1.72 с (1Н, ОН), 3.57 с (1Н, СНОН) . Спектр ЯМР 13С, 8, м.д.: 14.03 (С1, С12), 18.76 (С2), 22.60 (С11), 25.61 (СН2), 29.25 (СН2), 29.57 (СН2), 29.68 (СН2), 31.82 (С10), 37.45 (С5), 39.59 (С3), 71.57 (С4). Масс-спектр, ш/ (1отн, %): 143 (17), 83 (37), 73 (63), 69 (74), 57 (27), 55 (100), 43 (33), 41 (31).
Для синтеза додекан-4-илацетата смесь 9.32 г (0.05 моль) 4-додеканола, 8.22 г (0.065 моль) абсолютного пиридина и 6.13 г (0.06 моль) уксусного ангидрида перемешивали при комнатной температуре 24 ч, добавляли 100 мл диэтилового эфира, последовательно промывали насыщенными растворами ЫаНСО3 и ЫаС1, сушили М^БО4 и упаривали. Остаток перегоняли под вакуумом. Выход 10.41 г (91%), т. кип. 118-120 оС (7 мм рт. ст.). ИК спектр, V, см-1: 2959, 2926, 2857, 1736 (С=О), 1458, 1437, 1375, 1238, 1126, 1020. Спектр ЯМР *Н, 8, м.д.: 0.84-0.92 м (6Н, 2СН3), 1.17-1.36 м (14Н, 7СН2), 1.44-1.54 м (4Н, 2СН2СНО), 2.02 с (3Н, СН3СО), 4.824.91 (1Н, СНО). Спектр ЯМР 13С, 8, м.д.: 13.85 (С1, С12), 18.47 (С2), 21.07 (СН3С=О), 22.55 (С11), 25.20 (СН2), 29.13 (СН2), 29.39 (СН2), 29.45 (СН2), 31.76 (С10), 34.07 (С5), 36.21 (С3), 74.11 (С4), 170.88 (С=О). Масс-спектр, ш/ (1отн, %): 115 (18), 83 (13), 69 (16), 57 (11), 55 (18), 43 (100), 41 (19).
ИК спектры соединений получали в тонком слое на ИК Фурье-спектрофотометре ШРге8^е-21 БНІМЛОги. Спектры ЯМР *Н и 13С записывали в СЭС13 на приборе Вгикег АМ-300 (рабочая частота 300 и 75.47 МГц соответственно), внутренний стандарт — ТМС. Хроматографический и масс-спектральный анализ полученных соединений проводили на аппаратно-программном комплексе Хроматэк -Кристалл 5000 с масс-селективным детектором Finnigan ЭБО (электронная ионизация при 70 эВ). Использовали капиллярную колонку Кевіек Шх-5ш8 (5% фенил-, 95% диметилполи-силоксан, длина 15 м), температура испарителя 250 оС, температура ионизационной камеры 250 оС. Анализ проводили в режиме программирования температуры от 50 до 250 оС со ско-
ростью 10 оС/мин; газ-носитель — гелий (1.1 мл/мин).
Микроорганизмы выращивали на агари-зованном панкреатическом гидролизате рыбной муки СР-1 при 30 оС в течение 24—72 ч. Выращенную биомассу микроорганизмов, предварительно отмытую фосфатным буфером, трижды обрабатывали ацетоном (1:3 (об/об)): перемешивали, выдерживали 15 мин и отфуго-вывали при 6000 об/мин в течение 10 мин. Полученные обезвоженные клетки микроорганизмов высушивали при комнатной температуре.
Гидролиз эфира клетками микроорганизмов, отмытыми от среды и обработанными органическими растворителями, осуществляли в реакционной смеси следующего состава: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0), содержащий ацетон в различных концентрациях (в зависимости от цели эксперимента); субстрат — 5,0 г/л; биокатализатор — 30 мг/мл. Температура реакции — 30 оС, перемешивание — (180 об./мин).
Концентрацию субстрата определяли в предварительно осветленных центрифугированием (15 мин при 6000 об./мин) пробах методом ГЖХ на хроматографе ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором. Режим анализа: колонка — 3000 х 3 мм с неподвижной жидкой фазой SE-30 5% на хроматоне N-AW, расход газа-носителя (азота) — 30— 37 мл/мин, расход водорода — 30 мл/мин, расход воздуха - 300 мл/мин, температура колонки — 180 оС, температура испарителя - 250 оС.
Литература
1. Зорин В. В., Петухова Н. И., Халимова Л. Х. Регио- и стереоселективная биотрансформация органических соединений / В кн. «Панорама современной химии России. Современный органический синтез»: Сб. обзорных статей.— М.: Химия, 2003.— С. 439—462.
2. Зорин В. В., Петухова Н. И. Клетки микроорганизмов как катализаторы в энантиоселектив-ной трансформации органических соединений. Панорама современной химии. Успехи органического катализа и химии гетероциклов.-М.: Химия, 2006.- С. 280-305.
3. Faber K. Biotransformation in Organic Chemistry. Springer, Berlin, 2000.- 218 p.
4. Патент 01275541. Япония. 1988.
5. Коновалов А. А., Петухова Н. И., Зорин В. В.// БХЖ.- 2000.- Т.7, №5.- С. 49.
6. Мубараков А. И., Петухова Н. И., Гареев В. М., Зорин В. В. // БХЖ.- 2000.- Т.7, №5.-с. 37.
Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы), проект №2.1.2/5048 «Создание научных основ хемо-, регио- и энантионаправленной биотрансформации органических соединений и биоокисления сульфидов металлов»
