CC BY
0
© Коллектив авторов, 2024
Боженко В.К.1, Шкопоров А.Н.1' 2, Шишкин А.М.1, Киселева Я.Ю.1, Кулинич Т.М.1, Кудинова Е.А.1, Аминулла К.Г.1, Ранджит Р.1' 3, Солодкий В.А.1
Исследование фармакокинетики нового противоопухолевого препарата CAR-CEA на модели экспериментальных животных
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
2 Alimentary Pharmabiotic Centre Microbiome Ireland, University College Cork, T12YT20, Cork, Ireland
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов имени П. Лумумбы» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Одним из направлений адоптивной иммунотерапии рака является использование Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR) для лечения гемобластозов и солидных опухолей. Генетической модификации лимфоцитов можно достичь путем трансдукции ретровирусных генов, что приводит к конститутивной экспрессии CAR в Т-клетках, либо путем электропорации плазмиды/мРНК, что приводит к временной экспрессии иммунорецепторов, сводя к минимуму риск потенциальной аутоагрессии и нарушений в геноме. Мы разработали препарат CAR-CEA, который представляет собой лимфоциты, модифицированные путем электропорации плазмидной ДНК, кодирующей CAR, направленный против раково-эмбрионального антигена (РЭА, carcinoembryonic antigen, CEA)
Цель исследования - изучить фармакокинетику CAR-CEA при его однократном внутривенном введении экспериментальным животным и оценить период полувыведения препарата.
Материал и методы. Исследование проводили на модели экспериментальных животных (мыши линии B6D2F1). Препарат CAR-CEA получали, трансфецируя лимфоциты мышей плазмидой 3C1-3g электропорацией, и вводили внутривенно в дозе 106 клеток на животное. Количество CAR-CEA в клетках крови, тканях легких, селезенки и тимуса оценивали методом полимеразной цепной реакции по содержанию плазмидной ДНК. Оценку параметров фармакокинетики CAR-T проводили в 14 временных точках (30 мин - 30 сут).
Результаты. Максимальная концентрация плазмидной ДНК CAR-CEA в цельной крови мышей была определена через 30 мин после введения и составляла 125 ± 29 пг/мл. Далее концентрация снижалась экспоненциально. Время полувыведения составляло 105 ± 7 ч. CAR-CEA показал способность циркулировать в кровотоке до 1 мес. Наиболее значительное и длительное накопление препарата наблюдалось в селезенке.
Заключение. Результаты нашего доклинического исследования показывают, что CAR-CEA может быть использован для анти-РЭА-терапии при условии повторных инъекций.
Ключевые слова: адоптивная иммунотерапия; химерный антигенный рецептор; электропорация; раково-эмбриональный антиген; фармакокинетика
Статья получена 14.09.2024. Принята в печать 14.10.2024.
Для цитирования: Боженко В.К., Шкопоров А.Н., Шишкин А.М., Киселева Я.Ю., Кулинич Т.М., Кудинова Е.А., Аминулла К.Г., Ранджит Р., Солодкий В.А. Исследование фармакокинетики нового противоопухолевого препарата CAR-CEA на модели экспериментальных животных. Иммунология. 2024; 45 (5): 624-631. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-5-624-631
Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания, регистрационный номер 1022040800109-5-3.2.21;3.4.2, при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации. Публикация результатов исследования в открытой печати разрешена.
Для корреспонденции
Киселева Яна Юрьевна -кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории иммунологии и онкоцитологии ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8352-4787
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Боженко В.К., Кудинова Е.А.; постановка экспериментов, сбор и обработка материала - Шкопоров А.Н., Шишкин А.М., Кулинич Т.М.; статистическая обработка - Ранджит Р.; анализ результатов и написание текста - Шкопоров А.Н., Киселева Я.Ю.; редактирование - Аминулла К.Г., Солодкий В. А.
Bozhenko V.K.1, Shkoporov A.N.1' 2, Shishkin A.M.1, Kiseleva Ya.Yu.1, Kulinich T.M.1, Kudinova E.A.1, Aminulla K.G.1, Ranjit R.1, 3, Solodkiy V.A.1
Study of pharmacokinetics of new antitumor drug CAR-CEA using an experimental animal model
1 Russian Scientific Center of Roentgenoradiology, Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
2 Alimentary Pharmabiotic Centre Microbiome Ireland, University College Cork, T12YT20, Cork, Ireland
3 Рeoples' Friendship University of Russia named after P. Lumumba, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, Medical Institute, 117198, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. One of the directions of adoptive cancer immunotherapy is the use of T-lym-phocytes expressing the chimeric antigen receptor (CAR) for the treatment of hemoblastosis and solid tumors. Genetic modification of lymphocytes can be achieved by transduction of ret-roviral genes, which leads to constitutive expression of CAR in T cells, or by electroporation of plasmid/mRNA, which leads to temporary expression of immunoreceptors, minimizing the risk of potential autoaggression and genome disturbance. We have developed the drug CAR-CEA, which is a lymphocyte modified by electroporation of plasmid DNA encoding CAR, directed against carcinoembryonic antigen (CEA).
Aim - to study the pharmacokinetics of CAR-CEA with a single intravenous administration to experimental animals and to evaluate the half-life of the drug.
Material and methods. The study was performed on a B6D2F1 mouse model. CAR-CEA was obtained by transfecting mouse lymphocytes with plasmid 3C1-3g electroporation, and administered intravenously at a dose of 106 cells per animal. The amount of CAR-CEA in blood cells, lung, spleen and thymus tissues was assessed by PCR based on the content of plasmid DNA. The parameters of the pharmacokinetics of CAR-T were evaluated at 14 time points (30 min - 30 days).
Results. The maximum concentration of CAR-CEA plasmid DNA in the whole blood of mice was determined 30 minutes after administration and was 125 ± 29 pg/ml. Further, the decrease in concentration occurred exponentially. The half-life was 105 ± 7 hours. CAR-CEA showed the ability to circulate in the bloodstream for up to a month. The most significant and prolonged accumulation of the drug was observed in the spleen.
Conclusion. The results of our preclinical study show that CAR-CEA can be used for anti-СEA therapy under the condition of repeated injections.
Keywords: adoptive immunotherapy; chimeric antigen receptors; electroporation; carcinoembryonic antigen; phar-macokinetic
Received 14.09.2024. Accepted 14.10.2024.
For citation: Bozhenko V.K., Shkoporov A.N., Shishkin A.M., Kiseleva Ya.Yu., Kulinich T.M., Kudinova E.A., Aminulla K.V., Ranjit R., Solodkiy V.A. Study of pharmacokinetics of new antitumor drug CAR-CEA using an experimental animal model. Immunologiya. 2024; 45 (5): 624-31. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-5-624-631 (in Russian)
Funding. The study was performed in the framework ofthe Government Contract registration number 1022040800109-5-3.2.21;3.4.2 with the Ministry of Health ofthe Russian Federation. Open publication ofthe research results is allowed.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Conceptualization and design - Bozhenko V.K., Kudinova E.A.; conducting experiments, collection and processing of the material Shkoporov A.N., Shishkin A.M., Kulinich T.M.; analysing results and writing a text - Shkoporov A.N., Kiseleva Ya.Yu.; statistical processing - Ranjit R.; editing - Aminulla K.G., Solodkiy V.A.
For correspondence
Yana Yu. Kiseleva -PhD, Researcher of the Immunology and Oncocytology Lab., RSCRR of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8352-4787
Введение
Адоптивная иммунотерапия, основанная на введении пациенту аутологичных или гетерологичных лимфоцитов, модифицированных ex vivo, является сравнительно новым и перспективным подходом к лечению онкологических заболеваний. Генетическая модификация лимфоцитов состоит во введении в клетки реком-бинантной ДНК, что приводит к экспрессии на поверхности лимфоцитов химерных антигенных рецепторов (chimeric antigen receptor, CAR), специфичных к опухолевым антигенам [1, 2]. Альтернативно можно вводить рекомбинантную ДНК, кодирующую Т-клеточ-ный рецептор [3, 4]. Преимущество CAR-технологии заключается в возможности ее использования для всех пациентов, независимо от совместимости по HLA-анти-генам, а также в случае, когда опухоль уклоняется от воздействия цитотоксических Т-лимфоцитов вследствие снижения экспрессии молекул HLA [1].
CAR состоит из внеклеточного короткого трансмембранного домена и внутриклеточного домена [5]. Внеклеточный домен является распознающей частью и состоит из одноцепочечного вариабельного фрагмента иммуноглобулина scFv (single-chain Fv). Внутриклеточный домен включает одну (1-е поколение), две (2-е поколение) или три (3-е поколение) сигнальных последовательности, запускающие стимуляцию (CD3z) и костимуляцию (костимулирующие молекулы) лимфоцита при встрече с опухолевым антигеном. Генетический материал, кодирующий CAR, может быть введен в клетки с помощью ретровирусной трансдукции [2, 6], что приводит к конститутивной экспрессии CAR в Т-клетках, либо путем электропорации плазмиды/ мРНК, что приводит к временной экспрессии имму-норецепторов, сводя к минимуму риск потенциальной аутоагрессии и нарушений в геноме.
В настоящее время нами разрабатывается генно-терапевтическое средство CAR-CEA (ранее карплазмин [7]), предназначенное для лечения РЭА-позитивных опухолей человека (РЭА - раково-эмбриональный антиген, carcinoembryonic antigen, CEA; CEACAM5; CD66e). Препарат представляет собой аутологичные донорские лимфоциты, модифицированные с помощью электропо-рации плазмидной ДНК, кодирующей ген CAR, специфичный к РЭА. После введения плазмиды в условиях ex vivo на поверхности клеток экспрессируется продукт гена CAR-CEA. Распознающая часть CAR является фрагментом вариабельного участка моноклонального антитела 3С1, специфичного к домену A1B1 молекулы РЭА [8].
Как нами было показано ранее, лимфоциты, транс-фецированные исследуемой плазмидой, избирательно поражают линии клеток, экспрессирующие РЭА (А549 и НСТ116) [8, 9], а также демонстрируют выраженную противоопухолевую активность in vivo на модели бести-мусных мышей с РЭА-позитивной перевиваемой опухолью человека [7].
Важная задача доклинических исследований -оценка фармакокинетики нового препарата на лабора-
торных животных. При получении CAR-лимфоцитов методом электропорации плазмиды ее ДНК не интегрируется в геном клетки и последние могут иметь относительно короткое время жизни. Поэтому для выяснения динамики распределения и сохранности CAR-CEA в тканях организма реципиента нами была изучена фар-макокинетика CAR-лимфоцитов после их однократного внутривенного введения мышам. В рамках доклинических исследований была изучена фармакокинетика CAR-CEA на модели экспериментальных животных (мыши линии B6D2F1) и определено время полувыведения препарата.
Материал и методы
Исследования проведены в соответствии с Федеральным законом № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» от 12.04.2010; ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики GLP» от 01.108.2015; методическими указаниями по изучению фармакокинетики фармакологических веществ [10]. Исследование было одобрено независимым экспертным советом по медицинской этике Российского научного центра рентгенорадиологии (Москва, Россия).
Тестируемый препарат. Лимфоциты, модифицированные плазмидной ДНК 3C1-3g (Медгамал, Россия), Молекулярная ф°рмула плазмнды C10915^137143N41961O67164Pn194 и молекулярная масса 3 458 337 Да. Плазмида 3C1-3g кодирует CAR 3-го поколения [11], состоящий из анти-ген-распознающего домена scFv (клон антитела 3C1); шарнирного участка CD8; трансмембранного домена CD28; костимулирующих доменов CD28, CD 137 (4-1BB) и сигнального CD247 (Ç-цепь).
Получение CAR-CEA. Выделение суспензии моно-нуклеарных клеток крови мышей линии B6D2F1 проводили следующим образом: свежую кровь, взятую с помощью сердечной пункции у 40 животных (0,8-1 мл на животное) объединяли, обрабатывали антикоагулянтом (гепарин 500 МЕ/мл), добавляли двойной объем фосфатно-солевого буфера, рН 7,4 (ФСБ) и полученную суспензию наслаивали на раствор фиколла-урографина (плотность 1,090 г/см3, «ПанЭко», Россия) в объемном соотношении 2 : 1. Разделение клеток проводили центрифугированием в течение 40 мин при 400 g, после чего отбирали интерфазный слой. Клетки отмывали от фиколла в ФСБ дважды и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 400 g. Трансфекцию проводили на приборе Nucleofector II (Amaxa Biosystemsс, Германия) с помощью набора «Mouse T Cell Nucleofector Kit» (Amaxa Biosystems, Германия) и программы X-100 для мышиных Т-клеток согласно инструкции производителя. Для трансфекции одного образца использовали 9 млн клеток и 5 мкг плазмиды 3C1-3g.
Трансфецированные клетки культивировали в чашках Петри для адгезивных культур в полной ростовой питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной сыворотки эмбрионов коров («ПанЭко», Россия), 2 мМ L-глутамина, 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США). Посев-
ная концентрация составляла 2 млн кл/мл. Лимфоциты стимулировали к пролиферации добавлением 50 Ед/мл ИЛ-2 (НПК «Биотех», Россия), 2 мкг/мл ФГА («ПанЭко»).
После 24 ч инкубации клетки центрифугировали при 400 g в течение 15 мин, промывали в ФСБ и ресуспен-дировали в том же буфере до достижения концентрации 5 млн клеток/мл. Качество препарата лимфоцитов контролировали микроскопически, состав клеточной популяции определяли при помощи гематологического анализатора «Адвия-60» (Bayer HealthCare LLC, США). Препарат содержал 95-96 % лимфоцитов с жизнеспособностью 70 % и был использован для исследования фармакокинетики на мышах.
Исследование фармакокинетики CAR-CEA. Исследование фармакокинетики проводилось на 42-х мышах линии B6D2F1. Препарат сингенных лимфоцитов, трансфецированных плазмидой 3C1-3g, вводили в хвостовую вену в количестве 0,2 мл в дозе 1 млн клеток. Стандартное питание животные получали через 2 ч после начала эксперимента. Для изучения фарма-кокинетики забор крови и образцов тканей проводили по временному графику, представленному в таблице. На каждую временную точку брали 3 экспериментальных животных.
Животных выводили из эксперимента методом передозировки эфирного наркоза. После вскрытия грудной и брюшной полости кровь шприцем забирали из полости сердца в пробирки, содержащие 50 мкл 6 % раствора ЭДТА, оценивали объем. Для получения образцов плазмы часть крови центрифугировали дважды - 5 мин при 250 g, супернатант отбирали и центрифугировали повторно 10 мин при 2500 g, оценивали объем и замораживали. Для получения образцов клеток крови 1 мл крови центрифугировали в течение 5 мин при 250 g, осадок замораживали.
При заборе фрагменты печени, легкие, селезенку и тимус взвешивали. Исследуемые образцы ткани массой 20-200 мг измельчали на более мелкие фрагменты в чашке Петри с добавлением 500 мкл ФСБ (pH 7,4). Измельченные ткани помещали в гомогенизатор Medimachine (Dako, Дания) с 1,5 мл ФСБ. Гомогенизацию проводили в течение 2 мин, после чего с клеточную суспензию помощью шприца извлекали, фильтровали через сито (50 мкм), добавляли 1 мл ФСБ и центрифугировали в течение 5 мин при 250 g. После удаления супернатанта к материалу осадка добавляли необходимый объем ФСБ. Анализ содержания ДНК плазмиды также проводили в пробе исходного препарата трансфецированных лимфоцитов мышей. Для этого аликвоты по 0,2 мл, содержащие 1 млн клеток, осаждали центрифугированием, удаляли супернатант, осадок замораживали и хранили при -20 °С до выделения ДНК.
Количественное определение препарата CAR-CEA методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Выделение ДНК из трансфеци-рованных лимфоцитов, клеток крови, плазмы и тканей
Временной график забора крови и образцов тканей при исследовании фармакокинетики
№ п/п Маркировка образца Время забора образца (после введения препарата)
1 1-3 30 мин
2 4-6 1 ч
3 7-9 6 ч
4 10-12 1 сут
5 13-15 2 сут
6 16-18 3 сут
7 19-21 4 сут
8 22-24 6 сут
9 25-27 8 сут
10 28-30 10 сут
11 31-33 12 сут
12 34-36 15 сут
13 37-40 21 сут
14 41-42 30 сут
проводили с использованием набора «К-Сорб» («Син-тол», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Выделенную ДНК хранили при -20 °С.
Для постановки реакции ПЦР в реальном времени использовали готовые реакционные смеси «ПЦР-Микс» («Синтол», Россия). ПЦР-пробы объемом 15 мкл содержали 0,2 мкМ прямого (hCAR3G-F1) и обратного (hCAR3G-R1) праймеров (5 '-CTGTGATTTCTGGGTGCTGG-3' и 5 '-TAATGCTTGCGGGTGGGT-3', соответственно), 0,2 мкМ зонда hCAR3G-TP1 (FAM-TGGTCGTTGGT GGAGTCCTGGCTT-BHQ1) и 5 мкл образца ДНК. Для проведения ПЦР использовали следующий режим: инкубация 5 мин при 95 °С, далее 40 циклов 94 °С 15 с, 60 °С 60 с. В качестве калибровочных образцов использовали 10-кратные разведения плазмиды 3C1-3g (с концентрацией от 0,4 пг/мл до 0,4 мкг/мл), содержащие 25 нг/мкл ДНК тимуса теленка в качестве фоновой ДНК. ПЦР проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Анализ кривых амплификации, определение пороговых циклов и абсолютных значений концентрации целевой ДНК в пробах проводили с использованием стандартного программного обеспечения (CFX Manager, Bio-Rad).
Оценка фармакокинетических показателей. Для описания фармакокинетики препарата CAR-CEA, в крови и тканях использовали следующие показатели (в условных обозначениях, принятых в литературе [12]): к - константа элиминации (ч-1); Cmax - максимальная концентрация (мкг/мл); AUC- полная площадь под кривой (ч х мкг/мл); Cl - общий клиренс (мл/ч/кг); Vd - кажущийся объем распределения (мл); t122 = 0,693 / ке - период полувыведения (ч).
3
о
С о S Я « 3
ра
80-
60-
—Селезенка —О- Легкие ▼ Тимус ~~/У~ Печень
рг В в
о
40-
и
I
20-
0-
1 10 100 1000 Время, ч
Рис. 1. Средние значения концентрации препарата CAR-CEA (в пг/г ткани) в тканях селезенки, легких, тимуса и печени мышей после однократного внутривенного введения CAR-CEA [сингенных лимфоцитов (1 млн клеток), трансфецированных плазмидой (32,1 ± 6,3 нг на млн клеток)]
Здесь и на рис. 2: приведены выборочные средние значения и стандартные ошибки средних.
Показатели Cmax и ke оцениваются из вида кривой концентрации. Исходные формулы для расчета остальных показателей следующие:
AUC= \C(t)dt. (1)
Cl = D /AUC. (2)
Vd = D / Cmax, (3)
где D - введенная доза препарата.
Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных проводили с применением программного статистического пакета Statistica v10 (StatSoft, США). Для анализа всех данных применена описательная статистика: подсчитаны средние арифметические значения, стандартные отклонения
à S
в & ег
160140120-§ 100 -806040200-
1
100
1000
10
Время, ч
Рис. 2. Средние значения концентрации препарата CAR-CEA (в пг/мл крови) в клетках крови мышей после однократного внутривенного введения в дозе 1 млн сингенных лимфоцитов, трансфецированных плазмидой (32,1 ± 6,3 нг на млн клеток)
и стандартные ошибки среднего. Кинетические кривые анализировали с применением сглаживания и аппроксимации [12].
Результаты
Для исследования фармакокинетики препарата CAR-CEA мы провели анализ распределения плазмиды 3C1-3g в тканях реципиента во времени после однократного внутривенного введения CAR-CEA мышам линии B6D2F1. Как показал ПЦР-анализ препарата, однократная доза CAR-CEA содержит 32,1 ± 6,3 нг плазмидной ДНК. Распределение плазмиды в тканях представлено на рис. 1. В тканях легкого и тимуса максимальные значения накопления препарата регистрируются через 30 мин после введения (44,7 ± 0,7 и 24,4 ± 2,7 пг/г ткани соответственно). Затем концентрация препарата в тканях легкого начинает быстро снижаться, опускаясь до 6 % от его максимального значения уже на 2-е сутки. В тимусе элиминация происходит медленнее, опускаясь до 9 % от максимальной концентрации только на 8-е сутки. В тканях селезенки наблюдается более значительное накопление препарата и его элиминация происходит медленнее: максимальные значения накопления препарата регистрируются через 30 мин-1 ч после введения (71,0-71,4 пг/г ткани), после чего концентрация постепенно снижается, достигая 10 и 7 % от максимального значения на 3-и и 4-е сутки соответственно. В ткани печени не наблюдается значимого накопления препарата (5,7 ± 1,1 пг/ г ткани через 30 мин после введения), а ко 2-м суткам после введения происходит практически полная элиминация препарата из ткани печени.
Концентрация препарата CAR-CEA в клетках крови заметно превышает его накопление в органах и остается значительной в течение 1 нед после инъекции (рис. 2). Экспериментальные данные по накоплению препарата в цельной крови, представленные на рис. 2, были аппроксимированы экспоненциальной функцией и использованы для вычисления основных фармакоки-нетических показателей препарата CAR-CEA. Максимальная концентрация в цельной крови (Cmax) наблюдалась через 30 мин после введения - 124,8 ± 29,5 пг/мл. Период полувыведения (t1/2) составил 104,9 ± 7,0 ч, площадь под кривой «концентрация-время» (AUC) -17 405,3 ± 1399,2 пг х ч/мл, кажущийся объем распределения (Vd) - 257,3 ± 12,0 мл, общий клиренс (Cl) -1,9 ± 0,2 мл/ч. Через 3 нед уровень плазмиды в крови составлял 8,9 ± 1,8 пг/мл, а через 4 нед - 5,9 ± 0,3 пг/мл. Следует отметить, что концентрация плазмиды, определенная в плазме крови через 30 мин после введения CAR-лимфоцитов, составляла 40,1 ± 0,9 пг/мл и падала до 0 на 2-е сутки эксперимента. Учитывая отсутствие плазмиды в плазме крови начиная со 2-х суток эксперимента, можно утверждать, что вся плазмида, определенная в образцах цельной крови, связана с циркулирующими лимфоцитами.
Обсуждение
В настоящее время наиболее распространенным методом модификации лимфоцитов является их транс-дукция с помощью ретровирусных векторов [6]. В этом случае происходит интеграция генетического материала, переносимого вектором, в геном клетки. Поэтому при стимуляции антигеном такие клетки пролиферируют, сохраняя интегрированную ДНК, что обеспечивает постоянную экспрессию химерного рецептора. Как правило, для исследования фармако-кинетики трансдуцированных CAR-лимфоцитов их вводят животным с перевитой опухолью, результатом чего является их последующая экспансия и накопление в опухолевом очаге [13]. Такой способ модификации лимфоцитов приводит в ряде случаев к злокачественной трансформации CAR-Т-лимфоцитов [14]. Поэтому, по нашему мнению, получение CAR-лимфоцитов трансфекцией плазмидной ДНК методом электропорации обладает рядом преимуществ, в частности - это самый быстрый и дешевый способ получения CAR-лимфоцитов, а также отсутствует вероятность инсерционного мутагенеза и активации онкогенов.
Следует также отметить, что постоянная антигенная стимуляция CAR-лимфоцитов клетками опухоли в организме реципиента приводит к «цитокиновому шторму» (неконтролируемому выбросу лимфокинов), который трудно купировать. В этом случае временная экспрессия химерного рецептора Т-лимфоцитами, полученными методом электропорации, в сочетании с возможностью их дозирования и дробного введения, позволяет контролировать лечение и смягчить побочные эффекты
■ Литература
1. June C.H., O'Connor R.S., Kawalekar O.U. et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 2018; 359 (6382): 1361-5. DOI: https://doi.org/10.1126/ science.aar6711
2. Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Курилин В.В., Пашкина Е.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотип и эффекторные функции GD2-специфичных CAR-T-клеток in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535
3. Zhang J., Wang L. The Emerging World of TCR-T Cell Trials Against Cancer: A Systematic Review. Technol. Cancer Res. Treat. 2019; 18: 1533033819831068. DOI: https://doi.org/10.1177/1533033819831068
4. Кузнецова М.С., Терещенко В.П., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Алрхмун С., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотипические и функциональные особенности генерированных in vitro TCR-T-клеток, специфичных к опухоль-ассоциирован-ному антигену NY-ESO-1. Иммунология. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547
терапии, в отличие от трансдукции, при которой лимфоциты способны к пролиферации и длительной экспрессии CAR.
В свете вышеизложенного исследование параметров фармакокинетики CAR-CEA в организме после однократного внутривенного введения чрезвычайно актуально. Наши данные показывают, что полученные трансфекцией CAR-лимфоциты имеют ограниченное время циркуляции в кровотоке: период их полувыведения составляет 4-5 дней. Как нами было установлено ранее на модели бестимусных мышей с перевитой человеческой опухолью HCT116, введение CAR-лимфоцитов с интервалом в 1 нед приводит к очевидному терапевтическому эффекту: 7 инъекций, выполняемых еженедельно, обеспечили 80 % выживаемость мышей при 100 % смертности в контрольной группе [7]. На основе новых данных можно предположить, что сокращение интервала между инъекциями до 4-5 дней могло бы привести к более выраженному терапевтическому эффекту.
Таким образом, наши результаты показывают, что CAR-лимфоциты до 1 мес персистируют в кровотоке, а это делает возможным их применение в противоопухолевой терапии. Поддержание высокого уровня циркулирующих CAR-лимфоцитов в течение длительного времени, очевидно, потребует их повторных инъекций через определенные промежутки времени. Оптимизация дозы CAR-CEA в повторных инъекциях с учетом ответа реципиента на их введение позволит снизить вероятность такого осложнения, как «цитокиновый шторм», которое часто наблюдается при введении долгоживущих лимфоцитов, трансдуцированных лентивирусами.
5. Dotti G., Gottschalk S., Savoldo B. et al. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells. Immunol. Rev. 2014; 257 (1): 107-26. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12131
6. Okuma A. Generation of CAR-T Cells by Lentiviral Transduction. In: Mammalian Cell Engineering. (Kojima R. ed). Methods in Molecular Biology Springer US: New York, NY; 2021; 3-14. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1441-9_1
7. Боженко В.К., Шишкин А.М., Шкопоров А.Н. и др. Исследование подавления роста опухоли, экс-прессирующей раково-эмбриональный антиген, новым высокотехнологичным препаратом карплазмин (CAR-T-терапия) у мышей линии Balb/c nude. Успехи молекулярной онкологии. 2023; 10 (1): 79-86. DOI: https://doi. org/10.17650/2313-805X-2023-10-1-79-86
8. Боженко В. К., Кудинова Е. А., Шкопоров А. Н., Лебедин Ю.С., Кулинич Т.М., Шишкин А.М. Мономолекулярный химерный Т-клеточный рецептор к раково-эмбриональному антигену. Патент РФ RU2652955 C1 (Заявка 2015155637 от 24.12.2015; ФГБУ РНЦРР Минздрава России).
9. Bozhenko V.K., Shramova E.I., Shishkin A.M., Iva-nov A.V, Khokhlova E.V., Lebedin Y.S., Shkoporov A.N. Characteristics of new monomolecular chimeric T-cell receptors to carcinoembryonic antigen. Bull. Exp. Biol. Med. 2013; 156 (1): 165-71. DOI: https://doi.org/10.1007/ s10517-013-2302-2
10. Хабриев Р. У Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва : Медицина, 2005. 826 с. ISBN: 5225042198
11. Katiyar V, Chesney J., Kloecker G. Cellular Therapy for Lung Cancer: Focusing on Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) Cells and Tumor-Infiltrating Lymphocyte
■ References
1. June C.H., O'Connor R.S., Kawalekar O.U., et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 2018; 359 (6382): 1361-5. DOI: https://doi.org/10.1126/ science.aar6711
2. Philippova J.G., Kuznetsova M.S., Shevchenko J.A., Tereshchenko V.P., Fisher M.S., Kurilin V.V., Pash-kina E.A., Akahori Ya., Shiku H., Sennikov S.V. Pheno-type and effector functions of GD2-specific CAR-T lymphocytes in vitro. Immunologiya. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535 (in Russian)
3. Zhang J., Wang L. The Emerging World of TCR-T Cell Trials Against Cancer: A Systematic Review. Tech-nol Cancer Res Treat. 2019; 18: 1533033819831068. DOI: https://doi.org/10.1177/1533033819831068
4. Kuznetsova M.S., Tereshchenko V.P., Shevchenko J.A., Fisher M.S., Kurilin V.V., Alsalloum A., Alrhmoun S., Akahori Y., Shiku H., Sennikov S.V. Phenotypic and functional features of in vitro generated TCR-T lymphocytes specific for the tumor-associated antigen NY-ESO-1. Immunologiya. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547 (in Russian)
5. Dotti G., Gottschalk S., Savoldo B., et al. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells. Immunol Rev. 2014; 257 (1): 107-26. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12131
6. Okuma A. Generation of CAR-T Cells by Lentiviral Transduction. In: Mammalian Cell Engineering. (Kojima R. ed). Methods in Molecular Biology Springer US: New York, NY; 2021; 3-14. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1441-9_1
7. Bozhenko V.K., Shishkin A.M., Shkoporov A.N., et al. Study of the suppression of a tumor growth expressing a car-cinoembryonic antigen with a new high-tech drug carplas-
(TIL) Therapy. Cancers. 2023; 15 (14): 3733. DOI: https:// doi.org/10.3390/cancers15143733
12. Пиотровский В.К. Метод статистических моментов и интегральные модельно-независимые параметры фармакокинетики. Фармак. и токсикол. 1986; (5): 118-27.
13. Lu Y.J., Chu H., Wheeler L.W., et al. Preclinical Evaluation of Bispecific Adaptor Molecule Controlled Folate Receptor CAR-T Cell Therapy With Special Focus on Pediatric Malignancies. Front. Oncol. 2019; 9: 151. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00151
14. FDA Investigating CAR-Related T-cell Malignancies. Cancer Discov. 2024; 14 (1): 9-10. DOI: https://doi. org/10.1158/2159-8290.CD-NB2023-0091
min (CAR-T therapy) in Balb/c nude mice. Adv Mol Oncol. 2023; 10 (1): 79-86. DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2023-10-1-79-86 (in Russian)
8. Bojenko VK., Kudinova E.A., Shkoporov A.N., Lebedin Y.S., Kulinich T.M., Shishkin A.M. Monomolecular Chimeric T-Cell Receptor to a Carcinoembryonic Antigen. RF Patent RU2652955 C1 (Application 2015155637 from 24.12.2015; RNCRR of the Ministry of Health of the Russian Federation). (in Russian)
9. Bozhenko VK., Shramova E.I., Shishkin A.M., Iva-nov A.V, Khokhlova E.V, Lebedin Y.S., Shkoporov A.N. Characteristics of new monomolecular chimeric T-cell receptors to carcinoembryonic antigen. Bull Exp Biol Med 2013; 156 (1): 165-71. DOI: https://doi.org/10.1007/s10517-013-2302-2
10. Habriev R.U. Guidelines For The Experimental (Pre-clinical) Study Of New Pharmacological Substances. Moscow: Medicine, 2005. 826 p. ISBN: 5225042198 (in Russian)
11. Katiyar V, Chesney J., Kloecker G. Cellular Therapy for Lung Cancer: Focusing on Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) Cells and Tumor-Infiltrating Lymphocyte (TIL) Therapy. Cancers. 2023; 15 (14): 3733. DOI: https://doi. org/10.3390/cancers15143733
12. Piotrovskij V.K. The method of statistical moments and integral model-independent parameters of pharmacoki-netics. Pharmacology and Toxicology. 1986; (5): 118-27. (in Russian)
13. Lu Y.J., Chu H., Wheeler L.W., et al. Preclinical Evaluation of Bispecific Adaptor Molecule Controlled Folate Receptor CAR-T Cell Therapy With Special Focus on Pediatric Malignancies. Front Oncol. 2019; 9: 151. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00151
14. FDA Investigating CAR-Related T-cell Malignancies. Cancer Discov. 2024; 14 (1): 9-10. DOI: https://doi. org/10.1158/2159-8290.CD-NB2023-0091
■ Сведения об авторах
Боженко Владимир Константинович - д-р мед. наук, проф., зав. научно-исследовательским отделом молекулярной биологии и экспериментальной терапии опухолей ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8351-8152
Шкопоров Андрей Николаевич - Prof. of Molecular Microbial Ecology, APC Microbiome Ireland, University College Cork, Cork, Ireland E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5547-8672
Шишкин Александр Михайлович - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. иммунологии и онкоцитологии ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8934-2845
Киселева Яна Юрьевна - канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. иммунологии и онкоцитологии ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8352-4787
Кулинич Татьяна Михайловна - канд. мед. наук, зав. лаб. иммунологии и онкоцитологии ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2331-5753
Кудинова Елена Александровна - д-р мед. наук, зав. клинической лаб., ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5530-0591
Аминулла Камилла Гуламовна - мл. науч. сотр. лаб. иммунологии и онкоцитологии ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected]
Ранджит Раджеш - аспирант ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва; ассистент каф. онкологии и рен-тгенорадиологии им. В.П. Харченко, ФНМО Медицинского института ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4255-4197
Солодкий Владимир Алексеевич - академик РАН, д-р мед. наук, проф., директор ФГБУ «РНЦРР» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1641-6452
■ Authors' information
Vladimir K. Bozhenko - MD, PhD, Prof., Head of the Research Dept. of Molecular Biology and Experimental Therapy of Tumors, RSCRR of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8351-8152
Andrey N. Shkoporov - Prof. of Molecular Microbial Ecology, APC Microbiome Ireland, University College, Cork, Ireland
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5547-8672
Alexander M. Shishkin - PhD, Senior Researcher of the Immunology and Oncocytology Lab., RSCRR of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8934-2845
Yana Yu. Kiseleva - PhD, Researcher of the Immunology and Oncocytology Lab., RSCRR of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8352-4787
Tatyana M. Kulinich - PhD, Head of the Immunology and Oncocytology Lab., RSCRR of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2331-5753
Elena A. Kudinova - MD, PhD, Head of the Clinical Lab., RSCRR of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5530-0591
Kamilla G. Aminulla - Junior Researcher of the Immunology and Oncocytology Lab., RSCRR of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected]
Rajesh Ranjit - Postgraduate Student of the RSCRR of the MOH of Russia; Assistant at the Dept. of Oncology and Radiology n.a. VP. Kharchenko, Medical Institute, RUDN University n.a. P. Lumumba, MSHE of Russia, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4255-4197
Vladimir A. Solodky - Academician of RAS, MD, PhD, Prof., Director of the RSCRR of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-1641-6452
