CC BY
14Вестник фармации № 2 (32) 2006 А.И.Жебентяев, В.М.Ёршик, В.И.Фадеев
ТВЁРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ И ОБНАРУЖЕНИЕ ВЕРАПАМИЛА МЕТОДОМ ТСХ В ПЛАЗМЕ КРОВИ
Витебский государственный медицинский университет
Разработана методика обнаружения вера-памила в плазме крови методом тонкос-
лойной хроматографии (ТСХ) в сочетании с твёрдофазной экстракцией. Методика экономична, обладает низкими пределами обнаружения (0,5 мкг/мл).
ВВЕДЕНИЕ
Верапамила гидрохлорид 5-[(3,4-диметоксифенилэтил)-метиламино]-2-(3,4-диметокси-фенил)-2-
изопропилвалеронитрила гидрохлорид обладает антиаритмической активностью, применяется при лечении стенокардии, гипертонии.
ИзО,
Н3СО
ОНз
ОНз
ОН
и1-г и-
—(сн^с
НзОО
ОСН3- НС1
ООНз
Содержание верапамила в плазме крови достигает 0,068 мкг/мл при перо-ральном применении [1]. При передозировках токсическая концентрация верапа-мила в плазме крови может составлять от
0,63 мкг/мл [2] до 3-8 мкг/мл [1]. Согласно литературным данным, обнаружение вера-памила в плазме крови осуществляют методами высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с жидкость-жидкостной экстракцией [2, 3], методами газовой хроматографии в сочетании с твёрдофазной экстракцией [4] или жид-кость-жидкостной экстракцией [5].
Целью настоящей работы является разработка методики изолирования вера-памила из плазмы крови и идентификации методом ТСХ на доступных хроматографических пластинках «Сорбфил» российского производства.
При разработке методики идентификации верапамила методом ТСХ в плазме крови необходимо учесть ряд факторов:
- низкие концентрации верапамила в плазме крови (токсические концентрации порядка 1 мкг/мл);
- метод ТСХ обладает невысокой чувствительностью;
- содержание в пробе значительного количества компонентов матрицы;
- объём пробы, взятой на анализ, невелик (обычно 1-5 мл).
Поэтому при анализе необходима предварительная очистка пробы, конечный объём пробы должен быть минимален и обеспечивать возможность полного нанесения пробы на пластинки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали верапамил фармакопейной чистоты. В качестве стандартного раствора применяли этанольный раствор верапамила концентрации 1 мкг/мл. Использовали донорскую плазму крови. Изолирование верапамила проводили методом твёрдофазной экстракции на модифицированном силикагеле силосорб-100-С16. Хроматографическое разделение проводили на пластинках «Сорбфил» (Россия) с закреплённым слоем силикагеля СТХ-1А при температуре 291-293 К. Высота подъёма фронта подвижной фазы составляла 9 см. Хроматографирование проводили в насыщенной парами подвижной
фазы камере (общий объём 0,45 л, объём подвижной фазы 10 мл). В качестве подвижной фазы использовали бинарную смесь ацетон-вода 8:2 (при таком соотношении компонентов подвижной фазы ве-рапамил отделяется от сопутствующих веществ, а значение подвижности ЯГ составляет 0,62-0,66). После высушивания пластины проявляли реактивом Драген-дорфа, модифицированным по Мунье [6]. При этом получались контрастные жёлтые пятна анализируемого вещества на белом фоне. Для сравнительного анализа содержания верапамила в хроматографических пятнах хроматограммы сканировали с помощью сканера МШТЕК 1200и8Б с разрешением 300 ёр1 в цветовом режиме ЯОБ 24 бит. Полученные изображения хроматограмм обрабатывали программой «8сюп1та§е». В работе использовали цит-ратный (pH 4), фосфатные (pH 5-8), борат-ные (pH 9-11) буферные растворы [7],
0,01 М раствор КаОН (pH 12).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе предварительных исследований установлено, что жидкость-жидкостная экстракция не позволяет обеспечить достаточную степень извлечения аналита из матрицы для обнаружения ме-
тодом ТСХ. Извлечение верапамила без предварительного осаждения белков требует значительного разбавления пробы ацетоном, ацетонитрилом и т. д. При предварительном осаждении белков с помощью трихлоруксусной кислоты, фосфорномолибденовой кислоты, солей тяжёлых металлов не удается выделить лекарственное вещество вследствие значительной адсорбции на осадке.
Наиболее оптимальным способом выделения верапамила из плазмы является твёрдофазная экстракция (ТФЭ). Схема изолирования представлена на рис. 1.
Метод твёрдофазной экстракции позволяет выделять аналит без предварительного осаждения белков в малом объёме органического растворителя. Логарифм коэффициента распределения верапамила в системе вода-октанол составляет 3,79 [8]. Поэтому наиболее подходящими сорбентами для изолирования верапамила могут быть модифицированные силикагели С8, С16, С18, сополимеры стирола и дивинил-бензола, активированные угли. Для изолирования верапамила из плазмы был выбран доступный сорбент С16 Российского производства.
Рис. 1. Схема твёрдофазной экстракции верапамила из плазмы крови
Q - аналит; ® - компоненты матрицы; О - растворитель а;
© - растворитель b; О - растворитель с
1. кондиционирование патрона с сорбентом; 2 - пропускание исследуемого объекта через патрон с сорбентом; 3 - промывка водой и органическими растворителями; 4 -высушивание сорбента; 5 - элюирование.
Подбор
оптимального
режима
элюирования сорбированных лекарст-
венных веществ
При подборе оптимального элюента необходимо обеспечить полноту и по возможности селективность элюирования лекарственных веществ, сорбированных методом ТФЭ. Поскольку после стадии элюирования следует стадия упаривания досуха, объём элюата должен быть минимален, а элюирующая жидкость достаточно летуча. Этим требованиям удовлетворяют спирты (метиловый, этиловый), смеси спиртов с кислотами, диэтиловый эфир.
При подборе оптимального элюента патроны твёрдофазной экстракции (полипропиленовые трубки с внутренним диаметром 9 мм, высотой 60 мм, заполняли 100 мг сорбента силасорб-100-С16) кондиционировали 96% этанолом 15 минут, после чего промывали 10% этанолом. Вносили по 3 мл растворов верапамила в кон-
центрации 1 мкг/мл (с добавкой 10% этанола), после сорбции сорбент высушивали в токе воздуха и элюировали различными элюентами (1 мл). Элюат выпаривали в пробирке до объёма 10 мкл в токе азота и количественно наносили на пластинку ТСХ. В пробирку вносили 100 мкл 96% этанола, вновь упаривали до 10 мкл и количественно переносили на пластинку ТСХ. Хроматографировали в системе аце-тон:вода 8:2. Пластинку высушивали, проявляли реактивом Драгендорфа по Мунье [6] методом погружения. Проявленную пластинку сканировали и синий канал полученных изображений обрабатывали с помощью «8сіопІта§е». Для примера на рис. 2 представлена зависимость площади хроматографических пиков верапамила от природы элюента.
150000
100000
50000
0
Рис. 2. Влияние природы элюента на площадь хроматографических пиков ве-рапамила
1. метанол; 2. этанол; 3. 4% раствор уксусной кислоты в этаноле
При использовании эфира элюат в значительной степени загрязнён компонентами матрицы, в результате чего при хроматографировании происходит перегрузка хроматографических пластинок липидами и не удаётся идентифицировать пятна исследуемых лекарственных веществ. Таким образом, наиболее полно элюирование аналитов с колонок ТФЭ осуществляется этанолом.
Подбор состава органического растворителя для селективной промывки патрона ТФЭ
Промывку патронов ТФЭ обычно осуществляют этанолом различной крепости. При этом подбирают такой промывающий растворитель, чтобы максимально очистить сорбент от компонентов матрицы при минимальных потерях аналита.
Патроны ТФЭ с сорбированным ве-рапамилом промывали 3 мл (объём патрона ТФЭ) этанола различной крепости. После высушивания сорбента в токе воздуха элюировали аналит оптимальным объёмом 96% этанола, упаривали и количественно переносили на пластинку ТСХ. После
S
хроматографирования сухого остатка проявленные пластинки ТСХ сканировали и обрабатывали изображения хроматограмм на компьютере. Влияние концентрации
раствора этанола на площадь хроматографических пиков верапамила представлено на рис. 4.
Рис. 4. Влияние концентрации раствора этанола при селективной промывке патронов ТФЭ на площадь хроматографических пиков верапамила
Оптимальное содержание этанола для промывания патронов ТФЭ составляло 25%. При больших концентрациях этанола происходили значительные потери сорбированного аналита, при меньших концентрациях этанола проба в значительной степени загрязнена компонентами матрицы, которые увеличивали подвижность вера-памила. В результате значения Rf стандартного раствора верапамила и верапами-ла, выделенного из плазмы, не совпадали.
Влияние значения pH на экстракцию аналита из плазмы
Патроны твёрдофазной экстракции, содержащие 100 мг сорбента силасорб-100-С16, кондиционировали 96% этанолом 15 минут, после чего промывали 10% этанолом.
В 2 мл плазмы крови вносили по 3 мкг верапамила, прибавляли 2 мл соответ-
ствующего буферного раствора, 200 мкл этанола и пропускали через патроны ТФЭ с подготовленным сорбентом со скоростью 30-60 капель в минуту. Промывали 3 мл воды, затем 3 мл 25% этанола. Сорбент высушивали в токе воздуха и элюировали
1 мл 96% этанола. Элюат упаривали до 10 мкл, переносили на пластинку ТСХ. После чего стенки пробирки омывали 100 мкл 96% этанола, вновь упаривали до 10 мкл и количественно наносили на пластину ТСХ «Сорбфил». После хроматографирования и проявления полученные изображения хроматограмм обрабатывали с помощью программы «БсіопІта§е». Зависимость площади хроматографических пиков от значения pH буферного раствора представлена на рис. 5.
Рис. 5. Влияние значения pH буферного ков верапамила
Таким образом, оптимальное значение pH для проведения изолирования ве-рапамила методом твёрдофазной экстракции составило 8,0 - 10,0. При уменьшении значения pH ниже 8,0 степень извлечения верапамила уменьшилось вследствие доминирования в системе ионизированных форм верапамила ( pKBH + = 8,92 [8]). Кроме того, при значениях pH ниже 3,0 происходило выпадение белков в осадок и разрушение сорбента [9]. При увеличении значения pH выше 10,0 степень извлечения верапамила также уменьшилась, что может быть связано с разрушением сорбента.
При заборе проб крови их иногда консервируют [10] прибавлением 1 г/л натрия фторида. Увеличение концентрации натрия фторида вплоть до 2 г/л не оказывало влияния на степень извлечения вера-памила из плазмы.
Методика обнаружения верапа-мила в плазме крови
2 мл плазмы крови разбавляют в 2 раза боратным буферным раствором [7] со значением pH 9,0, прибавляют 200 мкл 96% раствора этанола.
Картриджи ТФЭ, содержащие 100 мг сорбента силасорб-100-С16, кондицио-
раствора на площадь хроматографических пи-
нируют 96% этанолом 15 минут, после чего промывают 10% этанолом.
Плазму пропускают через картридж со скоростью 30-60 капель в минуту, промывают последовательно 3 мл воды и 3 мл 25% этанола, после чего высушивают в токе воздуха.
Верапамил элюируют 1 мл 96% этанола в пробирку на 1 мл и упаривают в токе азота при температуре 40°С до небольшого объёма (примерно 10 мкл), после чего количественно переносят на хроматографическую пластинку. В пробирку прибавляют 100 мкл 96% этанола (при этом пробирку слегка покачивают, чтобы максимально растворить остаток на стенках), упаривают до объёма примерно 10 мкл и количественно наносят на хроматографическую пластинку «Сорбфил». Параллельно наносят 1 мкл стандартного раствора верапамила (1 мг/мл). Хроматографируют восходящим способом в системе вода-ацетон 8:2.
Проявляют пластинки методом погружения в реактив Драгендорфа по Му-нье. Предел обнаружения верапамила составляет 0,5 мкг/мл плазмы. Хроматограмма верапамила, изолированного из плазмы, представлена на рис. 6.
Рис. 6. Хроматограмма верапамила, изолированного из плазмы крови
1. верапамил, выделенный из плазмы (1 мкг/мл); 2. стандарт верапамила; 3. фосфолипиды, содержащиеся в плазме
ВЫВОДЫ
1. Установлены оптимальные условия сорбционного концентрирования вера-памила из плазмы крови.
2. Разработанная методика обнаружения верапамила в плазме крови отличается простотой исполнения, низким пределом обнаружения (0,5 мкг/мл).
SUMMARY V.M.Yorshyk, A.I.Zhebentyaev, V.I.Fadeev SOLID PHASE EXTRACTION AND TLC DETERMINATION OF VERAPAMIL IN BLOOD PLASMA Verapamil detection in blood plasma with the use of SPE and TLC was. The method devel-
oped is cost effective and has low detection
limit of verapamil.
ЛИТЕРАТУРА
1. Moffat A.C. Clarke’s isolation and identification of drugs in pharmaceuticals. Second Edition. - London: ^e pharmaceutical press. - 1986. -1684 p.
2. Holzer M., Sterz F., Schoerkhuber W. et all. Successful resuscitation of a verapamil-intoxicated patient with percutaneous cardiopulmonary bypass// Crit Care Med. - 1999. - Vol 27, № 12. - P. 28182823.
3. Bremseth D.L., Lima J.J., MacKichan J.J. Specific HPLC method for the separation of verapamil and four major metabolites after oral dosing// J. Liq. Chromatogr. -1988. - Vol 11, № 13. - P. 2731-2749.
4. Hoffman D.J., Higgins J. Resolution of verapamil from heptadeuteroverapamil and their quantitation in serum using capillary gas chromatography// J. Chromatogr. Biomed. Appl. - 1986. - Vol. 47, №
1. - P. 170-176.
5. Shin H.S., Oh-Shin Y.S., Kim H.J. et all. Sensitive assay for verapamil in plasma
using gas-liquid chromatography with nitrogen- phosphorus detection// J. Chroma-togr. B Biomed. Appl. - 1996. - Vol. 677, № 2. - P 369-373.
6. Шаршунова М., Шварц Б., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии, Ч. 2. -М.: Мир, 1980. - 620 с.
7. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. - М.: Химия, 1989. - С. 268-269.
8. Interactive PhysProp Database Demo // Environmental Science [Electronic re-sourse]. - 1999 - 2004. - Mode of access: http://esc.syrres.com. - Date of access: 04.01.2003.
9. Лисичкин Г.В. Модифицированные кремнезёмы в сорбции, катализе и хроматографии. — М.: Химия, 1986. — 248 с.
10. Фланаган Р.Дж. Основы аналитической токсикологии. - Женева, 1997. - 384 с.
Поступила 14.06.2006 г.
