CC BY
127
Лукаткин А.А., Ибрагимова С.А., Ревин В.В.
ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П. Огарева», г Саранск
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИФУНГАЛЬНЫХ СВОЙСТВ PSEUDOMONAS AUREOFACIENS 2006
Изучена возможность использования хитина для увеличения уровня биомассы и сохранения жизнеспособности бактерий Pseudomonas aureofaciens 2006. Проведены лабораторные испытания фунгизащитного действия культуральной жидкости исследуемых бактерий. Показано, что предварительная обработка семян томата и последующее внесение бактерий в почву замедляет или полностью тормозит рост фитопатогенных грибов Fusarium culmorum и Botrytis cinerea. Антогонистичес-кие бактерии Pseudomonas aureofaciens 2006, внесенные в почву, способствуют ее оздоровлению.
Ключевые слова: биопрепараты, Pseudomonas aureofaciens 2006, антифунгальные свойства, хитин.
Интенсификация сельскохозяйственного производства предполагает широкое применение пестицидов, что увеличивает опасность загрязнения продуктов растениеводства. Развитие биотехнологических способов защиты сельскохозяйственных растений от болезней связано с разработкой новых биопрепаратов, не только функционально эффективных, но и экологически безопасных как для человека, так и для почвенной микробиоты [1]. Бактерии рода Pseudomonas относятся к числу наиболее перспективных агентов биологической защиты сельскохозяйственных растений от заболеваний. Среди представителей этой группы микроорганизмов встречаются не только антагонисты почвенных фитопатогенов [2, 3, 4], многие штаммы Pseudomonas активно способствуют улучшению роста и развития растений [5, 6, 7, 8]. Являясь типичными представителями ризосферы растений и обладая высокой скоростью роста, интро-дуцированные псевдомонады успешно колонизируют ризосферу растения-хозяина [9, 10, 11] и контролируют развитие фитопатогенов как за счет конкуренции за экологическую пищу - источники углерода и энергии [12], так и продуцируя различные антифунгальные метаболиты [13] или гидролитические ферменты, разрушающие клеточные стенки грибов [14, 15].
При разработке технологии биопрепаратов важно подобрать питательные среды, обеспечивающие не только максимальный выход биомассы, но и снижение себестоимости готового продукта. Перспективным является использование промышленных отходов. Одним из таких отходов спиртового производства является барда, содержащая белки, минеральные соли, остатки полисахаридов. Традиционный и наиболее простой путь использования барды -скармливание животным в нативном виде -
вследствие быстрого закисания является затруднительным и экономически убыточным. Использование жидкой фракции послеспирто-вой барды как основы питательной среды при выращивании Pseudomonas aureofaciens 2006 позволит удешевить технологию получения биопрепарата для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.
Для совместного решения существующих проблем нами предложен способ глубинного выращивания бактерий Pseudomonas aureofaciens на жидкой фракции послеспирто-вой барды с последующей обработкой посевного материала и почвы при выращивании культурных растений.
В работе изучалось влияние хитина на увеличение выхода биомассы и сохранение жизнеспособности бактерий Pseudomonas aureofaciens 2006 при культивировании на жидкой фракции послеспиртовой барды. Была проведена оценка фунгизащитных свойств культуральной жидкости исследуемых бактерий в отношении развития фитопатогенных грибов при выращивании томата.
Материалы и методы
Объектами исследования служили чистые культуры бактерии Pseudomonas aureofaciens 2006, селекционированной на кафедре биотехнологии Мордовского госуниверситета им. Н.П. Огарева, и фитопатогенных грибов Fusarium culmorum и Botrytis cenerea, предоставленных сотрудниками кафедры микологии и альгологии Московского госуниверситета им. М.В. Ломоносова. Грибные культуры поддерживали на среде Чапека - Докса, бактерии - на глюкозо-пептонном агаре.
Ранее нами были оптимизированы условия роста Pseudomonas aureofaciens 2006 на жидкой
фракции послеспиртовой барды [18, 19]. Для увеличения титра клеток глубинное культивирование проводили на послеспиртовой барде с добавлением коллоидного хитина в количестве 1% от объема среды при 150 об/мин и 28 °С в течение 23 часов. Каждые 2 ч., начиная с 17 ч. культивирования, определяли сухую биомассу методом высушивания по стандартной методике.
Для определения микопаразитических свойств бактериальной суспензии проводили обработку семян и ростков томата в следующих вариантах: 1 - семена, обработанные культуральной жидкостью, содержащей живую культуру бактерии Ps. aureofaciens 2006; 2 - замачивание семян и вторичная обработка бактериальной суспензией ростков томата; 3 - необработанные семена (контроль). После всхода семян и формирования листьев осуществляли заражение почвы путем внесения суспензии фитопатогенных грибов Fusarium culmorum и Botrytis cinerea, выращенных на картофельной среде при 28 0С в течение 2 сут. Активность бактерий в отношении фитопатогенов оценивали по отсутствию зоны роста грибов в почве и развитию растений.
Все результаты получены не менее чем в двух последовательных опытах, каждый из которых состоял из пяти повторностей. Результаты обрабатывали статистически по общепринятым в биологии методам [20]. Сравнение вариантов опытов проводили при 5% уровне значимости по t-критерию Стьюдента. В таблице представлены средние значения из всех опытов с их стандартными ошибками.
Результаты и обсуждение
Известно, что многие виды бактерий рода Pseudomonas за счет секреции хитиназ способны использовать хитин в качестве единственного источника углерода. Кроме того, продукция хитиназ многими организмами является важным защитным фактором против воздействия различных патогенов. Поэтому в качестве дополнительного источника углерода и для активации ферментного комплекса бактерий мы использовали коллоидный хитин.
Было получено, что при культивировании бактерий Ps. aureofaciens 2006 на жидкой фракции послеспиртовой барды без добавления хитина (контроль) максимальное количество био-
массы образовывалось через 21 час роста и превысило начальное значение в 5,9 раза (табл. 1). Добавление коллоидного хитина в барду не только увеличило выход бактериальной биомассы в 1,3 раза относительно контроля, но и позволило уменьшить время культивирования до 20 часов. При этом титр активных клеток составил 3,5 * 108 в 1 мл. Через 45 суток хранения при пониженной температуре культуральная жидкость бактерий характеризовалась высоким содержанием жизнеспособности клеток 108 КОЕ/мл.
Полученная бактериальная суспензия была использована для дальнейшей обработки семян. Замачивание семян в культуральной жидкости бактерий не повлияло на скорость их прорастания, но способствовало ускоренному всходу и развитию ростков томата по сравнению с контролем. Ускоренный рост, согласно литературным данным, обусловлен выделением бактериями Pseudomonas ростового фактора индолил-3-уксусной кислоты (ИУК), которая стимулирует развитие корневой системы растений и улучшает фосфорное питание [21].
После формирования растений все варианты опыта были подвержены заражению фитопатогенами путем их внесения в грунт. При наблюдении за ростом томатов было отмечено, что поверхность грунта контрольных, т.е. не обработанных псевдомонадами ростков, оказалась заражена, как и часть побегов, грибами. Процент гибели контрольных ростков томата при воздействии гриба F. culmorum составил 21%, а B. cinerea - 10%. В варианте с вторичной обработкой суспензией Ps. aureofaciens 2006 заражения фитопатогенны-
Таблица 1. Динамика содержания биомассы Pseudomonas aureofaciens 2006 при культивировании на жидкой фракции послеспиртовой барды
Время культивирования, часы Нативная барда Барда с добавлением хитина
О 1,5 О,1 1,5 О,1
2 3,? О,1 5,3 О,3
11 ?,6 0,5 9,8 О,?
19 ?,9 0,5 1О,9 О,?
2О 8,4 О,6 11,5 О,8
21 8,6 О,6 1О,6 О,?
22 8,9 О,6 1О,5 О,?
23 8,О 0,5 1О,2 О,?
ми грибами опытных растений отмечено не было. В варианте, где обрабатывались только семена томата, выявлен незначительный процент заражения растений. При повторной обработке пораженных фитопатогенами участков грунта и растений культуральной жидкостью бактерий удалось добиться уменьшения площади заражения грибами и не было выявлено новых погибших растений.
Следует отметить, что в исследуемых условиях развитие B. cinerea по сравнению с F. culmorum происходило менее интенсивно, что может являться результатом более сильного влияния антифунгальных веществ, продуци-
руемых Ps. aureofaciens 2006, на данный фитопатоген.
Наблюдение на предмет обнаружения зараженного грунта ни в одном из исследуемых вариантов растений спустя 30 суток с момента заражения грибами такового не выявило.
Таким образом, показано, что обработка семян и ростков томата культуральной жидкостью Ps. aureofaciens 2006 может значительно снизить потери урожая от вредоносного действия фитопатогенных грибов. Кроме того, орошение почв культуральной жидкостью Ps. aureofaciens 2006 способствует ее оздоровлению за счет снижения уровня развития фитопатогенов.
Список использованной литературы:
1. Логинов О.Н. Новые микробиологические препараты для сельского хозяйства и восстановления окружающей среды. Автореферат дис. ...д-ра биол. наук. УФА: институт биологии УНЦ РАН, 2004.
2. Osburn, R.M., Schroth, M.N., Hancook, J.G. et al. Dinamics of sugar beet colonization by Pythium ultomum and Pseudomonas species: effects on seed rot and damping-off // Physiol plant. - 1990. - V. 79. - №6. - P. 709-716.
3. Elsherif, M., Grossmana, F. Versuche zur biologischen Bekamplung einiger phytopathogener Pilze durch fluoreszierende Pseudomonaden under Anwendung verschiedener Applikationsverfahren // Z. Pflanzenkrankh und Pflanzensehutz. - 1991. -Bd. 98. - № 3. - S. 236-249.
4. Zaspel, J. Isotierung and Selektion fluoreszierender Pseudomonas-Artenals Antagonisten gegen Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx et Olivier // Arch. Phytopathol. Pflzsehuts. 1989. Bd. 25. H.2. S. 123-130.
5. Максимова, Н.П., Лысак, В.В., Игнатович, В.В. и др. Пат.2051586 Российская Федерация, 6 А01 N63/00, C 12 N 1/20// C 12 N 1/20, C 12 R 1:40. Штамм бактерий Pseudomonas putida - биостимулятор роста растений. Заявлено 12.07.91; Опубл. 10.01.96. Биол. 1.
6. Pietr S.J. Kempa R. Cucumber rhizosphere pseudomonas as antagonists of Fusarium // Interrelationships Between Microorganisms and Plant Soil / Proc. Int. Symp. Praha: June 22-27, 1987. P. 411-417.
7. Renato de Freitas J., GermidaJ.J. Pseudomonas cepacia and Pseudomonas putida as winter wheat inoculation for biocontrol of Rhizoctonia solani // Can. J. Microbiol. 1991. V. 37. № 10. P. 780-784.
8. Свешникова, Е.В. Новые бактерии рода Pseudomonas - антагонисты фитопатогенов и перспективы их использования в сельскохозяйственной практике. Автореферат дис. ...канд. биол. наук. Уфа: институт биологии УНЦ РАН, 2003.
9. Гарагуля, А.Д., Бабич, Л.В., Киприанова, Е.А. Способность различных видов бактерий рода Pseudomonas к колонизации корней пшеницы // Микробиол. - 1988. - Т. 50. - №. 6. - С. 77-81.
10. Bahme, J.B., Schroth, M.N. Spatial-temporal colonization pattems of a rhizobacterium on undegraund organs of potato // Phetopathology. - 1987. - V. 77. - №. 7. - P. 1093-1100.
11. Caponlgro, V., Contillo, R. Coloizzazione radicale di tobacco con Pseudomonas fluorescenti // Ann. 1st. Sper. Tabacco. Scafoti (Salerno). - 1986. - v. 12. - P. 49-64.
12. Lugtenberg, B.J.J., Dekkers L.C., What makes Pseudomonas bacteria rhizosphere competent? // Environ. Microbiol. - 199. -V. 1. - P. 9-13.
13. Thomashow, L.S., Weller, D.M. Current concepts in the use of introduced bacteria for biological disease control: mechanisms and antifungal metabolites // Plant Microbe Interactions. Ed by Staccy G., Keen N. / New York: Chapman and Hall. - 1996. - V. 1. - P. 187-235.
14. Dunne, C., Moenne, L.Y., McCarthy, J. et al. Combining proteolytic and phloroglacinol-producting bacteria for improved biocontrol of Pythium - mediated damping-off of sugar beet // Plant pathology. - 1998. - V. 109. - P. 299-307.
15. Шапошников, А.И. Механизмы антагонисического действия бактерий на фитопатогенные грибы в ризосфере овощных культур. Автореферат дис. .канд. биол. наук. УФА: институт биологии УНЦ РАН, 2003.
16. Антипов, С.Т., Журавлев, А.В. Послеспиртовая зерновая барда: Технология переработки // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2005. - №4. - С. 9-11.
17. Олийничук, С.Т., Кошель, М.И., Каранов, Ю.А. Утилизация мелассной послеспиртовой барды и очистка стоков // Техника и технология. -2006. - №2. - С. 42-43.
18. Лукаткин, А.А., Ибрагимова, С.А., Ревин, В.В. Изучение влияния степени перемешивания на рост бактерий Pseudomonas aureofaciens на послеспиртовой барде // Первые чтения памяти профессора О.А.Зауралова. - 2007. - С. 69-71.
19. Лукаткин, А.А., Ибрагимова, С.А., Ревин, В.В. Оптимизация условий культивирования бактерий Pseudomonas aureofaciens на послеспиртовой барде // Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине. - 2007. - С. 144-145.
20. Лакин, Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа. - 1980. - 293 с.
21. Смирнов, В.В., Киприанова, Е.А. Бактерии рода Pseudomonas / Киев: Наук. Думка. - 1990. - 264 с.
