CC BY
70
УДК 579.264
АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ
PSEUDOMONAS A UREOFA CIENS
© 2012 г. Е.В. Хархун, А.В. Полякова, В.А. Русанов, В.В. Внуков
Хархун Екатерина Викторовна - ассистент, кафедра биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая 105, г. Ростов н/Д, 344006; e-mail: [email protected].
Kharkhun Ekaterina Viktorovna - Assistant, Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Biology and Soils, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105, Rostov-on-Don, 344006, e-mail: [email protected].
Полякова Анна Владимировна - кандидат биологических наук, доцент, кафедра биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая 105, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: [email protected].
Polaykova Anna Vladimirovna - Candidate of Biological Science, Associate Professor, Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Biology and Soils, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105, Rostov-on-Don, 344006, e-mail: [email protected].
Русанов Виктор Андреевич - кандидат биологических наук, доцент, кафедра биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая 105, г. Ростов н/Д, 344006, e-mail: [email protected].
Rusanov Victor Andreevich - Candidate of Biological Science, Associate Professor, Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Biology and Soils, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105, Rostov-on-Don, 344006, e-mail: [email protected].
Внуков Валерий Валентинович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии и микробиологии, биолого-почвенный факультет, Южный федеральный университет, ул. Б. Садовая 105, г. Ростов н/Д, 344006; e-mail: [email protected].
Vnukov Valeriy Valentinovich - Doctor of Biological Science, Professor, Head of Department of Biochemistry and Microbiology, Faculty of Biology and Soils, Southern Federal University, B. Sadovaya St., 105, Rostov-on-Don, 344006, e-mail: [email protected].
Изучена антагонистическая активность штамма Pseudomonas aureofaciens, выделенного из почв промышленной зоны города Ростова-на-Дону, в отношении плесневых грибов и бактериальных культур. Показано, что данный штамм псевдомонады, ингибирует прорастание спор плесневых грибов Fusarium sp. и Cladosporium cucumerinum. Результаты свидетельствуют, что данный штамм является перспективным для дальнейшего изучения с целью создания на его основе бактериального препарата.
Ключевые слова: Pseudomonas aureofaciens, антагонистическая активность, фитопатогены, плесневые грибы.
It was researched an antagonistic activity of strain Pseudomonas aureofaciens against fungi and bacterial cultures. The strain was selected from soils of the industrial zone ofRostov-on-Don city. It was shown that strain ofPseudomonas inhibits a germination of spores for fungi Fusarium sp. and Cladosporium cucumerinum. Results indicate that the strain is promising for further researching in order to create on its basis a bacterial preparation.
Keywords: Pseudomonas aureofaciens, antagonistic activity, phytopathogens, mold fungi.
В сложившихся условиях современного аграрного производства для получения биологически полноценной продукции растениеводства и сохранения плодородия почв необходимо экологически целесообразное хозяйствование [1]. Появление на рынке новых химических фунгицидов принципиально не меняет общую ситуацию в защите растений от болезней. Опасные заболевания зачастую носят эпифитотический характер, налицо не только увеличение вредоносности известных, но и появление новых опасных видов фито-патогенов [2]. В некоторых странах (Германия, Англия) на значительных площадях сельскохозяйственных угодий реализуется идея полного отказа от применения средств химической защиты растений [3].
Во многих странах мира, в том числе и в России, интерес к использованию достижений микробиологии в сельском хозяйстве неизмеримо возрос, расширены представления о роли микроорганизмов в жизни растений, сформулированы приоритетные практические задачи по дополнительному вовлечению атмосферного азота и почвенного фосфора в процесс усвоения их растениями [4]. Актуальным способом борьбы с фи-топатогенными микроорганизмами является применение биопрепаратов на основе ризобактерий, обла-
дающих способностью активно заселять ризосферу и ризоплану растений, используя питательные вещества, поставляемые растениями в составе корневых экзометаболитов. Такие антифунгальные бактерии способны контролировать развитие фитопатогенов в ризосфере растений как за счет конкуренции за экологическую нишу - источника углерода и энергии, так и продуцируя различные антифунгальные метаболиты или гидролитические ферменты, разрушающие клеточные стенки грибов [5].
В настоящее время бактерии, обладающие совокупностью полезных для растений свойств, принято обозначать как PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizo-bacteria - ризобактерии, способствующие росту растений). Исследования этой перспективной для практики группы ризобактерий вызывают большой интерес. Среди PGPR различных таксономических групп широким набором полезных для растений свойств выделяются ризосферные бактерии рода Pseudomonas. Они являются потенциальными объектами агробио-технологии для разработки на их основе биологических средств защиты растений от фитопатогенов, а также биопрепаратов, стимулирующих рост и повышающих продуктивность растений [6].
Цель настоящей работы - подбор оптимальной питательной среды для максимальной продукции антибиотических веществ штаммом Pseudomonas aureofaciens, изучение его антагонистической активности в отношении плесневых грибов и бактериальных культур и влияния на прорастание спор фитопатогенных плесневых грибов.
Объекты и методы исследования
Объектом исследования служил штамм Pseudomonas aureofaciens, выделенный из почв промышленной зоны г. Ростова н/Д.
Для подбора питательной среды, оптимальной для синтеза антибиотических веществ, антагонистическую активность штамма Pseudomonas aureofaciens изучали методами «агаровых блочков» и «колец». Для постановки первого метода было выбрано 6 агаризованных сред, из которых 4 являются универсальными для роста почвенных бактерий, такие как мясо-пептонный агар (МПА) (1:10), МПА (1:100), крахмало-аммиачный агар (КАА), почвенный агар (ПА), а среды № 2 (лимоннокислый аммоний - 0,5 %; глицерин - 1,5; MgSO4 - 0,02; K2HPO4 - 0,2 %) и № 4 (крахмал - 2 %, соевая мука -7,5, CaCO3 - 0,5, (NH4bSO4 - 0,2 %) используются для промышленного получения грамицидина и баци-трацина. Для получения культуральной жидкости при постановке метода «колец» было выбрано 8 сред - это указанные выше 6 сред в жидкой консистенции и дополнительно среды № 1, 3, используемые для получения антибиотических веществ при культивировании актиномицетов. В качестве тест-культур взято 6 штаммов микроорганизмов, отличающихся по морфологии, окраске по Граму, способности к спорогенезу: Proteus sp., Micrococcus sp. (из музея живых культур лаборатории микробиологии кафедры биохимии и микробиологии ЮФУ), Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, Bacillus cereus и Erwinia herbicola (выделенные с поверхности листовых пластинок пшеницы).
Антагонистическую активность штамма Pseudomonas aureofaciens по отношению к плесневым грибам изучали на среде Чапека методом агаровых блочков. В качестве тест-объектов для определения спектра антагонистического действия псевдомонад служили плесневые грибы: Aspergillus niger Varga, Frisvad & Samson, Aspergillus amylovorus Panas, Penicillium sp. (1), Penicillium sp. (2), Fusarium moniliforme J. Sheld (из коллекции плесневых грибов кафедры биохимии и микробиологии и кафедры ботаники ЮФУ), Cladosporium cucumerinum Elis & Arthur (выделенный с пораженных листьев и стеблей сортовых огурцов), Penicillium ochro-chloron ВКМ 2032 Biourge, Penicillium chrysogenum ВКМ 245 Thom, Penicillium brevicompactum ВКМ 234 Dierckx, Aspergillus terreus ВКМ 1025 Thom. Культуру Pseudomonas aureofaciens выращивали на двух агаризо-ванных средах: № 2 и 4. После 3- и 5-суточного культивирования вырезали блоки и поместили на среду Чапека, засеянную сплошным газоном суспензией спор плесневых грибов. Чашки инкубировали в термостате в течение 5 сут при температуре 28 °С. Зоны отсутствия и подавления роста грибов, образовавшиеся вокруг блоков, измеряли в мм.
Для изучения влияния штамма Pseudomonas aureofaciens на прорастание спор фитопатогенных грибов проведено совместное культивирование исследуемого антагониста с плесневыми грибами Cladosporium cucumerinum (выделенными с пораженных листьев и стеблей сортовых огурцов) и Fusarium sp. (выделенными с пораженных семян пшеницы) методом микрокультуры [7]. Культуру псевдомонады в течение 3 сут выращивали на двух жидких питательных средах, оптимальных по составу для синтеза антифунгальных метаболитов, № 2, 4. Культивирование осуществлялось в 100 мл питательной среды в колбах объемом 500 мл при температуре 28 °С. Далее в каплю культуральной жидкости (108 кл/мл) вносили конидии плесневых грибов (титр 106 спор/мл). Размеры ростковых трубок и гиф плесневых грибов измеряли на 1-е, 2-е и 3-и сут совместного культивирования при температуре 27 °С с помощью винтового окулярного микрометра. Контрольным считался рост плесневых грибов в капле стерильной водопроводной воды.
Результаты и обсуждение
Анализ полученных данных показывает, что степень антагонизма Pseudomonas aureofaciens по отношению к исследуемым тест-культурам зависела от состава питательных сред: наибольшую антагонистическую активность штамм Pseudomonas aureofaciens проявляет при культивировании его на крахмало -аммиачной среде. При этом максимальные зоны отсутствия роста достигали 13 мм для штамма Bacillus subtilis (рис. 1а). Однако максимальная средняя антагонистическая активность для 3 видов рода Bacillus наблюдается на агаризованной среде № 2 и составляет 10,7 мм.
Ни на одной из рассмотренных сред не было обнаружено антагонизма Pseudomonas aureofaciens с тремя тест-культурами: Erwinia herbicola, Proteus sp., Micro-coccus sp. Наиболее чувствительным микроорганизмом к исследуемой культуре оказался Bacillus subtilis.
При оценке антагонистической активности методом колец в толще агара установлено, что на питательных средах № 1, 3 не обнаружено антагонистической активности ни к одной тест-культуре, из чего можно сделать вывод, что эти среды не подходят для синтеза вторичных метаболитов штаммом Pseudomonas aureofaciens (рис. 1б). Также можно отметить, что в целом антагонистическая активность исследуемой псевдомонады в 1,5-2 раза выше при культивировании ее на плотных питательных средах, что можно объяснить большей концентрацией антибиотических веществ в зоне непосредственного взаимодействия.
Из данных табл. 1 видно, что исследуемые плесневые грибы обладают разной степенью чувствительности к действию метаболитов, продуцируемых штаммом Pseudomonas aureofaciens: суммарные зоны фунгицид-ной и фунгистатической активности составили от 2 до 16-18 мм. Установлено, что Cladosporium cucumerinum среди исследованных 10 плесневых грибов наиболее чувствителен к воздействию культуры-антагониста, при этом следует помнить, что представители рода Cladosporium являются фитопатогенами.
cf о S м S
ч «
s
о
m
14 12 10 8 6 4 2 0
Bacillus Bacillus Bacillus Erwinia Proteus sp. Micrococcus
subtilis pumilis cereus herbicola sp.
Тест-культуры
&МПА (1:10) °МПА (1:100) ™КАА &ПА П среда №2 & среда №4
S
s «
и S
tn S
ч <я s
о
m
12
10
6
4
2
00000000
00000000
•-гзл^^тл
Bacillus pumilis
Erwinia herbicola
Proteus sp.
Micrococcus sp.
Тест-культуры
&МПБ*(1:10) ВМПБ(1:100) &ПВ** ШКАС*** В Среда№1 В Среда№2 И Среда№3 О Среда№4
* - МПБ - мясо-пептонный бульон; ** - ПВ - почвенная вытяжка; *** - КАС - крахмал-аммиачная среда.
Рис. 1. Результаты изучения антибактериальной активности Pseudomonas aureofaciens: а - полученные
методом «агаровых блочков»; б - полученные методом «колец» в толще агара
Анализ данных показывает, что максимальную антибиотическую активность в отношении большинства плесневых грибов, за исключением Penicillium ochro-chloron и Penicillium sp. (2), исследуемый штамм проявляет на 3-и сут культивирования, при этом наблюдаются самые большие зоны отсутствия роста до 11 мм. А для таких грибов, как Fusarium moniliforme и Penicillium chrysogenum, действие на 3-и и 5-е сут одинаково.
По результатам эксперимента совместного культивирования Pseudomonas aureofaciens со спорами плесневых грибов установлено, что уже на 1-е сут наблюдается заметное угнетение прорастания конидий по сравнению с контролем (рис. 2). Под воздействием метаболитов антагониста происходит ограничение
развития ростковых трубок с формированием на кончиках растущих гиф сферопластов.
Рис. 2. Прорастание конидий Cladosporium cueumerimm^. а -контроль. 8 ч инкубации. Световая микроскопия. Увеличение х 600; б - совместно с антагонистом на среде № 2. 8 ч инкубации. Световая микроскопия. Увеличение х 900
10 10
8
0
Таблица 1
Антагонистическая активность Pseudomonas aureofaciens по отношению к плесневым грибам
Плесневые грибы Рост мицелия плесневого гриба от посевного блока, мм
Среда № 2 | Среда № 4
сут
3-и 5-е 3-и 5-е
Aspergillus niger 0+8* 0 2+12* 2+5*
Aspergillus amylovorus 15* 0+2* 3+7* 1+5*
Aspergillus terreus 3+15* 0+6* 5 7
Penicillium sp. (1) 2 0 2+9* 4+2*
Penicillium sp. (2) 0 6* 3+8* 3+8*
Penicillium ochrochloron 2+2* 3 2+12* 5
Penicillium chrysogenum 0+5* 0+5* 4+12* 4+13*
Penicillium brevicompactum 3 2 2 0
Cladosporium cucumerinum 8 2+6* 11 8
Fusarium moniliforme 0+5* 0+5* 0+6* 2+6*
* - зона подавленного роста
Так, размеры ростковых трубок Fusarium sp. при выращивании антагониста на средах № 2, 4 в 1,9 и 2,5 раза меньше по сравнению с контролем, а для Cla-dosporium cucumerinum эти показатели значительно выше - в 5,1 и 9,2 раза соответственно (табл. 2).
Таблица 2
Влияние Pseudomonas aureofaciens на прорастание спор плесневых грибов
Среда Размер ростковых трубок и гиф, мкм
Fusarium sp. Cladosporium cucumerinum
сут сут
1-е 2-е 3-и 1-е 2-е 3-и
Контроль 20,97 23,00 21,00 32,80 54,29 50,40
Среда № 2 11,10 12,90 13,48 6,45 7,35 31,26
Среда № 4 8,39 8,70 8,95 3,55 5,68 12,54
Из данных табл. 2 видно, что на среде № 4 размеры ростковых трубок и гиф у Fusarium sp. в 1,3 раза и
Cladosporium cucumerinum в 1,8 раза меньше, чем при культивировании на среде № 2. Таким образом, можно говорить о том, что среда № 4 наиболее оптимальна для синтеза вторичных метаболитов культурой
Pseudomonas aureofaciens.
Выводы
Таким образом, показано, что штамм Pseudomonas aureofaciens, выделенный из почв промышленной зоны г. Ростова н/Д, проявляет хорошо выраженную антагонистическую активность в отношении плесневых грибов и бактериальных культур на питательной среде № 4, данный штамм псевдомонады ингибирует прорастание спор плесневых грибов Fusarium sp. и Cladosporium cucumerinum, замедляя образование ростковых трубок и гиф, и является перспективным для дальнейшего изучения с целью создания на его основе бактериального препарата.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и образования РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (20092012 гг.)» № 2.1.1/5663).
Литература
1. Саламатова Ю.А., Минаева О.М., Акимова Е.Е. Эффективность хранения ряда бактериальных препаратов в жидкой форме // Вестн. Томского гос. ун-та. Биология. 2010. № 1, вып. 9. С. 20 - 28.
2. Новикова И.И. Полифункциональные биопрепараты для защиты растений от болезней // Земледелие. 2007. № 5. С. 22 - 24.
3. Фокин А.В. Биологизация защиты растений - процесс циклический? // Земледелие. 2010. № 3. С. 25.
4. Завалин А.А., Тарасов А.Л., Чеботарь В.К., Казакова А.Е. Эффективность применения под яровую пшеницу биопрепарата Bacillus subtilis X-13 при нанесении на гранулы аммиачной селитры // Агрохимия. 2007. № 7. С. 32 - 36.
5. Кравченко Л.В., Шапошников А.И., Макарова Н.М., Азарова Т.С., Тихонович И.А. Динамика численности анти-фунгальных штаммов Pseudomonas в ризосфере огурцов, выращиваемых в условиях гидропоники на минеральном тепличном субстрате // Микробиология. 2006. Т. 75, № 3. С. 404 - 409.
6. Боронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соро-совский образов. журн. 1998. № 10. С. 25 - 31.
7. Методы экспериментальной микологии / под ред. В.И. Билай. Киев, 1982. 551 с.
Поступила в редакцию
30 мая 2012 г
