CC BY
30
УдК 663.5
исследование динамики изменения состава углеводов и органических кислот
зернового сусла методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
И. М. Абрамова,
д-р техн. наук;
B. А. Поляков,
д-р техн. наук, профессор, академик РАН; М. Э. Медриш, канд. техн. наук; Д. А. Гаврилова;
C. В. Павленко ВНИИПБТ — филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Среди ключевых параметров технологического процесса производства спирта значительную роль играет содержание сбраживаемых углеводов (мальтозы, глюкозы, фруктозы) и органических кислот [1]. Дифференциальная оценка их содержания на разных стадиях технологического процесса позволяет оптимизировать процесс брожения, следить за качеством исходного сырья и используемых ферментов [2].
Наиболее часто применяемый метод определения сбраживаемых углеводов в России — это фото-электроколориметрический с использованием антронового реагента [3]. Недостатки метода — большое число операций и кипячение с серной кислотой, но он позволяет определять только суммарное коли-
2,0
СО
* 1,5
ш
I 1,0
сц &
5 0,5 0
0 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5
Время, мин
mV (х100)
Детектор A
о от и от
1 ta £ В 2 * * ГО о о S ГО > u £
рЛ^-------- -в-
—i—г—т—i— lili i i ItI 1 1 1 1 1 1 1 1 п-г+пп lili 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Рис. 1. Образец сусла (пшеница).
Концентрация: мальтозы 8,16 г/100 см3, глюкозы 1,27 г/100 см3, фруктозы 0,102 г/100 см3, молочная кислота 0,03 г/100 см3, уксусная кислота 0,07 г/100 см3. Условия разделения: элюент H2O, колонка Rezex ROA-Organic Acid H+, 300x7,80, температура 60 °С, скорость потока 0,6 см3/мин
чество углеводов в сусле и бражке. Другие известные способы определения углеводов в жидких средах: спектральные методы [4], методы газовой хроматографии [5, 6] и капиллярного электрофореза [7, 8] имеют свои недостатки (трудоемкость, дороговизна, длительное время анализа).
Кислотность сусла и бражки определяют титриметрическим способом [9], недостатки которого: субъективность определения точки конца титрования, изменение во времени концентрации раствора щелочи, наличие димеров в растворах слаборазбавленных органических кислот, большие затраты времени на проведение анализа. Кроме того, с применением данного метода возможно лишь суммарное определение органических кислот. Существующий метод капиллярного электрофореза с кондуктометриче-ским детектированием по ГОСТ Р 55761-2013 [10] не позволяет определять анионы органических кислот в зерновом сусле и бражке, так как слабые органические кислоты: уксусная, яблочная, молочная — слабо диссоциируют в водном растворе. Таким образом, основная часть кислот в водном растворе находится в недиссоциированной форме и лишь небольшая часть — в виде солей органических кислот, определяемых данным методом.
Таким образом, актуальным направлением современных исследо-
ПИВО и НАПИТКИ
5 • 2016
ваний служит разработка высокочувствительного, точного метода анализа, который позволит упростить и удешевить процедуру определения сбраживаемых углеводов и органических кислот, обеспечить возможность постоянного мониторинга изменения состава углеводов и органических кислот зернового сусла при его сбраживании. Перспективен метод использования высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим (для определения органических кислот) и рефрактометрическим (для определения углеводов) детектированием [10]. В европейских странах метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) применяется для анализа углеводов и органических кислот в жидких средах [11, 12].
Цель данной работы — определение углеводов и органических кислот на различных стадиях технологического процесса брожения с помощью метода ВЭЖХ со спектрофотометри-ческим и рефрактометрическим детекторами.
Массовые концентрации глюкозы, мальтозы, фруктозы, уксусной и молочной кислот в зерновом сусле и бражке определяли на хроматографе Shimadzu LC-2010 со спектрофотометрическим детектором SPD-20A и дифференциальным рефрактометрическим детектором RID-10A с использованием хроматографической колонки Rezex ROA-Organic Acid H+, содержащей смолу с 8 %-ной степенью сшивки в водородной ионной форме (300x7,8 мм, размер частиц 8 мкм). В качестве элюента применялась ультрачистая вода для ионной хроматографии (18 МОм-см). Скорость потока подвижной фазы 0,6 см3 / мин. Давление 2,3 МПа, максимальная температура в колонке — 60 °С, объем 20 мкл.
Метод основан на процессах лигандного обмена и ионной экс-клюзии, приводящих к разделению углеводов и органических кислот на разделительной хроматогра-фической колонке, последующем детектировании и определении их концентрации в сусле и бражке. Диапазоны измерений массовой концентрации мальтозы, глюкозы, фруктозы 0,01-4,0 г/ 100 см3, массовой концентрации уксусной, молочной кислот 0,01-5,0 г/ 100 см3.
Чонтроль КАЧЕСТВА
mV (x100)
Детектор
1 ^ о U
1 Is о о ГО
Г > р \в о о ж t^ А г \ i
■ ' ■ ■ 1 ■ ■ ■ « 1 » 1 т 1 | iti г iT| 1 1 1 1 | ■ I» ■ ■ ■ 1 ■ » ■ ■ 1 ■ ■ iT ■ 1 ■ ■ ■ ■ 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 22,5
5 0,5
Время, мин
0
Рис. 2. Образец бражки, 26 ч брожения (1-й бражной аппарат).
Концентрация: мальтозы 7,48 г/100 см3, глюкозы 1,07 г/100 см3, фруктозы 0,072 г/100 см3, молочная кислота 0,18 г/100 см3. Условия разделения: элюент H2O, колонка Rezex ROA-Organic Acid H+, 300x7,80, температура 60 °С, скорость потока 0,6 см3/мин
Рис. 3. Образец бражки, 38 ч брожения (2-й бражной аппарат).
Концентрация: мальтозы 3,56 г/100 см3, глюкозы 0,57 г/100 см3, фруктозы 0,03 г/100 см3, молочная кислота 0,21 г/100 см3. Условия разделения: элюент H2O, колонка Rezex ROA-Organic Acid H+, 300x7,80, температура 60 °С, скорость потока 0,6 см3/мин
mV (x10)
Детектор . A
го
от и
СЦ
я я S о л
1 1 1 1 1 1 1 1 ' 'т' ' 0 о 1______§ JUJ: > о 1
Д^аА_ ■ 1 1 i л ' 'т' ' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 —J N ♦ ' 'т' ' 1 ' '
10,0 12,5 Время, мин
0
Рис. 4. Образец бражки, 50 ч брожения (6-й бражной аппарат).
Концентрация: мальтозы 0,23 г/100 см3, глюкозы 0,084 г/100 см3, фруктозы 0,03 г/100 см3, молочная кислота 0,22 г/100 см3. Условия разделения: элюент H2O, Rezex ROA-Organic Acid H+, 300x7,80, температура 60 °С, скорость потока 0,6 см3/мин
Для изучения динамики изменения углеводного состава сырья были проанализированы различные образцы сусла и бражки, отобранные из 1-го, 2-го и 6-го браж-ных аппаратов соответственно. После предварительной пробо-подготовки пробы сусла и бражки подвергали хроматографическому
анализу. Образцы фильтровали через бумажный фильтр, затем центрифугировали в течение 7 мин при 13 000 мин-1. На рис. 1 представлена хроматограмма образца зернового сусла, на рис. 2, 3, 4 — бражек, отобранных из 1-го, 2-го и 6-го бражных аппаратов соответственно.
5 • 2016 ПИВО и НАПИТКИ 45
контроль КАЧЕСТВА4
4
V \
\
4 4
\
\
\ \
о ------- ---'■•A ;
10
40
20 30
Время, ч
■ Мальтоза Глюкоза Фруктоза Молочная кислота
Рис. 5. Изменение углеводного состава и молочной кислоты при сбраживании образца сусла
в бражке не превышает 0,20, что свидетельствует о нормальном процессе брожения.
На рис. 6 представлена диаграмма динамики изменения углеводного состава.
Таким образом, применение разработанных методик с использованием ВЭЖХ позволяет определять массовые концентрации углеводов и органических кислот в широком диапазоне концентраций; идентифицировать и количественно определять мальтозу, глюкозу, фруктозу, уксусную, молочную кислоты, а также отслеживать динамику изменения углеводного состава и органических кислот в зерновом сусле и бражке на всех стадиях технологического процесса производства спирта.
8
6
4
° 2
0
50
Образец Мальтоза, г/100 см3 г „. Молочная Глюкоза, Фруктоза, гЛЮОзм3 г/700см3 «Ж Время удерживания, мин 10,1 10,8 13,6 Уксусная кислота, г/100 см3 Титруемая кислотность, град (°)
8,5 15,7
Сусло (пшеница) 8,16 1,27 0,102 0,03 0,07 0,30
Бражка 2б ч брожения 7,48 1,07 0,072 0,18 — 0,40
Бражка 38 ч брожения 3,56 0,57 0,03 0,21 — 0,47
Бражка 50 ч брожения 0,23 0,084 0,03 0,22 — 0,49
Сусло
I
1-й бражной чан 2-й бражной чан б-й бражной чан
Мальтоза Глюкоза Фруктоза Молочная кислота
Рис. 6. Динамика сбраживания пшеничного сусла
На рис. 5 представлен график изменения углеводного состава и органических кислот при сбраживании образца зернового сусла.
В таблице представлены массовые концентрации углеводов и органических кислот.
Из рис. 5 видно изменение концентраций углеводов и молочной кислоты в сусле при сбраживании: снижение концентраций мальтозы, глюкозы и фруктозы и увеличение концентрации молочной кислоты. При этом нарастание кислотности
ЛИТЕРАТУРА
1. Абрамова, И. М. Научное обоснование методологии комплексного контроля спиртового и ликероводочного производства с целью повышения качества и безопасности алкогольной продукции: Автореф. дис. ... д-ра техн. наук. — Москва, 2014. — 51 с.
2. Алферов, В. А. Определение содержания углеводов и спиртов в полупродуктах спиртовых производств с использованием биосенсоров/В. А. Алферов, В. А. Ар-ляпов, С. С. Каманин // Известия Тульского государственного университета. — 2010. — Вып. 2. — С. 247-255.
3. ГОСТ 31683-2012 Зерновое крахмалсо-держащее сырье для производства этилового спирта. Методы определения массовой доли сбраживаемых углеводов. — Введ. 2013-07-01. — М.: Стандар-тинформ: ФГУП «Стандартинформ», 2013. — III, 24 с.
4. Deriy, E. Refinement of the physical and chemical methods for the determination of sugars/E. Deriy, S. Livynchuk, A. Metelev, V. Nosenko // Ukrainian Journal of Food Science. — 2013. — Vol. 1. — P. 54-58.
5. Escudero, R. R. Optimization of carbohydrate silylation for gas chromatography // J. of Chromatography A. — 2004. — V. 1027. — P. 117-120.
6. Fuzfai, Z. Simultaneous Identification and Quantification of the Sugar, Sugar Alcohol and Carboxylic Acid Contents of Sour Cherry, apple and Beer fruits as their Trimethylsilyl Derivates, by Gas-Chromatography-Mass Spectrometry/Z. Fuzfai, Z. F. Katona, E. Kovacs, I. Molnar-Perl // J. Agric Food Chem. — 2004. — Vol. 52. — Vol. 74447452.
46 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2016
7. Ramirrez, S. C. Indirect determination of carbohydrates in wort samples and dietetic products by capillary electrophore-sis/Ramirrez S. C., Carretero A. S., Blanco C. C., BermuT dez de Castro M. H., A. F. Gutierrez // Journal of the Science of Food and Agriculture. — 2005. — Vol. 85. — P. 517-521.
8. Klampfl, C. W., Determination of carbohydrates by capillary electrophoresis with electro spray mass spectrometric detec-tion/C. W. Klampfl, W. Buchberger // Electrophoresis. — 2001. — Vol. 22. — P. 2737-2742.
9. Абрамова, И. М. Инструкция по техно-химическому и микробиологическому контролю спиртового производства. — М: Дели принт, 2007. — 480 с.
10. ГОСТ 55761—2013 Замесы, сусло, бражка из пищевого сырья. Определение массовой концентрации катионов, анионов органических и неорганических кислот методом капиллярного электрофореза. — Введ 2013-11-08. — М.: Госстандарт России: изд-во стандартов, 2014. — 13 с.
11. Абрамова, И. М. Инновации в сфере
Чонтроль качества
контроля качества алкогольных напитков/И. М. Абрамова, М. Э. Медриш, С. В. Павленко // Спиртные напитки. — 2013. — № 5. — С. 52.
12. Jurkova, M. Determination of Total Carbohydrate Content in Beer Using Its Pre-column Enzymatic Cleavage and HPLC-RI/M. Jurk-ova, P. Cejka, K. Sterba // Food Anal. Methods. — 2014. — Vol. 7. — P. 1677-1686.
13. Stemmelen, A. Determining the sugar content in grape juice by HPLC-RID // Master Analysis and Control. — 2012. — P. 39. &
Исследование динамики изменения состава углеводов и органических кислот зернового сусла методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Ключевые слова
бражка; высокоэффективная жидкостная хроматография; глюкоза; мальтоза; молочная кислота; органические кислоты; сусло; углеводы; уксусная кислота; фруктоза.
Реферат
Современные технологии производства спирта из зернового сырья направлены на получение максимального выхода готового продукта с хорошими органолептическими показателями. Вследствие чего для обеспечения безопасности и качества продукции возникает необходимость в оперативном управлении процессами производства спирта. Контроль процесса осахаривания сусла особенно важен, поскольку позволяет отслеживать степень осахаривания крахмала, количество образовавшихся сбраживаемых углеводов, а, следовательно, и выход конечного продукта. В обычных условиях спиртового брожения из гексоз под действием ферментов, наряду с этиловым спиртом, образуются побочные продукты (глицерин, органические кислоты, спирты, альдегиды). Количество и скорость образования органических кислот зависят от многих факторов. Все нарушения, происходящие во время технологического процесса брожения, негативно сказываются на качестве готового продукта. Реализация мер по повышению качества испытаний алкогольной продукции и сырья для ее производства включает применение и внедрение современных инструментальных методов. Наиболее высокочувствительным и точным методом анализа углеводов и органических кислот в сусле и бражке служит метод высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим (для определения органических кислот) и рефрактометрическим (для определения углеводов) детектированием. Разработанные методики позволяют не только идентифицировать и количественно определять углеводы и органические кислоты, но и отслеживать динамику изменения состава углеводов и органических кислот зернового сусла и бражки на всех стадиях технологического процесса производства спирта. С применением данных методик сокращается время анализа углеводов и органических кислот, упрощается и удешевляется процедура их определения.
Авторы
Абрамова Ирина Михайловна, д-р техн. наук;
Поляков Виктор Антонович, д-р техн. наук, профессор, академик РАН;
Медриш Марина Эдуардовна, канд. техн. наук;
Гаврилова Дарья Алексеевна;
Павленко Светлана Владимировна
ВНИИПБТ — филиал ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
111033, г. Москва, ул. Самокатная, 4-б, [email protected]
Investigation of Dynamic Changes in the Composition of Organic Acids and Carbohydrates of Corn Mash by Method of HPLC
Key words
mash; high performance liquid chromatography; glucose; maltose; lactic acid; organic acids; wort; carbohydrates; acetic acid; fructose.
Abstract
The purpose of current ethanol production technology from grain is the obtaining of the maximum possible output of finished product with good organoleptic characteristics. The result is that to ensure the safety and quality of products there is a need in the operational handling of alcohol production process. Control of the process of saccharification wort is particularly important because it allows to monitor the degree of saccharification of starch, the amount of fermentable carbohydrates formed, and therefore the final product yield. Under ordinary conditions of alcoholic fermentation by-products (glycerol, organic acids, alcohols, aldehydes) form of hexoses by enzymes together with ethanol. The number and rate of formation of organic acids depends on many factors. All violations that occur during the process of fermentation have a negative impact on the quality of the finished product. Implementation of measures to improve the quality of testing of alcohol and raw materials for its production involves the application and introduction of modern instrumental methods. High performance liquid chromatography with spectrophotometric detection (for the determination of organic acids) and refractive index detection (for determination of carbohydrates) is the most highly sensitive and accurate method of analysis of carbohydrates and organic acids in the wort and mash. The developed methods allows not only to identify and quantify the carbohydrates and organic acids, but also to follow the dynamics of changes in the composition of carbohydrates and organic acids in grain wort and mash at all stages of the alcohol production process. With the use of these methods reduces the time of analysis of carbohydrates and organic acids, simplifies and reduces the cost of the procedure to determine them.
Authors
Abramova Irina Mihailovna, Doctor of Technical Science; Polyakov Victor Antonovich,
Doctor of Technical Science, Professor, Academician of RAS; Medrish Marina Eduardovna, Candidate of Technical Science; Pavlenko Svetlana Vladimirovna; Gavrilova Darya Alekseevna
VNIIPBT — branch FGBUN «FIC Food and Biotechnology»
4-b Samokatnaya St., Moscow, 111033, Russia, [email protected]
5 • 2016 ПИВО и НАПИТКИ 47
