CC BY
15Вестник фармации № 2 (32) 2006
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
В.М.Ёршик, А.И.Жебентяев
ИССЛЕДОВАНИЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ПОВЕДЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ АНТИАРИТМИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ МЕТОДОМ ТСХ
Витебский государственный медицинский университет
В работе проведено сравнительное исследование различных вариантов тонкослойной хроматографии (ТСХ) лекарственных веществ антиаритмического действия. Изучено влияние молярной доли полярного органического растворителя и концентрации ион-парных реагентов на подвижность и селективность разделения антиаритмических лекарственных веществ. Разработана методика ТСХ — скрининга антиаритмических лекарственных веществ.
ВВЕДЕНИЕ
Тонкослойная хроматография является простым и доступным способом идентификации и оценки чистоты органических веществ. При разработке методик идентификации веществ основного характера методом нормальнофазовой ТСХ селективности разделения достигают, варьируя соотношение полярного и малополярного органического растворителя в бинарных смесях [1], либо путём проведения сравнительного исследования нескольких трёх - четырёхкомпонентных смесей [2], состав которых берётся из литературных данных. При анализе четвертичных и некоторых третичных аммониевых соединений использовались бинарные водноорганические подвижные фазы с прибавлением неорганических солей в качестве ион-парных реагентов [3, 4, 5]. В последние годы возрастает интерес к ион-парным и мицеллярным подвижным фазам с использованием поверхностно-активных веществ [6].
В литературе не удалось найти универсальных систем, позволяющих разделить и идентифицировать исследуемые ан-тиаритмические лекарственные вещества.
Целью настоящей работы является изучение влияния различных факторов на подвижность лекарственных веществ ан-тиаритмического действия (атенолол, ме-топролол, этмозин, верапамил, этацизин, амиодарон), сравнение различных вариантов хроматографии и разработка методики ТСХ-скрининга исследуемых лекарственных веществ на наиболее распространённых и недорогих пластинах «сорбфил».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали образцы лекарственных веществ фармакопейной чистоты (таблица 1). Для хроматографирования применяли этанольные растворы концентрации 1 мг/мл. Разделение проводили на пластинках «Сорбфил» (Россия) с закреплённым слоем силикагеля СТХ-1А при температуре 291-2930К. Высота подъёма фронта подвижной фазы (ПФ) составляла 9 см. ПФ приготавливали путём смешивания соответствующих полярных органических растворителей с водой, хлороформом, солями, 25% аммиаком, диэтила-мином, триэтиламином. Использованные в работе органические растворители (метанол, этанол, и-пропанол, ацетон, хлороформ) очищали по известным методикам. Вещества на пластины наносили дозированным капилляром по 1 мкл. Хроматографирование проводили в насыщенной камере (общий объём 0,45 л, объём подвижной фазы 10 мл). После высушивания пластины проявляли парами иода. Применение иода в качестве проявителя обеспечивает достаточно высокую чувствительность, не требует распыления токсических растворителей. В случае использования подвижных фаз, содержащих амины и аммиак, чувствительность реакции с иодом была невелика, поэтому хроматографические пластины проявляли реактивом Дра-
гендорфа, модифицированным по Му-нье [7].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние состава водно-органических фаз на подвижность лекарственных веществ
Исследовано влияние добавок апро-тонного растворителя ацетона и прото-фильных растворителей этанола и изопропанола к водной фазе на подвижность лекарственных веществ. Результаты представлены на рис. 1.
Таблица 1
Изучаемые антиаритмические лекарственные вещества
Вещество
Структура
Ь§Р
Атенолол [8]
Метопролол [8]
Этмозин [9]
Верапамил [9]
Этацизин
Амиодарон [10]
НэСч
НзС"
СНМНСН2СН(ОН)СНГ о-
\ /
О
-СН^(
НС
НзС
/СНКНСН2СН(ОН)СН—о “Л 9
СН2СН2ОСНз
КН ^ ХН,
С2Н5
О(СН2)2 N
С2Н5
0,026
1,69
2,98
3,79
4,121
7,57
1 Значение логарифма коэффициента распределения рассчитано с помощью программы АСБЬаЬБ методом инкрементов [13].
На кривых зависимости подвижности верапамила, этацизина, амиодарона от молярной доли органического модификатора (ОМ) можно выделить три участка. При увеличении молярной доли ОМ от 0 до 0,2-0,3 происходило резкое увеличение подвижности сорбатов. Такое поведение разделяемых веществ можно объяснить уменьшением диэлектрической проницаемости ПФ, а также наличием наряду с молекулярным механизмом удерживания разделяемых веществ, ионообменной составляющей адсорбции хроматографируемых веществ [3; 11]. Введение органического модификатора в подвижную фазу приводило к снижению степени диссоциации поверхностных силанольных групп и к уменьшению удерживания [12].
При увеличении молярной доли органического модификатора от 0,2-0,3 до
0,6-0,7 (в случае изопропанола до 0,4) увеличение подвижности исследуемых средств происходило в меньшей степени, чем на первом участке, что можно объяснить микрорасслоением бинарных водноорганических растворов [14; 15]. При этом происходило образование кластеров воды, окружённых молекулами органического неэлектролита. Гидрофобные участки исследуемых лекарственных веществ взаимодействовали с гидрофобными кластерами органических растворителей, а полярные группы взаимодействовали с полярной пограничной областью кластеров вода -органический растворитель.
При дальнейшем увеличении молярной доли ацетона в подвижной фазе выше 0,7-0,8 подвижность верапамила, этацизина, амиодарона снижалась. Данное явление можно объяснить разрушением кластерной структуры растворов и переходу к среде чистого органического растворителя. Это приводило к выталкиванию полярных группировок из среды органического растворителя и увеличению взаимодействия с поверхностью полярного силикагеля. Кроме того, поверхность силикагеля оказывала упорядочивающее действие на граничные слои воды [15], что, возможно, также обеспечивало улучшение взаимодействия с полярными группировками и
увеличение сорбции. В присутствии более полярного органического модификатора (этанол) в ПФ подвижность исследуемых веществ изменялась незначительно.
Рис. 1. Влияние молярной доли ацетона
(а), этанола (Ь), изопропанола (с) в воде на подвижность антиаритми-ческих лекарственных веществ Пластины «Сорбфил»; 1. атенолол; 2. ме-топролол; 3. этмозин; 4. верапа-мил; 5. этацизин; 6. амиодарон.
Подвижность атенолола и метопро-лола в исследованных ПФ значительно ниже, чем соединений первой группы.
Кривые зависимости подвижности от молярной доли ОМ состояли из двух участков. При увеличении молярной доли ОМ от 0 до 0,2-0,4 подвижность сорбатов увеличилась, что обусловлено уменьшением заряда поверхностных силанольных групп [12]. При дальнейшем увеличении молярной доли ОМ подвижность сорбатов не изменялась или незначительно уменьшалась. Атенолол и метопролол, в отличие от соединений первой группы, обладали достаточно высокой полярностью (см. таблицу 1), поэтому при увеличении содержания органического растворителя в подвижной фазе начинали доминировать взаимодействия сорбент - сорбат и уменьшались взаимодействия сорбат - подвижная фаза.
Хроматографическое поведение эт-мозина в исследованных ПФ значительно отличалось от поведения верапамила, эта-цизина, амиодарона, атенолола и метопро-лола. Наличие атома кислорода в морфо-линовом цикле этмозина приводило к уменьшению доступности третичного атома азота для взаимодействующих с ним силанольных групп. Поэтому подвижность этмозина во всех случаях больше.
Влияние добавок ионпарных реагентов
Исследовано влияние добавок ионпарных реагентов (натрия хлорид, натрия бромид, додецилсульфат натрия) к водноацетоновым фазам на подвижность исследуемых лекарственных веществ. Во всех случаях введение ионпарных реагентов приводило к увеличению подвижности и уменьшению селективности разделения. Для примера на рис. 2 представлено влияние добавок натрия хлорида на подвижность изучаемых веществ.
В водно-органических средах с содержанием ион-парных реагентов (рис. 3) при увеличении молярной доли ОМ подвижность сорбатов росла быстрее, чем в бинарных растворах вода-ОМ. Кривые зависимостей подвижности от молярной доли ОМ имели более правильную форму, что свидетельствует о лучшей воспроизводимости условий хроматографирования. Введение ионпарных реагентов приводит к улучшению симметричности пятен разделённых веществ, что актуально при ком-
пьютерном анализе изображений хроматограмм.
Рис. 2. Влияние добавок натрия хлорида на подвижность препаратов в системе вода-ацетон 1:1 Пластины «Сорбфил»; 1. атенолол; 2. метопролол; 3. верапамил; 4. этаци-зин; 5. амиодарон.
Влияние добавок полярного органического растворителя к хлороформу на подвижность лекарственных веществ
Исследовано влияние добавок различных полярных органических растворителей к малополярному хлороформу на подвижность антиаритмических лекарственных веществ (рис. 4).
Полученные значения подвижностей исследуемых веществ были обработаны по уравнениям Снайдера-
Сочевинского: 1§к' = а + Ь 1§ N, и Скотта-Кучеры: 1/ к' = с + dN где
к' = (1 - Я/)/Я/, а, Ь, с и ё - константы, характеризующие компоненты подвижной фазы, N - мольная доля более полярного компонента [16].
В случае добавок апротонного растворителя ацетона и протонодонорного растворителя этанола кривые удовлетворительно описывались с помощью указанных моделей, что свидетельствовало о доминировании вытеснительного механизма сорбции. Коэффициенты уравнений Снай-дера-Сочевинского и Скотта-Кучеры представлены в таблице 2. Лишь при больших концентрациях полярного органического растворителя наблюдались отклонения от моделей удерживания.
При введении изопропанола в хлороформ данные уравнения не выполнялись
во всём диапазоне концентраций полярного растворителя. Всё это позволило предположить, что в области больших концентраций ацетона, этанола, а также при введении изопропанола наряду с вытеснительным механизмом сорбции значительный вклад вносила сольватация сорбатов органическим модификатором в подвижной фазе [17].
Рис. 3. Зависимость подвижности
антиаритмических лекарственных веществ в присутствии натрия хлорида от молярной доли ацетона (a), этанола (b), изопропанола (c) в водной фазе.
Пластины «Сорбфил»; 0,0ЗМ NaCl 1. атенолол; 2. метопролол; 3. этмозин; 4. верапамил; З. этацизин; б. амиодарон.
Рис. 4. Влияние молярной доли ацетона (а), этанола (Ь), изопропанола (с) в хлороформе на подвижность антиаритмических лекарственных веществ.
Пластины «Сорбфил»; 1. атенолол; 2. метопролол; 3. этмозин; 4. верапамил; 5. этацизин; 6. амиодарон.
Введение аминов (аммиака, диэти-ламина, триэтиламина) в систему приводило к резкому увеличению подвижности высокогидрофобных сорбатов (этмозин, этацизин, амиодарон, верапамил), в результате они перемещались с фронтом подвижной фазы. Подвижность полярных атенолола и метопролола увеличивались в меньшей степени.
З
Селективность разделения
Введение добавок ионпарных реагентов в подвижную фазу приводило к нивелированию индивидуальных свойств сорбатов, что приводило к ухудшению селективности разделения. Введение аминов в органические подвижные фазы приводило к ухудшению селективности неполярных сорбатов (этмозин, этацизин, верапа-мил, амиодарон) и к улучшению селективности разделения полярных атенолола и метопролола. Наибольшей селективностью разделения среди исследованных подвижных фаз обладала фаза ацетон-вода В:2.
При этом происходило удовлетворительное разделение всех исследуемых веществ за исключением атенолола и метопролола.
Подвижная фаза, содержащая ацетон и хлороформ в определённых соотношениях, также обладает хорошей селективностью, но при этом не удалось идентифицировать атенолол и метопролол, поскольку они оставались на линии старта. Подвижная фаза, содержащая хлороформ и изопропанол, не пригодна для разделения исследуемых ан-тиаритмических лекарственных веществ, поскольку при этом образовывались размытые пятна. Кроме того, ввиду высокой вязкости изопропанола разделение длилось в течение нескольких часов.
Методика идентификации анти-аритмических лекарственных веществ.
Таблица 2
Коэффициенты уравнений Скотта-Кучеры и Снайдера-Сочевинского в системе хлоро-
На линию старта пластины «Сорб-фил» наносят 1 мкг исследуемого вещества, параллельно наносят по 1 мкг атеноло-ла, этмозина, этацизина, верапамила, амиодарона. Пластинку высушивают и помещают в насыщенную хроматографическую камеру объёмом 0,45 л. Объём подвижной фазы составляет 10 мл.
Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу на 10 мл помещают 8 мл ацетона, доводят водой очищенной до метки, перемешивают и снова доводят водой до метки.
Хроматографирование проводят восходящим методом. Высота подъёма фронта ПФ составляет 9 см. После окончания хроматографирования пластинку высушивают в токе горячего воздуха и проявляют в камере, насыщенной парами иода.
В результате образуются зоны, характерные для каждого компонента смеси.
В случае обнаружения вещества с подвижностью, характерной для атенолола и метопролола, идентификацию проводят аналогично в системе хлороформ-этанол-25% раствор аммиака в соотношении 5:5:0,5. Проявление проводят методом погружения в реактив Драгендорфа, модифицированный по Мунье, после чего переносят на 10 минут в камеру, насыщенную парами иода.
Раство- ритель Вещество Модель Снайдера-Сочевинского Модель Скотта-Кучеры
n a b г2 n c d г2
Ацетон атенолол 2 - - - 2 - - -
метопролол б -1,9В 0,95 0,97 б 0,12 -0,03 0,99
этмозин 9 -1,б9 -0,30 0,99 7 2,07 -0,31 0,97
верапамил 9 -1,22 0 0,99 В 1,02 -0,05 0,99
этацизин 7 -2,15 0,15 0,99 7 0,бВ -0,15 0,9В
амиодарон 9 -1,13 -0,32 0,99 В 2,1 б -0,0В 0,99
Этанол атенолол 2 - - - 2 - - -
метопролол 3 -1,24 0,01 0,99 3 0,ВВ -0,04 0,99
этмозин В -2,7В -2,В7 0,99 В 2б,9 -1,31 0,99
верапамил 9 -2,33 -2,47 0,99 В 23,ВІ -0,94 0,99
этацизин 7 -2,б9 -2,02 0,99 б 3,б3 -0,15 0,97
амиодарон 10 -1,Вб -1,9б 0,9В 9 20,23 -0,57 0,99
б
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработана методика идентификации антиаритмических лекарственных веществ, позволяющая идентифицировать атенолол, метопролол, этмозин, этацизин, верапамил и амиодарон в одной хроматографической системе.
Использование варианта ион-парной хроматографии нецелесообразно, поскольку введение ион-парных реагентов приводит к ухудшению селективности разделения.
Наилучшая селективность разделения достигается при использовании в качестве подвижной фазы смеси ацетон - вода 8:2.
SUMMARY INVESTIGATION OF CHROMATOGRAPHIC BEHAVIOUR OF ANTIRYTHMIC DRUGS BY TLC
Yorshyk V.M., Zhebentyaev A.I.
In this work a comparative investigation of different variants of thin-layer chromatography of antiarythmic drugs has been done. The mobility and selectivity of division of an-tiarythmic drugs from mole part of pole organic solvent and concentration of ion-pair reagents. Also the system of TLC screening of antiarythmic drugs has been worked out.
ЛИТЕРАТУРА
1. Pang Z., Wang B., Gao L. Determination
of amiodarone hydrochloride by fluorescent probe// Yaowu Fenxi Zazhi. -1991. - Vol. 11, N. 6. - P. 344-346.
2. Tuszynska E., Kwiatkowska B., Wiec-
zorkowska A., Kaniewska T. Investigation on chemical changes in overdue pharmaceuticals. Part I. Investigations on decomposition of atenolol// Chem. Anal. - 1994. - Vol. 39, N 5. - P. 563569.
3. Бєйкін С.П., Гапоненко Я.С. !денти-
фікацшя Р-адреноблокаторів та деяких інших ліків аналогічної дії// Фармацевтичний журнал. - 1987. - N. 6. - С. 63-65.
4. Жебентяев А.И., Дробышевский А.М.,
Алексеев Н.А. Биологически активные органические основания в ион-парной тонкослойной хроматографии// Журн. физической химии. - 2002. - Т. 76, № 9. - С. 1647-1653.
5. Giebelmann R. Ionenpaaradsorptionsdünn-
schi chtchromatografie quartärer Ammoniumionen// Die Pharmazie. - 1981. -Vol. 36, N. 5. - P. 385-386.
6. Giebelmann R. Ionenpaaradsorptionsdünn-
schichtchromatografie quartärer Ammo-niumionen// Die Pharmazie. - 1981. -Vol. 36, N. 7. - P. 514.
7. Сумина Е.Г., Штыков С.Н., Тюрина
Н.В. Поверхностно-активные вещества в тонкослойной хроматографии// Журн. аналитической химии. - 2003. -Т. 58, № 8. - С. 808-818.
8. Шаршунова М., Шварц Б., Михалец Ч.
Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии, Ч.
2. - Москва: Мир, 1980. - 620 с.
9. Detroyer A., Vander Heyden Y., Carda-
Broch S. et all. Quantitative structure-retention and retention-activity relationships of ß-blocking agents by micellar liquid chromatography// J. Chroma-togr. A. 2001. Vol. 912. P. 211-221.
10. Interactive PhysProp Database Demo// Environmental Science [Electronic re-sourse]. - 1999 - 2004. - Mode of access: http://esc.syrres.com. - Date of access: 04.01.2003.
11. Moffat A.C. Clarke’s isolation and identification of drugs in pharmaceuticals. Second Edition. London: ^e pharmaceutical press, 1986.
12. Nawrocki J. The silanol group and its role in liquid chromatography// J. Chromatography A. - 1997. - Vol. 779. - P. 29-71.
13. Жуков А.Н., Дмитриева И.Б., Харламов А. А. Влияние состава водно-этанольных растворов бромида натрия на плотность поверхностного заряда кремнезёма// Колл. журн. - 2000. - Т. 62, № 3. - С. 352-356.
14. Ertl P., Rohde B., Selzer P. Fast calculation of Molecular Polar Surface Area as a Sum of Fragment-based contributions and its Application to the prediction of
drug transport properties// J. Med. Chem. - 2000. - Vol. 43. - P. 3714-3717.
15. Старобинец Г.Л., Рахманько Е.М., Мечковский С.А., Борщенская Т.И. Влияние структуры бинарных растворов вода-этанол на молекулярную сорбцию галогенидов калия сульфопо-листирольным катионитом// Журн. физической химии. - 2001. - Т. 75, №
12. - С. 2222-2225.
16. Казакова О.А., Гунько В.М., Воронин Е.Ф., Сильченко С.С., Чуйко А. А. Взаимодействие белков с поверхностью дисперсного кремнезёма в водных суспензиях// Колл. журн. - 1988. -Т. 60, № 5. - С. 613-617.
17. Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. - М., 1999. - 348 с.
18. Ланин С.Н., Ланина Н.А., Никитин Ю.С. Влияние ассоциации молекул сорбата и модификатора в подвижной фазе на удерживание в высокоэффективной жидкостной хроматографии// Журн. физической химии. - 1995. - Т. 69, № 11. - С. 2045-2051.
Поступила 05.05.2006 г.
