Исследование рецептора VEGFR1 на интактных ядрах Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»



108 МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

фективного и доступного для практического применения рону первых. Ключевым белком, стимулирующим образо-метода, а при его неэффективности необходимо допол- вание кровеносных сосудов, является фактор роста нять лечение введением в серозную полость аллогенных эндотелия сосудов (VEGF), а его эффекты определяются ЛАК-клеток. взаимодействием с соответствующим рецептором. Наиболее противоречива информация о VEGFR1: до сих пор А.С. Тихомиров1-2, Л.Г. Деженкова1, А.Е. Щекотихин12 точно не установлена ни его функция, ни клеточная лока-ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА лизация. Различные изоформы этого рецептора могут про-АНТРАФУРАНКАРБОКСАМИДОВ, являть противоположные свойства. Полноразмерный мем-СОДЕРЖАЩИХ CF3-ГРУППУ В ПОЛОЖЕНИИ 2 браносвязанный mVEGFRl способствует правильному ФГБНУ«НИИНА им. Г.Ф. Гаузе», Москва; созреванию кровеносных сосудов в эмбриогенезе, а рас-2ФГБОУВПО «РХТУ им. Д.И. Менделеева», Москва творимый sVEGFRl подавляет ангиогенез. Помимо «сосу-Введение. Антрафурандион-3-карбоксамиды высоко- дистых» функций, VEGFR1 экспрессируется многими активны в отношении ряда культур опухолевых клеток, опухолевыми клетками и ответственен за их выживание, в том числе резистентных, a наиболее активное производное миграцию, инвазию и метастазирование. Установление ЛХТА-2034 (Щекотихин А. Е. и др. Патент РФ № 2554939, точной локализации VEGFR1 в опухолевых клетках позво-2015) прошло доклинические исследования и рекомендо- лит в будущем рассматривать его как перспективную ми-вано для проведения I стадии клинических испытаний. шень в терапии злокачественных новообразований. Цель исследования — синтез аналогов антрафурандио- Цель исследования — выявить и установить локализа-на ЛХТА-2034 и исследование влияния трифторметильно- цию белка VEGFR1 в опухолевых клетках. го заместителя в положении 2 на способность новых со- Материалы и методы. В работе использованы линии единений блокировать рост опухолевых клеток и работу опухолевых клеток человека различного гистогенеза: A431, топоизомеразы 1. A549, Sn12c. Ведение культур осуществляли по стандарт-Материалы и методы. ЛХТА-2251 — новый аналог пре- ной методике. Оценку уровня экспрессии гена VEGFR1 парата ЛХТА-2034, содержащий CFj-группу в положении проводили методом полимеразной цепной реакции 2 гетероцикла, получен конденсацией 4,11-дигидрокси-5,10- с обратной транскрипцией. Наличие белка в целых клетках диоксо-2-трифторметилантра[2,3-6]фуран-3-карбоновой регистрировали с помощью иммуноцитохимического (ИЦХ) кислоты [Тихомиров А. С. и др. Химия гетероциклических исследования и непрямой реакции иммунофлуоресценции соединений 2014; (2):298] и циклического диамина. Анти- (РИФ) с последующим анализом на проточном цитофлу-пролиферативную активность веществ определяли в МТТ- ориметре. Вклад ядерной локализации VEGFR1 оценива-тесте на опухолевых клетках меланомы B16, миелоидного ли разработанным методом РИФ с экстрагированными лейкоза человека К562 и карциномы кишечника HCT116. интактными ядрами. Влияние на активность топоизомеразы 1 (Promega, США) Результаты. Во всех трех клеточных линиях обнаруже-изучали в реакции релаксации суперскрученной плазмиды на базальная экспрессия гена VEGFR1. По данным ИЦХ-pBR322 (Fermentas, Литва). исследования также было установлено, что все перечислен-Результаты. Новый 2-CF3-антрафурандион ЛХТА-2251 ные линии содержат белок VEGFR1, причем наибольшее обладает более высокой растворимостью по сравнению количество зафиксировано в клетках A431. В связи с этим с ЛХТА-2034, однако модификация метильной группы указанная линия была выбрана для детальных исследовав CF^^^^ приводит к 5-10-кратному снижению актив- ний. РИФ с интактными клетками A431 показала практи-ности препарата ЛХТА-2251 в отношении тестируемых чески полное отсутствие VEGFR1 на цитоплазматической линий клеток. Изучение влияния веществ на работу топо- оболочке (не более 2,7 %), однако после пермеабилизации изомеразы 1 показало, что новый антрафурандион ЛХ- метанолом уровень сигнала возрос до 47,0 %. С целью ТА-2251 также уступает в способности блокировать актив- уточнения внутриклеточной локализации VEGFR1 оце-ность фермента соединению ЛХТА-2034. нивали количество белка снаружи и внутри ядра. В связи Заключение. Замена метильной группы в положении 2 с этим была разработана методика выделения интактных антрафуран-3-карбоксамидов на трифторметильную по- ядер для РИФ. Результаты экспериментов свидетельствуют вышает растворимость производных данного химического о присутствии VEGFR1 на наружной ядерной мембране класса, однако приводит к падению антипролиферативных (5,0 %), однако значительно большее количество белка свойств, что коррелирует со снижением их способности зарегистрировано внутри ядра (18,4 %). ингибировать топоизомеразу 1. Заключение. Полученные данные по выяснению лока-Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ лизации VEGFR1 позволят подбирать адекватные способы в рамках научного проекта № 16-33-00908мол_а. ингибирования его активности, что может привести к снижению злокачественного потенциала опухоли и степени ее Е.Г. Тырсина, С. И. Никулицкий, О.О. Рябая, А.Н. Иншаков васкуляризации. ЛОКАЛИЗАЦИЯ РЕЦЕПТОРА VEGFR1 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА Е.Г. Тырсина, С.И. Никулицкий, А.Н. Иншаков ФГБУ«РОНЦим. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва ИССЛЕДОВАНИЕ РЕЦЕПТОРА VEGFR1 Введение. Любые нарушения регуляции ангиогенеза НА ИНТАКТНЫХ ЯДРАХ приводят к тяжелым последствиям. В опухоли баланс про- ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» ангиогенных и антиангиогенных факторов сдвинут в сто- Минздрава России, Москва

№1 / том 15 / 2016 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

МАТЕРИАЛЫ КОНФЕРЕНЦИИ «ОТЕЧЕСТВЕННЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ ПРЕПАРАТЫ»

109

Введение. Целью многих исследований является регистрация интересующих клеточных белков. Многие годы эту задачу с успехом позволяет реализовать метод проточной цитофлуориметрии. Вместе с тем проточная цитометрия дает возможность детектировать антигены либо на наружной поверхности клетки, либо внутри нее после пермеабилизации. Однако даже регистрация соответствующего протеина внутри клетки не позволяет судить о его распределении по клеточным компартмен-там. Для решения вопроса о точной внутриклеточной локализации белка применяют вестерн-блоттинг и им-муноцитохимическое исследование, но данные методики являются полуколичественными и трудно сопоставимы с результатами проточной цитометрии. Поэтому возникает необходимость расширить возможности проточной цитометрии, а именно — разделить сигналы от различных компартментов клетки. Такая возможность даст экспериментаторам более тонкий инструмент оценки клеточной реакции на то или иное воздействие.

Цель исследования — оценка количественного содержания рецептора фактора роста эндотелия сосудов 1-го типа (VEGFR1) в интактных ядрах методом непрямой реакции иммунофлуоресценции с помощью проточной ци-тофлуориметрии.

Материалы и методы. Изучали белок VEGFR1. Контрольной для данного протеина была выбрана клеточная линия эпидермоидной карциномы человека A431. В целях идентификации VEGFR1 использовали следующие первичные и вторичные антитела: мышиные анти-VEGFR! #MAB321 (R&D Systems) и козьи антимышиные поликло-нальные IgG: FITC #STAR70 (AbD Serotec). Для контроля отсутствия цитозольной примеси в ядерном экстракте в качестве первичных применяли кроличьи антитела к Р-актину #4970L (Cell Signaling Technology), а вторичных — козьи антикроличьи IgG: Alexa Fluor 488 #A-11008 (Invitrogen). Интактность ядер оценивали, анализируя мазки из полученной суспензии, окрашенные азуром и гематоксилином по Майеру.

Результаты. Полученные данные подтвердили, что разработанный нами метод экстракции, очистки и стабилизации ядер подходит для их исследования на проточном цитофлуориметре. Антигены VEGFR1, расположенные на наружной ядерной мембране, оказались доступными для связывания со специфическими антителами (4,9 %). После пермеабилизации кариолеммы метанолом VEGFR1 регистрировался и внутри ядра (18,4 %). В обоих случаях доля ядер, неспецифически связавшихся с вторичными антителами, не превышала 0,1 %. Чистота ядерной фракции по критерию отсутствия цитоплазматического белка Р-актина составляла более 99 %. Эти данные были подтверждены результатами микроскопического исследования окрашенных препаратов. При точном соблюдении условий результаты ряда независимых экспериментов хорошо воспроизводились.

Заключение. Разработанный нами метод экстракции, очистки и стабилизации ядер пригоден для идентификации ядерных белков на проточном цитофлуориметре.

Б. С. Федоров, М.А. Фадеев, А. Б. Еремеев, Н.П. Коновалова, С.А. Гончарова, Т.А. Раевская, Д. В. Мищенко ГИБРИДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ ДИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В КАЧЕСТВЕ ХЕМОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ В КОМБИНИРОВАННОЙ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ФГБУНИПХФ РАН, Черноголовка, Московская область

Введение. Особый интерес представляют попытки снижения побочных эффектов противоопухолевых химиопре-паратов посредством использования в комбинированной химиотерапии малотоксичных хемосенсибилизаторов. Однако выявление таких хемосенсибилизаторов носит случайный характер и не поддается систематизации и выявлению классов веществ с такими свойствами. В этой связи поиск новых низкотоксичных противоопухолевых или адъювант-ных средств, которые бы могли резко понизить терапевтические дозы цитостатиков с сохранением терапевтических характеристик, является важнейшей задачей проводимых исследований в области онкологии.

Цель исследования — осуществить синтез, изучить противоопухолевое действие и возможность использования оксиамидов дикарбоновых кислот в качестве адъювантных средств (или хемосенсибилизаторов) в комбинированной цитостатической терапии раковых опухолей в сочетании с цитостатиками.

Материалы и методы. Работа выполнена на мышах-самцах линии ВОБ1 массой тела 22—24 г. Содержание животных и эксперименты осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием лабораторных животных» (приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.1977). В качестве критериев эффективности были использованы количество выживших животных по истечении 60 сут наблюдения после начала терапии, средняя продолжительность жизни (СПЖ) и увеличение СПЖ. Степень ингибирования роста опухоли определяли по торможению ее роста. Рассчитывали также индекс ингибирования метастазов, который позволяет оценить степень метастатического поражения

Результаты. Использование в комбинированной цито-статической терапии гидроксиамидов щавелевой, винной и малеиновой кислот в сочетании с цисплатином или ци-клофосфамидом обеспечивают 100 % выживаемость лей-козных животных, а также полное ингибирование процессов метастазирования при экспериментальных меланоме В16 и карциноме легких Льюис. Следовательно, можно предположить, что нами получены таргетные препараты, которые способны дезактивировать гистондеацетилазу — фермент, участвующий в синтезе ДНК опухолевых клеток. В продолжение этих работ нами синтезированы гибридные соединения на основе дикарбоновых кислот и аминокислот, некоторые из них обеспечивают 50 % выживаемость животных, увеличение СПЖ оставшихся животных составляет 200 %.

Заключение. Таким образом, поиск новых биогенных хемосенсибилизаторов (таргетных препаратов) является многообещающей стратегией в экспериментальной химиотерапии злокачественных новообразований.

№1 / том 15 / 2016

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ