CC BY
13
Исследование иммунного ответа у мышей линии BALB/c при многократном питании на них клещей Ixodes persulcatus
Е.В. Зырина1 ([email protected]), А.В. Штанников1, И.С. Васильева2, В.П. Гутова2, В.В. Фирстова1, О.Н. Перовская1, С.Ф. Бикетов1
1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», пос. Оболенск, Московская обл. 2НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ГБОУ ВПО «Первый Московский ГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России
Резюме
Проведено исследование иммунного ответа у мышей линии BALB/c при многократном кормлении на них нимф Ixodes persulcatus. Максимальный иммунный ответ наблюдали после трехкратного насыщения нимф. У сенсибилизированных мышей выявили изменения количества субпопуляций активированных Т- и В-лимфоцитов: CD19+ CD69+, CD3+ CD69+, CD19+ TLR-2+ и титра специфических антител. Количество напитавшихся и отпавших клещей при кормлении на сенсибилизированных мышах было снижено примерно в 1,5 раза.
Ключевые слова: антиклещевые вакцины, антиклещевой иммунитет, экстракт слюнных желез клещей, антитела, Т- и В-лимфоциты, клеточные маркеры
The Investigation of Immune Response by Repeated Ixodes Persulcatus Ticks Feeding at Line BALB/c Mice
E.V. Zyrina1 ([email protected]), A.V. Shtannikov1, I.S. Vasilyeva2, V.P. Gutova2, V.V. Firstova1, O.N. Perovskaya1, S.F. Biketov1 1State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, settlement Obolensk, Moscow region
2Science Research Institute of Medical Parasitology and Tropical Medicine of State Educational Institution of Higher Professional Training I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation Abstract
The Investigation of immune response by repeated ticks Ixodes persulcatus feeding at line BALB/c mice have done. The maximum immune response was observed after three-time feed of nymph. Sensitized mice had changing quantity of subpopulations of activated T- and B-lymphocytes: CD19+ CD69+, CD3+ CD69+, CD19+ TLR-2+ and specific antibodies titre. Number of saturated and fall down Ticks had lowered about in 1.5 time.
Key words: anti-tick vaccines, anti-tick immunity, Salivary gland extract of tick, antibodies, T- and B-lymphocytes, cell's markers
Введение
Иксодовые клещи могут быть переносчиками одновременно ряда возбудителей, в том числе клещевого энцефалита, клещевых боррелиозов, рик-кетсиозов, туляремии и эрлихиозов [1]. В связи с этим присасывание клещей создает риск заражения человека патогенами различной природы.
К настоящему времени проявляется значительный интерес к разработке антиклещевых вакцинных препаратов, препятствующих питанию клещей и заражению хозяина. Возможность создания таких вакцин подтверждается существованием естественного антиклещевого иммунитета, что было установлено у ряда млекопитающих и у людей, проживающих в эндемичных по клещевым трансмиссивным заболеваниям районах [2]. Также было показано в лабораторных условиях, что животные, на которых проводят неоднократное кормление клещей, становятся сенсибилизированными к не-
которым клещевым антигенам [3]. Для создания вакцины, индуцирующей антиклещевой иммунитет, необходимо выявить потенциально протективные клещевые антигены. Одним из подходов для этого служит изучение особенностей иммунного ответа, возникающего у мышей при кормлении на них клещей, и разработка методов для скринингового тестирования.
Считается, что эффективная антиклещевая вакцина должна содержать несколько антигенов клещей, индуцирующих гуморальный и клеточный иммунный ответ организма хозяина. За счет кооперативной работы нескольких антигенов такая антиклещевая вакцина сможет обеспечить эффективную протекцию от клещевой инвазии и инфицирования переносимыми патогенами. Поскольку слюна является основным эффектором при питании клещей, именно компонентам слюны уделяется основное внимание как к источнику протективных
антигенов. Компоненты слюны клещей оказывают значительное иммуномодулирующее воздействие на организм млекопитающих, что способствует более эффективному питанию клещей и передаче ими возбудителей инфекции [4 - 8]. Поэтому важным этапом конструирования эффективной антиклещевой вакцины станет оценка способности компонентов слюны клещей к формированию антиклещевого иммунитета. В качестве объекта исследования мы выбрали клещей I. persulcatus, так как представители этого вида доминируют на значительной части территории России, а функциональные свойства компонентов их слюны, в частности, иммуногенность, остаются наименее изученными среди представителей рода Ixodes.
Цель настоящей работы - исследование иммунного ответа к компонентам слюнных желез I. persulcatus, формирующегося многократным кормлением нимф клещей на мышах линии BALB/c.
Материалы и методы
Сенсибилизация мышей. Мышей линии BALB/c (питомник лабораторных животных «Пущино» ИБХ) в возрасте 10 - 12 недель (18 - 20 г) сенсибилизировали питанием на них нимф клещей (30 нимф/мышь) из чистой лабораторной культуры I. persulcatus (НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины). 2-й и 3-й напуски проводили с 2-недельным восстановительным интервалом. После каждого напуска подсчитывали количество и определяли вес отпавших клещей (весы электронные EP214C «OHAUS Europe», Швейцария). Опытные и контрольная (без напуска клещей) группы состояли из 10 мышей каждая.
Получение экстракта слюнных желез (ЭСЖ). Слюнные железы (25 пар) частично напитавшихся в течение 72 часов самок I. persulcatus помещали в охлажденный фосфатно-солевой буфер (ФСБ), гомогенизировали на ультразвуковом дезинтеграторе («VirSonic 100», США) 10 циклами озвучивания (30 с. импульсы, 30 с. перерыв) на ледяной бане. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием (10000g/10 min 4 0С). Супернатант фильтровали (фильтр с диаметром пор 0,22 jm). Концентрацию белка в ЭСЖ определяли, с использованием набора Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit («Sigma-Aldrich», США) на анализаторе VICTOR™X3 («PerkinElmer», США) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.
Приготовление материала от животных. Забор селезенок и крови для получения сывороток от мышей проводили через две недели после каждого напуска клещей. Клеточные суспензии спленоци-тов, приготовленные из селезенок 5 мышей каждой группы [9], разводили в полной питательной среде RPMI 1640 до концентрации 2 х 106 клеток/мл и культивировали в 96-луночных планшетах при 37 0С, во влажной атмосфере 5% СО2 в течение 48 часов.
При оценке сенсибилизированности клеток к ЭСЖ в состав питательной среды дополнительно
включали митоген-активаторы (МА) - конканава-лин А (5 мкг/мл) или ЛПС (10 мкг/мл) («Sigma-Aldrich», США) для определения функционального состояния.
В качестве контроля служили клетки без ЭСЖ и без МА.
Цитометрические методы исследования. Кле-точно-опосредованный ответ определяли по изменению количества субпопуляций лимфоцитов: активированных T-(CD3+ CD69+) и B-(CD19+ CD69+) лимфоцитов; Т-лимфоцитов, несущих CD28 рецептор (CD3+ CD28+); В-лимфоцитов, несущих TLR-2 рецепторы (CD19+ TLR-2+). Для этого клеточных суспензий окрашивали моноклональными антителами CD19-APC, CD3-PerCP («BD Pharmingen™», США), CD69-FITC («CALTAG™ Invitrogen», США), CD28-FITC («Beckman coulter», США), TLR-2-FITC («Hycult Biotech», США) согласно инструкциям фирмы-производителя. Измерения проводили на ци-тометре FACSCalibur в программе «CellQuestPro». Для оценки результатов использовали формулу: ИС = А/Б, где ИС - индекс стимуляции; А - процент субпопуляций клеток, культивируемых в среде с митогеном и различными концентрациями ЭСЖ; Б - процент субпопуляций клеток, культивируемых в среде RPMI 1640.
Определение титра антител. ЭСЖ в концентрации 10 мкг/мл по белку адсорбировали в 96-лу-ночных планшетах («Greiner bio-one», Германия) в количестве 1 мкг/лунка в течение ночи, при 4 0С. Планшеты блокировали 5%-ным обезжиренным молоком (37 0С, 1 час). После промывки в фос-фатно-солевом буфере с 0,05% Tween-20 (ФСБ-Т), планшет инкубировали с сыворотками мышей в разведениях 1:5; 1:10; 1:20; 1:40; 1:80 (37 0С, 1 час). После трехкратной отмывки ФСБ-Т планшет инкубировали в растворе рабочего разведения антивидовых иммуноглобулинов (IgG, «Sigma-Aldrich», США), конъюгированных с пероксидазой хрена (37 0С, 1 час). После отмывки ФСБ-Т проводили окрашивание раствором субстрата для пе-роксидазы хрена ортофенилендиамином («Sigma-Aldrich», США) с добавлением перекиси водорода до 0,03%. Реакцию останавливали раствором 1М серной кислоты. Оптическую плотность регистрировали в лунках планшета при длине волны 492 нм на анализаторе VICTOR™X3 («PerkinElmer», США).
Формирование иммунного ответа характеризовали по количеству субпопуляций лимфоцитов, несущих на своей поверхности разные типы клеточных рецепторов CD69, TLR-2, CD28. Выбор данных маркеров обусловлен тем, что по данным литературы [10 - 12]:
• CD69 экспрессируется на поверхности активированных лимфоцитов уже на ранних стадиях и может быть зарегистрирован через 6 - 8 часов.
• Количество TLR - сигнальных рецепторов -коррелирует с продукцией В-лимфоцитами специфических антител, а TLR-2 являются одними из основных рецепторов, участвую-
щих в активации иммунных клеток, например при боррелиозе. • CD28 Т-клеточный рецептор имеет существенное значение для взаимодействия Т-лимфоцита с антигенпрезентирующими клетками и их активации.
В качестве специфического активатора в клеточных тестах использовали ЭСЖ. Для усиления ответа применяли конканавалин А или ЛПС (липопо-лисахарид бактериальный).
Оценка результатов. Каждое измерение проводили в трех повторах. Достоверность различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости Р < 0,05.
Результаты и обсуждение
Определение количества CD69+ активированных лимфоцитов. ЭСЖ в культуре МА интактных спленоцитов (контрольные клетки) оказывал имму-носупрессирующее действие на количество CD69+ активированных лимфоцитов, что было установлено в предварительных исследованиях [13].
Присутствие ЭСЖ в культуре МА сенсибилизированных спленоцитов приводило к специфической активации лимфоцитов и увеличению субпопуляции клеток CD69+, а иммуносупрессирующее действие экстракта регистрировали лишь при его максимальной концентрации (50 мкг/мл). В тех вариантах, где ЭСЖ оказывал супрессирующее действие на субпопуляции сенсибилизированных лимфоцитов, количество клеток CD69+ значительно превышало контрольный показатель.
С увеличением кратности насыщения клещей на мышах наблюдали возрастание показателя ИС Т-лимфоцитов в присутствии/отсутствии in vitro ЭСЖ (табл. 1). Так, например, если после первого насыщения нимф клещей на мышах ИС субпопуляции Т-лимфоцитов CD69+ сопоставим с контролем, то в результате 2-й и 3-й сенсибилизации
он прогрессивно возрастает. В то же время ИС В-лимфоцитов уже после первого насыщения клещей значительно увеличился по сравнению с контролем. В последующем после второго и третьего насыщений ИС В-лимфоцитов в присутствии/отсутствии в культуральной среде ЭСЖ не возрастал (см. табл. 1).
Увеличение количества CD69+ активированных лимфоцитов in vitro от сенсибилизированных животных подтверждает формирование у них иммунного ответа. Использование CD19+ затруднительно для оценки динамики развития иммунного ответа при сенсибилизации повторными напусками клещей.
Определение количества CD28+ активированных лимфоцитов. Было установлено значительное увеличение экспрессии CD28 корецептора на сенсибилизированных Т-лимфоцитах по сравнению с интактными Т-лимфоцитами. Однако в присутствии в культуральной среде ЭСЖ, как специфического активатора, достоверных изменений ИС у опытных и контрольных клеток не выявили (табл. 2).
Определение количества TLR-2+ активированных лимфоцитов. У сенсибилизированных животных по сравнению с интактными установили достоверное увеличение количества субпопуляций TLR-2+ В-лимфоцитов in vitro в присутствии/отсутствии ЭСЖ в культуральной среде, что указывает на наличие корреляции между увеличением TLR-2+ В-лимфоцитов и сенсибилизацией мышей (табл. 3).
Оценка гуморального иммунитета методом ИФА показала, что у мышей после трехкратной сенсибилизации титр антител к ЭСЖ составил в среднем 1:10 и превышал аналогичные показатели в сыворотках мышей после их одно- и двухкратной сенсибилизации (рис. 1).
Полученные нами результаты по изменению экспрессии поверхностных рецепторов у лимфоцитов свидетельствуют об иммуномодулирующем
Таблица 1.
ИС субпопуляций лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные рецепторы CD69, в 48-часовой культуре спленоцитов под действием ЭСЖ I. persulcatus
Субпопуляции лимфоцитов Количество циклов кормления ИС лимфоцитов митогенами (без ЭСЖ) ИС лимфоцитов митогенами при различных концентрациях ЭСЖ
5 мкг/мл 25 мкг/мл 50 мкг/мл
CD3+ CD69+ Т-лимфоциты контрольных мышей - 6,91 2,56* 3,43* 2,99*
CD3+ CD69+ Т-лимфоциты сенсибилизированных мышей однократно двухкратно трехкратно 5,92 16,12* 21,98* 3,09 14,04* 24,30* 3,34 11,31* 23,59* 3,27 5,76 25,54*
CD19+ CD69+ В-лимфоциты контрольных мышей - 10,48 13,38 9,16 5,61*
CD19+ CD69+ В-лимфоциты сенсибилизированных мышей однократно двухкратно трехкратно 25,26* 16,9 19,6 29,37* 17,50 18,74 27,32* 15,23 17,95 14,26 9,48 12,05
Примечание: *Cтатистически значимое различие по сравнению с контролем (ИС митогенами без ЭСЖ) при P < 0,05.
Таблица 2.
ИС субпопуляций CD28+ лимфоцитов у трехкратно сенсибилизированных мышей и влияние на него ЭСЖ I. persulcatus, в 48-часовой культуре спленоцитов
Субпопуляции лимфоцитов ИС лимфоцитов митогенами (без ЭСЖ) ИС лимфоцитов митогенами с ЭСЖ (25 мкг/мл)
CD3+ CD28+ Т-лимфоциты контрольных мышей 1,23 1,33
CD3+ CD28+ Т-лимфоциты сенсибилизированных мышей 10,65* 1,2
Примечание: *Cтатистически значимое различие по сравнению с контролем (ИС митогенами) при P < 0,05. Таблица 3.
ИС субпопуляций TLR-2+ лимфоцитов у трехкратно сенсибилизированных мышей и влияние на него ЭСЖ I. persulcatus, в 48-часовой культуре спленоцитов
Субпопуляции лимфоцитов ИС лимфоцитов митогенами (без ЭСЖ) ИС лимфоцитов митогенами с ЭСЖ (25 мкг/мл)
CD19+ TLR-2+ В-лимфоциты контрольных мышей 1,7 0,6*
CD19+ TLR-2+ В-лимфоциты сенсибилизированных мышей 3,5* 3,45*
Примечание: *Cтатистически значимое различие по сравнению с контролем (ИС митогенами) при P < 0,05.
Рисунок 1.
Изменение IgG в сыворотках мышей с различной кратностью кормления на них клещей I. persulcatus. 1-х, 2-х и 3-кратное питание нимф клещей. Разведение сыворотки 1:10
0,200
0,180
0,160
0,140
0,120
0,100
с
о
ci 11 0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
Контроль
1x
2x
3x
действии компонентов слюны, что прослеживается при изменении ИС. При повторных кормлениях установлены различия в количестве сенсибилизированных субпопуляций лимфоцитов по сравнению с контрольными, что свидетельствует о развитии иммунного ответа. Следует отметить, что хотя после однократного насыщения нимф количество сенсибилизированных клеток CD19+ и CD69+ значительно увеличивалось, количество лимфоцитов CD3+ CD69+ не изменялось. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что троекратное
кормление в нашей модели является минимальным режимом, поскольку ИС сенсибилизированных В- и Т-лимфоцитов достоверно отличался от контрольных показателей. Это же подтверждает анализ титра антител.
Для определения in vitro специфичности формируемого иммунного ответа оптимальной концентрацией ЭСЖ была 25 мкг/мл. Повышение концентрации ЭСЖ до 50 мкг/мл в культуре вызывало супрессирующее действие даже на сенсибилизированные лимфоциты.
При подсчете количества отпавших клещей и их взвешивании определили, что при первом напуске насыщение нимф достигалось в более короткие сроки по сравнению с последующими. На 3 - 4 день питания при первичном кормлении отпадало обычно 70% всех насытившихся клещей. При увеличении числа кормлений эта цифра снижалась до 49%. Статистически значимых различий в массе тела клещей в трех пассажах отмечено не было. Прогрессивный рост времени, необходимый для насыщения и отпадения клещей, является внешним критерием, подтверждающим формирование антиклещевого иммунитета у экспериментальных животных при последующих напусках.
Таким образом, наряду с оценкой уровня сенсибилизации мышей in vitro и in vivo, была впервые проведена оценка антигенности слюны I. persulcatus. Полученные результаты указывают на необходимость и перспективность фракциони-
рования компонентов слюны для идентификации иммунодоминатных белков.
Выводы
1.
2.
3.
4.
При повторных кормлениях на мышах линии BALB/c изучены некоторые стадии развития иммунного ответа против компонентов слюнных желез клещей I. persulcatus. Критерием сенсибилизированности мышей может служить ИС субпопуляций CD3+ CD69+ и CD19+ TLR-2+ под действием ЭСЖ in vitro, а также оценка гуморального звена (методом ИФА) иммунной системы.
Учитывая силу клеточного и гуморального ответа для сенсибилизации мышей линии BALB/c, необходимо не менее трех напусков на них клещей. Формирование протективного иммунного ответа у животных подтверждает прогрессивный рост времени, необходимого для насыщения клещей при последующих 2 - 3 напусках. Ш
Литература
1. Коренберг Э.И. Изучение и профилактика микст-инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Вестник РАМН. 2001; (11): 41 - 45.
2. Burke G.S., Wikel S.K., Spielman A., Telford S.R., McKay K., Krause PJ. Hypersensitivity to Tick and Lyme Disease. Risk.Emerg Infect Dis. 2005; 11(1): 36 - 41.
3. Das S., Banerjee G., DePonte K., Marcantonio N., Kantor F.S., Fikrig E. Salp25D, аn Ixodes scapularis Antioxidant, Is 1 of 14 Immunodominant Antigens in Engorged Tick Salivary Glands. The Journal of Infectious Diseases. 2001; 184 (8): 1056 - 1064.
4. Brossard M., Wikel S.K. Tick immunobiology. Parasitol. 2004; 129: S161 - S176.
5. Hovius J.W.R., Levi M., Fikrig E. Salivating for knowledge: Potential Pharmacological Agents in Tick Salive. PLoS Medicine. 2008; 5 (issue 2: e43): 0202 - 0208.
6. Kovaz L. Tick Saliva in Anti-Tick Immunity and Pathogen Transmission. Follia Microbiol. 2004; 49 (3): 327 - 336.
7. Mejri N., Rutti B., Brossard M. Immunosuppressive effects of Ixodes ricinus tick saliva or salivary gland extract on innate and acquired immune response of BALB/c mice. Parasitol. Research. 2001; 88 (3): 192 - 197.
8. Singh S.K., Girschick H.J. Tick-host interactions and their immunological implications in tick-borne diseases. Current science. 2003; 85 (9): 1284-1298.
9. Kaufmann S.H.E., Kabelitz D. eds. Methods in Microbiology. Immunology of Infections. 2nd ed. London: Academic Press; 2002.
10. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунология образраспознающих рецепторов (интегральная иммунология). М.: Книжный дом «Либроком»; 2009.
11. Хаитов РМ. Иммунология: учебник для студентов медицинских вузов. М.: ГЭОТА - Медиа; 2006.
12. Schroder N.W., Eckert J., Stubs G., Schumann R.R. Immune responses induced by spirochetal outer membrane lipoproteins and glycolipids. Immunobiol. 2008; 213 (Issues 3 - 4): 329 -340.
13. Зырина Е.В., Фирстова В.В., Штанников А.В., Титарева Г.М., Гутова В.П., Васильева И.С. и др. Иммуномодулирующее действие экстракта слюнных желез иксодовых клещей Ixodes persulcatus (Ixodidae) на лимфоциты мышей линии BALB/c в системе in vitro. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2012; (4): 33 - 35.
References
1. Korenberg E.I. The study and prophylaxis of mixtinfections are transmited by Ixodidae Tick. Vestnik RAMN. 2001; (11): 41 - 45 (in Russian).
2. Burke G.S., Wikel S.K., Spielman A., Telford S.R., McKay K., Krause PJ. Hypersensitivity to Tick and Lyme Disease. Risk.Emerg Infect Dis. 2005; 11(1): 36 - 41.
3. Das S., Banerjee G., DePonte K., Marcantonio N., Kantor F.S., Fikrig E. Salp25D, an Ixodes scapularis Antioxidant, Is 1 of 14 Immunodominant Antigens in Engorged Tick Salivary Glands. The Journal of Infectious Diseases. 2001; 184 (8): 1056 - 1064.
4. Brossard M., Wikel S.K. Tick immunobiology. Parasitol. 2004; 129: S161 - S176.
5. Hovius J.W.R., Levi M., Fikrig E. Salivating for knowledge: Potential Pharmacological Agents in Tick Salive. PLoS Medicine. 2008; 5 (issue 2: e43): 0202 - 0208.
6. Kovaz L. Tick Saliva in Anti-Tick Immunity and Pathogen Transmission. Follia Microbiol. 2004; 49 (3): 327 - 336.
7. Mejri N., Rutti B., Brossard M. Immunosuppressive effects of Ixodes ricinus tick saliva or salivary gland extract on innate and acquired immune response of BALB/c mice. Parasitol. Research. 2001; 88 (3): 192 - 197.
8. Singh S.K., Girschick H.J. Tick-host interactions and their immunological implications in tick-borne diseases. Current science. 2003; 85 (9): 1284 - 1298.
9. Kaufmann S.H.E., Kabelitz D. eds. Methods in Microbiology. Immunology of Infections. 2nd ed. London: Academic Press; 2002.
10. Lebedev K.A., Ponyakina I.D. Immunology of pattern recognition receptor (integral immunology). М.: Bookish house «Librokom»; 2009 (in Russian).
11. Haitov R.M. Immunology: course for students of medicin college. М.: GEOTAR - Мedia; 2006 (in Russian).
12. Schroder N.W., Eckert J., Stubs G., Schumann R.R. Immune responses induced by spirochetal outer membrane lipoproteins and glycolipids. Immunobiol. 2008; 213 (Issues 3 - 4): 329 - 340.
13. Zyrina E.V., Firstova V.V., Shtannikov A.V., Titareva G.M., Gutova V.P., Vasilyeva I.S. et al. Immunomodulating effect of an Ixodes persulcatus (Ixodidae) Tick Salivary Gland Extract on BALB/c mice lymphocytes in vitro system. Meditsinskaya parasitologiya i parasitarnye bolesni. 2012; (4): 33 - 35 (in Russian).
ERRATA
В № 4(71) в статье «Эпидемия гриппа в России в сезон 2012 - 2013 годов» допущены следующие неточности на 9-й странице:
1. Третий абзац левой колонки должен заканчиваться предложением «В Северо-Западном, Уральском и Приволжском округах заболеваемость была выше (от 13,3 до 8,5%), чем в других округах (от 7,2 до 4,2%), и продолжительность эпидемии больше на 1 - 6 недель (рис. 2)».
2. Второй абзац правой колонки в конце страницы должен заканчиваться: «В дальнейшем число умерших нарастало и было максимальным (18) за 2 недели до и 1 неделю после пика заболеваемости».
3. На рисунке 2 во второй диаграмме округа должны быть в такой последовательности: Дальневосточный, Южный, Сибирский, Центральный, Приволжский, Северо-Западный, Уральский.
Редакция и авторы приносят читателям глубокие извинения.
