CC BY
71
УДК 616.379-008.64-053.2:615.03
ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗИ ПОЛИМОРФИЗМА ILE105VAL ГЕНА GSTP1 С РАЗВИТИЕМ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ДЕТЕЙ В КУРСКОЙ ОБЛАСТИ
© Дедков А. А., Богомазов А. Д., Иванов В.П., Полоников А.В., Булгакова И.В., Куприянова Я.С.
Кафедра педиатрии, кафедра биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, Курск
E-mail: [email protected]
Обследовано 150 детей с атопической бронхиальной астмой (БА) и 150 здоровых детей русской национальности, проживающих на территории Курской области. На примере полиморфизма гена глутатион^-трансферазы GSTP1 исследована вовлеченность ферментов антиоксидантной защиты в патогенез БА у детей. Была установлена ассоциация аллеля 105Val и генотипа 105IleVal гена GSTP1 с повышенным риском развития БА. Стратифицированный анализ позволил выявить ассоциацию аллельного варианта 105Val гена GSTP1 с тяжелым течением астмы. Обнаружена ассоциация аллельного варианта 105Val с риском БА у детей, подвергавшихся пассивному влиянию табачного дыма. Полученные результаты согласуются с исследованиями, демонстрирующими значимую роль генов глутатион-S-трансфераз в предрасположенности к атопической БА.
Ключевые слова: бронхиальная астма, наследственная предрасположенность, глутатион-8-трансфераза P1, анти-оксидантная система.
STUDY OF CONNECTION BETWEEN POLYMORPHISM ILE105VAL OF THE GSTP1 GENE AND RISK OF ATOPIC BRONCHIAL ASTHMA AT CHILDREN OF KURSK REGION Dedkov A.A., Bogomazov A.D., Ivanov V.P., Polonikov A. V., Bulgakova I. V., Kupriyanova Ya.S. Pediatric Department, Biology, Medical Genetics & Ecology Department of the Kursk State Medical University, Kursk
A total of 150 children with atopic bronchial asthma (BA) and 150 healthy children of Russian origin of Kursk region have been observed. On the example of polymorphism of glutathione-S-transferase GSTP1 we investigated the involvement of antioxidant enzymes in the pathogenesis of asthma at children. Allele 105Val and genotype 105IleVal of the GSTP1 gene were associated with increased risk of developing asthma. The stratified analysis has revealed an association of allelic variant 105Val of the gene GSTP1 with severe asthma. Moreover, we found the association of allele 105Val with the risk of asthma at children exposed to secondhand effects of tobacco smoke. These results are in accordance with numerous studies demonstrating the important role of glutathione-S-transferase genes in determining susceptibility to atopic asthma.
Keywords: bronchial asthma, genetic predisposition, glutathione-S-transferase P1, antioxidant system.
Бронхиальная астма (БА) представляет собой мультифакториальное заболевание, в основе которого лежит сложный характер взаимодействия генетических и средовых факторов [8]. По данным многих авторов в последние 20 лет отмечен значительный рост распространенности БА [7, 8]. Особую озабоченность вызывает увеличение показателя заболеваемости БА среди пациентов детского возраста. Частота БА в среднем по Российской Федерации составляет 3-12 %, а в некоторых промышленно-развитых регионах 4-23% [3, 10], Западных странах этот показатель составляет порядка 5 миллионов детей и 10 миллионов взрослых [21]. По всей видимости, рост заболеваемости БА связан с ухудшением экологической ситуации в мире, негативное влияние которой отражается потенцированием эффектов различных классов генов (гены гипереактивности бронхов, атопии, гены гуморального и клеточного иммунитета и др.), для которых доказана связь с предрасположенностью к заболеванию [7, 14]. Учитывая эколого-токсикогенетическую основу развития многих мультифакториальных заболеваний
[9], в том числе и БА, представляется целесообразным изучение вовлеченности генов, патологические эффекты которых на фенотипическом уровне проявляются при влиянии факторов химической природы. К таким генам относятся гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) и, в частности, глутатион-8-трансферазы. Из литературы известны исследования по вовлеченности генов глутатион-8-трансфераз полиморфизма 08ТТ1, 08ТМ1, 08ТР1 при БА как у детей, так и у взрослых [5, 6, 7, 13, 15, 16, 18, 22]. В ряде работ обнаружена связь генов ФБК с развитием БА и её клиническими проявлениями в различных популяциях [12,13]. В Курской популяции также изучалась вовлеченность генов глу-татион-8-трансфераз в формирование предрасположенности к взрослой форме бронхиальной астме [9]. В рамках настоящего исследования впервые в Курской популяции изучена ассоциация полиморфизма 10511е/Уа1 гена 08ТР1 с риском развития атопической БА у детей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для клинического и молекуляр-но-генетического исследования послужила выборка (n=300) из 150 детей с атопической БА и 150 здоровых детей без признаков атопии. Все обследованные дети были русской национальности уроженцы Курской области. Обследование детей, страдающих БА, проводилось на базе ОГУЗ «Областная детская клиническая больница» за период с 2007 по 2010 г. Обследование детей группы контроля проводилось в МУЗ «Городская детская больница № 2 г Курска, проходящих лечение в отделении травматологии в течение того же периода времени. Группы здоровых и больных детей были сопоставимы по полу и возрасту (p>0,05).
Диагноз БА устанавливался согласно критериям ВОЗ [8] на основании клинической картины заболевания, данных анамнеза, лабораторных и инструментальных данных. Диагноз верифицировали на основании данных аллергоанамнеза, результатов скарификационных аллергопроб и измерения сывороточного IgE. В соответствии с классификацией GINA2006 (Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы) [8] больные БА по степени тяжести заболевания подразделялись на 3 группы: 1 - легкая степень диагностирована у 37 (24,7%), 2 - средней степени тяжести у 107 (70,7%) и 3 - тяжелой степени у 7 (4,7%) больных БА. В зависимости от наличия или отсутствия контакта ребенка с табачным дымом - пассивного курения (в квартире ребенка курит хотя бы один из родственников), группа больных БА и контроля разделялись на подгруппы: дети, больные БА, имеющие контакт с табачным дымом (n=87, 58%), дети, больные БА, не имеющие контакта с табачным дымом (n=63, 42%), здоровые дети, имеющие контакт с табачным дымом (n=79, 52,6%), и здоровые дети, не имеющие контакта с табачным дымом (n=71, 47,4%). Факт пассивного курения устанавливался при анкетировании детей и их родителей.
Выделение геномной ДНК осуществляли из размороженной крови стандартным методом фе-нольно-хлороформной экстракции. Генотипиро-вание полиморфизма Ile105Val гена GSTP1 проводили методом ПЦР-ПДРФ согласно протоколу, описанному в литературе [16]. После проведения рестрикционного анализа продуктов ПЦР образовавшиеся фрагменты ДНК разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле с этидиумброми-дом, приготовленном на основе ТВЕ буфера. На рис. 1 представлены результаты электрофорети-ческого разделения фрагментов ДНК, получен-
ных после рестрикции продуктов ПЦР гена 08ТР1, содержащих полиморфизм 11е105Уа1.
Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при тестировании на равновесие Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборках больных БА и здоровых детей использовали критерий с 2 Пирсона. При количестве наблюдений в выборке менее 10 учитывали поправку Йетса на непрерывность. Уровень значимости принимали р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Частоты генотипов полиморфизма 11е105Уа1 гена 08ТР1 в объединенной группе пациентов находились в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга (р>0,05). Распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма 11е105Уа1 гена 08ТР1 представлены в табл. 1. Установлены статистически значимые различия в частотах аллеля 105Уа1 и генотипа 105 11еУа1 между группами здоровых детей и больных БА. У больных атопи-ческой БА детей, в сравнении с контрольной группой, наблюдалось повышенная частота алле-ля 105Уа1 (0Я=1,57 95% С1 1,11-2,22, р=0,01) и генотипа 105 11еУа1 (0Я=1,69 95% С1 1,06-2,70, р=0,03). Анализ частот генотипов здоровых детей и больных БА в зависимости от степени тяжести (табл. 2), показал, что в группе детей больных со средней степенью БА имеет место накопление детей с гетерозиготным генотипом 10511еУа1 (ОЯ=1,81 95%С1 1,09-3,02, р=0,02). Кроме того, гомозиготный мутантный генотип 105Уа1Уа1 ассоциировался с тяжелой степени тяжести БА (ОЯ=12,95 95%С1 2,63-63,82, р=0,001). Как видно из табл. 3, у детей, имевших контакт с табачным дымом (пассивные курильщики), выявлена ассоциация гетерозиготного генотипа 10511еУа1 с повышенным риском развития БА (0Я=2,10 95%С1 1,10-4,01, р=0,02).
Известно, что ген 08ТР1 локализован на хромосоме 11 (1^13) и преимущественно экспрес-сируется в альвеолярных клетках, альвеолярных макрофагах и бронхиолах [11]. Для гена 08ТР1 описано множество однонуклеотидных полиморфизмов, но наиболее хорошо изученными являются: нуклеотидная замена 313А>0 в 5 экзоне гена 08ТР1, проявляющаяся аминокислотной заменой изолейцина 105 на валин (11е105Уа1), а также нуклеотидная замена 341 С>Т в 6 экзоне, проявляющаяся заменой аланина 114 на валин (А1а114Уа1) [11, 18]. В результате указанных несинонимичных аминокислотных замен в структуре 08ТР1 происходит изменение его ферментативной активности, что способствует повышению
Рис. 1. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК, содержащих полиморфизм (11е105Уа1) гена 08ТР1. 1 - 10511е11е («дикий» генотип), 2 - 10511еУа1 (гетерозиготный генотип), 3 - 105Уа1Уа1 (мутантный генотип).
Таблица 1
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма 11е105Уа1 гена 08ТР1 в группах здоровых детей и больных бронхиальной астмой
Распределение частот аллелей исследуемого полиморфизма
Исследуемые группы 10511е 105Уа1
Больные БА (п=150) 0,637 0,363
Здоровые (п=150) 0,733 0,267
Критерий различий, %2 (р) 6,50 (0,01)
Распределение частот генотипов исследуемого полиморфизма
Исследуемые группы 11е/11е 11е/Уа1 Уа1/Уа1
Больные БА (п=150) 60 (40,0%) 71 (47,3%) 19 (12,7%)
Здоровые (п=150) 84 (56,0%) 52 (34,7%) 14 (9,3%)
Критерий различий, %2 (р) 7,69 (0,01) 4,97 (0,03) 0,85 (0,36)
Таблица 2
Распределение частот генотипов полиморфизма 11е105Уа1 гена ОБТР1 среди здоровых детей и больных бронхиальной астмой в зависимости от степени тяжести болезни
Исследуемые группы I группа (п=37) Легкое течение II группа (п=106) Средней степени III группа (п=7) Тяжелое
1/1 1/У У/У 1/1 1/У У/У И !/У У/У
Больные БА п (%) 17 (45,9) 16 (43,2) 4 (10,8) 43 (40,6) 52 (49,1) 11 (10,4) 0 (0,0) 3 (42,9) 4 (57,1)
Здоровые дети п (%) 84 (56,0) 52 (34,7) 14 (9,3) 84 (56,0) 52 (34,7) 14 (9,3) 84 (56,0) 52 (34,7) 14 (9,3)
Критерий различий, с2 (р) 1,21 (0,27) 0,94 (0,83) 0,00 (0,97) 5,92 (0,01) 5,33 (0,02) 0,08 (0,78) 6,33 (0,01) 0,00 (0,97) 10,72 (0,001)
уровня гидрофобных промежуточных реактивных метаболитов ксенобиотиков в тканях и органах, в том числе и в бронхолегочной системе. В частности, вариантный аллель 105Уа1 в 3 раза снижает активность фермента в отношении к детоксика-
ции некоторых ксенобиотиков, в частности 1-хлор-2,4-динитробензина [17, 23].
В рамках проведенного исследования нами установлена ассоциация аллельного варианта 105Уа1 с повышенным риском развития атопиче-ской бронхиальной астмы у детей в курской по-
Таблица 3
Распределение частот генотипов полиморфизма 11е105Уа1 гена ОБТР1 среди здоровых детей и больных бронхиальной астмой в зависимости от контакта с табачным дымом
I группа II группа
Исследуемые Дети, не имевшие контакта с табач- Дети, имевшие контакт с табачным
группы ным дымом дымом
I/I I/V V/V I/I I/V V/V
Больные БА 27 26 10 33 45 9
п / % (42,9) (41,3) (15,9) (37,9) (51,7) (10,3)
Здоровые дети 46 28 5 38 24 9
п / % (58,2) (35,4) (6,3) (53,5) (33,8) (12,7)
Критерий разли- 3,31 0,50 2,44 3,84 5,10 0,04
чий, с2 (р) (0,07) (0,48) (0,12) (0,05) (0,02) (0,84)
пуляции. Кроме того, гомозиготный вариантный генотип 105ValVal ассоциировался с тяжелым течением астмы у детей. В целом результаты нашего исследования согласуются с данными других исследований, проведенных в других популяциях мира, и демонстрируют важную роль генов данного класса ферментов в детерминации предрасположенности к бронхиальной астме [2, 5, 6, 7, 12]. Поскольку GSTP1, являясь ключевым ферментом второй фазы биотрансформации ксенобиотиков, снижение его активности может способствовать нарушению детоксикации реактивных метаболитов ксенобиотиков и продуктов окислительного стресса. Накопление в тканях респираторной системы генотоксических, промежуточных, электрофильных метаболитов способно негативно влиять на тучные клетки, вызывая их дегрануляцию и как следствие развитие гиперчувствительности и гиперреактивности бронхов [1, 5]. Следует также добавить, что в ряде работ установлено участие глутатион^-трансфераз в синтезе метаболитов арахидоновой кислоты, вызывающих бронхоспазм и приводящих к хроническому воспалению бронхов - одному из важных звеньев патогенеза БА [5]. Закономерным является тот факт, что патологическое влияние данного гена проявляется при воздействии на детей табачного дыма, что является типичным примером генно-средового взаимодействия, лежащего в основе любого мультифакториального заболевания. Табачный дым содержит около 4000 соединений, включая хиноны, дегалоалкены, ароматические амины, полиароматические углеводы, подвергающиеся метаболизму in vivo и являющиеся субстратами ФБК, в том числе и GST [2]. Кроме того, курение стимулирует накопление активных форм кислорода, инициирующих активацию ядерный транскрипционного фактора транскрипции NF-kB, контролирующий биосинтез провоспалительных цитокинов [2]. Хотя дисбаланс процессов детоксификации/токсификации ксенобиотиков может способствовать ранней сен-
сибилизации организма и, как следствие, закладывать основу предрасположенности к развитию БА в детском возрасте, конкретные молекулярные механизмы, лежащие в данного феномена, а также их сопряженность с системой детоксикации потребует в дальнейшем более детального исследования.
Данная работа выполнена в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э. и др. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину). - СПб.: Интермедика, 2000. - 272 с.
2. Вавилин В.А., Часовникова О.Б., Ляхович В.В. и др. Генетический полиморфизм глутатион-S-трансферазы M1 и T1 у детей, больных бронхиальной астмой // Вопросы медицинской химии. -2000. - Т. 46, № 4. - С. 388-397.
3. Детская аллергология. Руководство для врачей. / под ред. А. А. Баранова, И.И. Балаболкина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 688 с.: ил.
4. Желенина Л.А., Иващенко Т.Э., Ефимова Н.С. и др. Полиморфиз генов семейства глутатион-S-трансферазы (GST) при бронхиальной астме у детей // Вопросы медицинской химии. - 2000. -Т. 46, № 4. - С. 13-16.
5. Иванов В.П., Полоников А.В., Солодилова М.А. и др. Анализ ассоциации делеционных полиморфизмов генов глутатион^-трансфераз GSTT1, GSTM1 с предрасположенностью к бронхиальной астме и особенностям ее клинических проявлений в курской популяции // Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". -2005. - № 3. - С. 49-55.
6. Ляхович В.В., Вавилин В.А., Макарова С.И. и др. Роль ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к бронхиальной астме и формировании особенностей ее клинического фенотипа // Вестник Российской академии наук. -2000. - Т. 41, № 12. - С. 36-41.
7. Национальная программа «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика». 3-е изд., испр. и доп. - М.: Издательский дом «Атмосфера», 2008. - 13 с.
8. Полоников А.В., Иванов В.П., Солодилова М.А. Эколого-токсикогенетическая концепция мульти-факториальных заболеваний: от понимания этиологии до клинического применения // Медицинская генетика. - 2008. - № 11. - С. 3-10.
9. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биохимических и медицинских исследованиях. - М.: Медицина, 1975. - 296 с.
10. Board P.G., Webb G.C., Coggan M. Isolation of cDNA clone and localization of the human glutathione S-transferase 3 on chromosome bands 11q13 and 12q13-14 // Ann. Hum. Genet. - 1989. - Vol. 53. -P. 205-213.
11. Carroll W.D., Lenney W., Child F. et al. Maternal glutathione S-transferase GSTP1 genotype is a specific predictor of phenotype in children with asthma // Pediatr Allergy Immunol. - 2005. - Vol. 1, N 16. -P. 32-39.
12. Cristina E., Mapp M.D., Anthony A. et al. Glutathione S-transferase GSTP1 is a susceptibility gene for occupational asthma induced by isocyanates // Environmental and Occupational Disorders. - 2002. - P. 274.
13. Demoly P., Mathieu M., Curiel J.E. et al. Gene therapy strategies for asthma // Gene Therapy. - 1997. -Vol. 77. - P. 62-64.
14. Finotti A., Costa E., Silva R. et al. Glutathione S-transferase M1 and T1 polymorphism in men with idiopathic infertility // Genet. Mol. Res. - 2009. - Vol. 8, N 3. - P. 1093-1098.
15. Fryer A.A., Bianco A., Hepple M. et al. Polymorphism at the glutathione S-transferase GSTP1 locus. A new marker for bronchial hyperresponsiveness and asthma // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2000. - Vol. 161. -P. 1437-1442.
16. Ishii T., Matsuse T., Teramoto S. et al. Glutathione S-transferase P1 (GSTP1) polymorphism in patients with chronic obstructive pulmonary disease // Thorax. - 1999. - Vol. 54. - P. 693-696.
