CC BY
17
IMMUNOLOGY
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2021
Чельдиева Ф.А.12, Решетняк Т.М.12, Черкасова М.В.1, Лила А.М.12
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИФОСФОЛИПИДНЫХ АНТИТЕЛ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ И ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДАМИ У ПАЦИЕНТОВ С АНТИФОСФОЛИПИДНЫМ СИНДРОМОМ И СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКОЙ (ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ)
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой», лаборатория сосудистой ревматологии, 115522 Москва, Россия;
2ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава РФ, кафедра ревматологии, 123995, Москва, Россия
Антифосфолипидные антитела (аФЛ) - это семейство различных аутоантител, которые приводят к рецидивирующим тромбозам сосудов любой локализации и калибра, и/или акушерской патологии - потере плода. К серологическим маркерам антифосфолипидного синдрома (АФС) отнесены только три вида аФЛ - волчаночный антикоагулянт (ВА), антитела к кардиолипину (аКЛ) классов IgG и IgM, антитела к в2-гликопротеину1 (аР2ГП1) классов IgG и IgM. Средние и высокие уровни аКЛ и ав2ГП1 (IgG и/или IgM) были выбраны в качестве серологических маркёров в АФС классификационных критериях 2006 г. Порог значений, используемый от низких до умеренных и высоких уровней не был стандартизирован. Вопросы стандартизации аФЛ до сих пор остаются нерешенными, что приводит к получению неоднородных результатов проводимых исследований. Целью исследования была оценка сопоставимости исследования IgG/IgM-аКЛ и IgG/ IgM^p2rn1 иммуноферментным и хемилюминесцентным анализами у пациентов с АФС с системной красной волчанкой (СКВ) и без нее. Материалом для исследования служила периферическая кровь 70 пациентов (49 женщин и 21 мужчин) с АФС, из которых 21 (30%) - были с первичным АФС (пАФС) и 49 (70%) - с АФС в сочетании с СКВ. Всем участникам исследования проводилось определение IgG/IgM-аКЛ и IgG/IgM-аP2ГП1 методом иммуноферментного анализа. Методом хемилюминесцентного анализа было проведено исследование: IgG/IgM-аКЛ - у 70 пациентов; IgG/IgM^p2rn1 - у 69 пациентов. Результаты предварительных данных таковы: определение IgG-аКЛи IgG-аP2ГП1 хемилюминесцентным анализом информативнее согласно уровням позитивности по данным фирмы-производителя, по сравнению с иммуноферментным анализом (p < 0,05). Однако, при учете уровней позитивности антител, определяемых по результатам иммуноферментного анализа, уровень положительных значений по данным хемилюминесцентного анализа был гораздо выше показателей фирмы-производителя.
Ключевые слова: антифосфолипидные антитела; антифосфолипидный синдром; системная красная волчанка;
иммуноферментный анализ; хемилюминисцентный анализ; антитела к Ь2 гликопротеину 1; антитела к кардиолипину
Для цитирования: Чельдиева Ф.А., Решетняк Т.М., Черкасова М.В., Лила А.М. Исследование антифосфолипидных антител иммуноферментным и хемилюминесцентным методами у пациентов с антифосфолипидным синдромом и системной красной волчанкой (предварительные данные). Клиническая лабораторная диагностика. 2021; 66 (9): 546-551. https://doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-9-546-551
Для корреспонденции: Решетняк ТатьянаМагомедалиевна; д-р мед.наук, проф., зав. лаб. сосудистой ревматологии НИИР им. В.А. Насоновой, проф. каф. ревматологии РМАНПО; e-mail: [email protected]
CheldievaF.A.'-2, ReshetnyakT.M.12, CherkasovaM.V.1, LilaA.M.12
STUDY OF ANTIPHOSPHOLIPID ANTIBODIES BY ENZYME IMMUNOASSAY AND CHEMILUMINESCENT METHODS IN PATIENTS WITH ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME AND SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS (PRELIMINARY DATA)
1V.A. Nasonova Research Institute of Rheumatology, Laboratory of Vascular Rheumatology, 115522, Moscow, Russia;
2Russian Medical Academy of Continuing Professional Education, Ministry of Health of Russia, Department of Rheumatology, 123995, Moscow, Russia
Antiphospholipid antibodies (аPL) are a family of different autoantibodies that lead to recurrent vascular thrombosis of any localization and caliber, and/or obstetric pathology -fetal loss. Serological markers of antiphospholipid syndrome (APS) include only three types of aPL - lupus anticoagulant (VA), antibodies to cardiolipin (aCL) classes IgG and IgM, antibodies to p2-glycoprotein1 (aP2GP1) classes IgG and IgM. Medium and high levels of aCL and afi2HP1 (IgG and / or IgM) were selected as serological markers of APS in the 2006 classification criteria. However, the threshold of values used from low to moderately high levels has not been standardized. аPL standardization issues are still unresolved, resulting in heterogeneous results of the ongoing studies. The aim of the study was to assess the comparability IgG/IgM-aCL and IgG/IgM-ab2GP1 by enzyme-linked immunosorbent assay and chemiluminescent analysis in patients with APS with and without (systemic lupus erythematosus) SLE. The study included 70 patients (49 women and 21 men) with APS, of which 21 (30%) were with primary APS (pAPS) and 49 (70%) with APS in combination with SLE. All study participants underwent determination of IgG/IgM-a^ and IgG/IgM-aP2GP1 by enzyme-linked immunosorbent. A study was performed by the chemiluminescent analysis: IgG/IgM-aСL - in 70 patients; IgG/IgM-aP2GP1 - in 69 patients. Results. According to preliminary data, the determination of IgG-aCL and IgG-af2GP1 by the chemiluminescent analysis is informative in assessing positivity according to the manufacturer, compared with the enzyme-linked immunosorbent (р < 0.05). However, when taking into account the levels of antibody positivity determined by enzyme-linked immunosorbent, the level ofpositive values according to chemiluminescent analysis was much higher than the performance of the manufacturer.
Key words: antiphospholipid antibodies; antiphospholipid syndrome; systemic lupus erythematosus; enzyme immunoassay; chemiluminescent analysis; antibodies to b2 glycoprotein 1; antibodies to cardiolipin
ИММУНОЛОГИЯ
For citation: Cheldieva FA, Reshetnyak T.M., Cherkasova M.V., Lila A.M. Study of antiphospholipid antibodies by enzyme immunoassay and chemiluminescent methods in patients with antiphospholipid syndrome and systemic lupus erythematosus (preliminary data). Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2021; 66 (9): 546551. (in Russ.) https://doi.org/10.51620/0869-2084-2021-66-9-546-551
For correspondence: Reshetnyak T.M., MD, PhD, professor, head of the Laboratory of Vascular Rheumatology at the V.A. Na-sonova Research Institute of Rheumatology, professor of the Department of Rheumatology at the Russian Medical Academy of Postgraduate Education; e-mail: [email protected]
Information about authors:
Cheldieva F.A., https://orcid.org/0000-0001-5217-4932 Reshetnyak T.M., https://orcid.org/0000-0003-3552-2522 Cherkasova M.V., https://orcid.org/0000-0002-3246-1157 Lila A.M., https://orcid.org/0000-0002-6068-3080
Acknowledgment. The study had no sponsor support. Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Received 05.05.2021 Accepted 21.05.2021
Введение. Антифосфолипидные антитела (аФЛ) - это семейство различных аутоантител, которые взаимодействуют с фосфолипидными детерминантами клеточных мембран, фосфолипидно-белковыми комплексами, фос-фолипид-связывающими белками, белками свертывающей системы [1]. Наличие этих антител ассоциируется с развитием определенного клинического симптомоком-плекса, именуемого антифосфолипидным синдромом (АФС). АФС - аутоиммунная патология сосудов, клинически проявляющаяся рецидивирующими тромбозами сосудов любой локализации и калибра, и/или акушерской патологией - рецидивирующими потерями плода [2, 3]. К серологическим маркерам АФС, согласно Международным классификационным критериям [2], отнесены только три вида аФЛ, обнаруживаемые вместе или по отдельности - это волчаночный антикоагулянт (ВА), IgG и IgM антитела к кардиолипину (аКЛ), а также IgG и IgM антитела к р2-гликопротеину1 (аР2ГП1). Для диагностики АФС уровень этих антител должен быть средне- и высокопозитивным в двух последовательных определениях с промежутком не менее 12 недель. Это позволяет исключить транзиторное их повышение на фоне инфекций.
Средние и высокие уровни aКЛ (IgG и / или IgM) ассоциированные с клиническими проявлениями АФС были выбраны в качестве серологических критериев в 2006 году [2]. Однако порог, используемый от низких до умеренных и высоких уровней не был стратифицирован [2], и, обычно, используемые в клинических условиях анализы, особенно иммуноферментный, не имеют стандартизированных наборов, что приводит к существенным различиям в оценке позитивности антител между различными лабораториями [4-7].
Хемилюминесцентный анализ был использован для тестирования аутоантител [8-10], а полностью автоматизированная панель анализа HemosIL AcuStar показала сходные характеристики с коммерческими наборами для иммуноферментного анализа [8]. F. Van Hoecke и соавт.
[11] оценили уровни аКЛ и аР2ПП1 в автоматизированном хемилюминесцентном анализаторе для диагностики АФС и пришли к выводу, что хемилюминесцентный анализ сравним с иммуноферментным. Преимущества первого метода, по мнению авторов, в более простом (автоматизированном) использовании. S. Zhang и соавт.
[12] установили, что хемилюминесцентный анализ показал хорошие результаты в измерении аР2ГП1 и аКЛ, особенно для выявления IgG-аP2ГП1, и может быть более чувствительным в лабораторной диагностике АФС.
Цель исследования - оценить сопоставимость исследования IgG/IgM-аКЛ и IgG/IgM-ab2rni иммуноферментным и хемилюминесцентным анализами у пациентов с АФС с системной красной волчанкой (СКВ) и без нее.
Материал и методы. В исследование были включены 70 пациентов (49 женщин и 21 мужчина) с АФС, из которых у 21 (30 %) пациентов был первичный АФС (пАФС) и у 49 (70%) - АФС в сочетании с СКВ. Характеристика пациентов приведена в табл. 1.
Критериями включения в исследование служили наличие информированного согласия пациента, достоверность диагноза АФС [2], пациенты с «вероятным» АФС (наличие позитивных аФЛ в сочетании с одним из признаков: тромбоцитопения, livedo reticularis, патология клапанного аппарата сердца и др.), а также пациенты с достоверным диагнозом СКВ (ACR, 1997 г.) [13]. Критерии исключения: выраженная хроническая сердечно-легочная недостаточность, хроническая болезнь почек V стадии, печеночная недостаточность декомпенсирован-ная, хронические инфекции, способные привести к органной недостаточности, онкологические заболевания.
Всем пациентам проводилось определение IgG/IgM-аКЛ, IgG/IgM^ß2rn1 методом иммуноферментного анализа на автоматическом анализаторе для лабораторной диагностики аутоиммунных заболеваний Alegria (фирма «Orgentec Diagnostika GmbH», Германия) с набором реагентов для определения антител фирмы Orgentec Diagnostika GmbH (Германия). IgG-аКЛ измерялись в фос-фолипидсвязывающей активности IgG-аКЛ на 1 мкг/мл в единицах GPL (IgG phospholipid binding units (GPL Ед/мл), а IgM-аКЛ - в фосфолипидсвязывающей активности IgM-аКЛ на 1 мкг/мл в MPL (IgM phospholipid binding units (MPL Ед/мл). IgG/IgM-ab2ГП1 измеряли в Ед/мл. Уровни позитивности для IgG/IgM-аКЛ и IgG/ IgM^b2rn1 приведены в табл. 2.
Методом хемилюминесцентного анализа было проведено исследование IgG/IgM-аКЛ у 70 пациентов, IgG/ IgM^ß2rn1 - у 69 пациентов. Хемилюминесцентный анализ проводили на автоматизированном хемилюми-несцентном анализаторе BioFlash (фирма «Biokit S.A.», Испания). Набор реагентов для определения IgG/IgM-ab2ГП1 и IgG/IgM-аКЛ - AcuStar, Испания. Все антитела, определяемыми хемилюминесцентным анализом, измерялись в относительных световых единицах (relative light units - RLU). Позитивными, согласно фирме изготовителя, считались уровни > 20 RLU для IgG/IgM-аКЛ и IgG/IgM^rm.
IMMUNOLOGY
Таблица 1
Характеристика пациентов, включенных в исследование
Параметры IgG/IgM-аКЛ, n=70 ^/^М-аП2ГП1, n=69
Возраст, годы (М ± SD) 38,8 ± 9,6 38,8 ± 9,6
Число пациентов с СКВ+АФС / пАФС 48 / 22 48 / 21
Продолжительность АФС, Ме [25-75%], годы 9,9 [3,5-16,0] 9,9 [3,2-16,5]
Продолжительность СКВ, Ме [25-75%], годы 10,0 [3,8-20,0] 10,9 [3,4-20,2]
Пол: жен./муж., абс. (%) 49/21 48/21
Тромбоз в анамнезе, Венозный 21 (30) 20 (29)
абс. (%) Артериальный 17 (24) 17 (25)
Сочетанный 16 (23) 16 (23)
Акушерская патология*, абс. (%) 26/20 (77) 25/20 (80)
Преднизолон, абс. (%) 38 (54) 38 (55)
Антикоагулянты, абс. (%) НМГ 12 (17) 12 (17)
Варфарин 15 (21) 15 (22)
ПОАК 25 (36) 24 (35)
Без а/к терапии 18 (26) 18 (26)
Низкие дозы ацетилсалициловой кислоты, абс. (%) 25 (36) 25 (36)
Гидроксихлорохин, абс. (%) 55(79) 54 (78)
Примечание. SD - стандартное отклонение, Ме - медиана и в квадратных скобках дан интерквартильный 25%-75% разброс, НМГ -низкомолекулярные гепарины, ПОАК - пероральные антикоагулянты. * - акушерская патология рассчитана из числа женщин, имевших беременность на фоне заболевания, процент указан из числа женщин, имевших беременность на фоне заболевания. В числителе - число женщин, имевших беременность на фоне заболевания, в знаменателе - число женщин с акушерской патологией.
Таблица 2
Границы степеней позитивности при оценке результатов определения аКЛ и аb2ГП1 [14]
Степень позитивности аКЛ аЬ2ГП1
IgG-аКЛ (GPL) IgM-аКЛ (MPL) ^-аЬ2ГП1, Ед/мл ^М-аЬ2ГП1, Ед/мл
Высокопозитивные > 65,0 > 45,0 > 60,0 > 60,0
Среднепозитивные 35,0-65,0 35,0-45,0 30,0-60,0 30,0-60,0
Низкопозитивные 25,0-35,0 24,7-35,0 15,3-30,0 17,0-30,0
Негативные < 25,0 < 24,7 < 15,3 < 17,0
Примечание. аКЛ - антитела к кардиолипину, а02ГП1 - антитела к р2-гликопротеину 1.
Статистический анализ результатов исследований проводился с использованием программ Statistica и Epi Info. Применялись методы описательной статистики и непараметрические методы. Статистическая значимость показателей была определена с вероятностью ложнопо-ложительных результатов р < 0,05. При описании центральных моментов количественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение, использовались среднее значение (М) и среднеквадратичное отклонение (SD), при описании признаков, не имеющих нормального распределения, применялись медиана (Ме) и интерквартильный размах [между 25-й и 75-й процен-тилями]. При сравнении по количественному признаку двух независимых групп использовались критерии Ман-на-Уитни. Качественные показатели в 2-х несвязанных группах сравнивались в таблице сопряженности 2х2 с помощью теста %2. При количестве наблюдений менее 5 достоверность (Р) оценивалась в программе Statistica и указывалась с поправкой по Йетесу. При количестве наблюдений более 5, статистическая обработка данных производилась в программе Epi Info, у2 оценивался при достоверном р, указывалось отношение шансов с 95% доверительным интервалом.
Результаты. У 50 (71%) из 70 пациентов выявлялись позитивные IgG-аКЛ при исследовании методом имму-ноферментного анализа и у 61 (87%) - методом хеми-люминесцентного анализа (табл. 3). Преобладало число пациентов с высоко-позитивными уровнями IgG-аКЛ по
результатам иммуноферментного анализа, медиана этих антител по данным хемилюминесцентного анализа составила 704,8 [461,9-2024,0]. Уровни антител при исследовании хемилюминесцентным методом были разделены на высокопозитивные, среднепозитивные и низкопозитивные в соответствии их степени позитивности по данным иммуноферментного анализа. Высокопозитивные уровни в хемилюминесцентном анализе, соответствовавшие высокопозитивным значениям в иммуноферментном, были достоверно выше по сравнению со значениями средних уровней по данным хемилюминесцентного анализа (р = 0,009). Среднепозитивные и низкопозитивные уровни IgG-аКЛ хемилюминесцентным анализом между собой не различались. У 15 пациентов отмечалось расхождение в уровнях IgG-аКЛ по данным обоих методов определения: 13 из них с отрицательными уровнями IgG-аКЛ по результатам иммуноферментного анализа имели позитивные значения по данным хемилюминесцентного анализа, и их медиана составила 100,2 RLU [38,1-183,4]. По градации фирмы-изготовителя они соответствовали позитивности (>20 КЬЦ) по этим антителам, однако по градации по уровням позитивности в соответствии со значениями в иммуноферментном анализе у 5 пациентов из этих 13 выявлялись уровни IgG-аКЛ выше 108,0 ЯЬи, что соответствовало низко-позитивным уровням по данным им-муноферментного анализа. Медиана низкопозитивных уровней IgG-аКЛ методом хемилюминесцентного анализа составила 294,5 [108,7-480,4]. Восемь из 13 пациентов с
отрицательными уровнями IgG-аКЛ по результатам иммуноферментного анализа при исследовании хемилюминесцентным анализом имели уровни этих антител менее 108,0 RLU. Два пациента в иммуноферментном анализе имели высокопозитивные уровни IgG-аКЛ (>120 GPL), которые были отрицательными в хемилюминесцентном методе.
Позитивные уровни IgM-аКЛ были зарегистрированы у 19 (27%) из 70 пациентов иммуноферментным анализом и у 22 (31%) - хемилюминесцентным. Значения IgM-аКЛ в хемилюминесцентном анализе, в соответствии с уровнями позитивности по данным иммуноферментного метода, между собой не различались, несмотря на высокопозитивные значения IgM-аКЛ в хемилюминесцентном анализе - 190,1 [20,3-248,1] RLU (табл. 3). Как видно из табл. 3, медиана низкопозитивных значений в хемилюминесцентном анализе была 24,5 [22,426,7] RLU, чуть выше позитивных значений по данным фирмы-изготовителя. У 13 пациентов отмечалось расхождение в уровнях IgM-аКЛ по данных обоих методов исследования. У 8 пациентов, IgM-аКЛ отрицательных по результатам иммуноферментного анализа, отмечались позитивные уровни в хемилюминесцентном анализе. У двух из них уровни IgM-аКЛ были > 50 RLU, у оставшихся 6 они колебались в пределах 22,0 - 33,2 RLU. У 3 из 5 пациентов с отрицательными IgM-аКЛ в хемилюминесцентном анализе эти показатели в иммуноферментном анализе были выше 100,0 MPL и соответствовали высоко-позитивным уровням. У оставшихся двух - уровни IgM-аКЛ в иммуноферментном анализе составили 49,8 и 30,6 MPL соответственно.
IgG^ß2rn1 были выявлены у 56 (80%) из 69 пациентов в иммуноферментном анализе и у 64 (93%) - в хемилюминесцентном анализе (см. табл. 3). Высокопозитивные уровни IgG^ß2rn1 были у 38 (68%) из 56 позитивных пациентов по результатам иммунофермент-ного анализа. Медиана высокопозитивных, средне-позитивных и низкопозитивных значений IgG^ß2rn1 хемилюминесцентным анализом была 190,1 [20,3-248,1] и 43,5 [4,5-82,5], 24,5 [22,4-26,7], соответственно. Медиана высоко-позитивных уровней IgG^ß2rn1 в хемилю-минесцентном анализе у этих пациентов была достоверно выше по сравнению с низкопозитивными уровнями (р = 0,001), а среднепозитивные уровни были выше по сравнению с низкопозитивными уровнями (р = 0,005). Высокопозитивные и среднепозитивные значения IgG-аß2ГП1 между собой в хемилюминесцентном анализе были сопоставимы. У 11 пациентов отмечалось расхождение в уровнях IgG^ß2rn1 при исследовании обоими методами определения. У 10 пациентов IgG^ß2rn1 отрицательных в иммуноферментном анализе регистрировались позитивные уровни в хемилюминесцентном анализе согласно значениям фирмы-изготовителя, но уровень IgG^ß2rn1 только у одного (830,1 RLU) из них превышал 420,4 RLU (значение, соответствующее низкопозитивному уровню в иммуноферментном анализе). У 7 из этих 10 пациентов значения IgG^ß2rn1 колебались в пределах 27,7 - 189,8 RLU (значения соответствовали отрицательным уровням в иммуноферментном анализе) и у оставшихся двоих - они составили 211,8 и 356 RLU, которые так же были отрицательными в иммуноферментном анализе. У 1 пациента с негативными уровнями IgG^ß2rn1 в хемилюминесцентном методе они в иммуноферментном были 100 Ед/мл, что соответствовало высокопозитивному уровню по результатам иммуноферментного анализа.
ИММУНОЛОГИЯ
Позитивные уровни IgM^ß2rn1 были зарегистрированы у 18 (26%) пациентов и у 17 (25%) из 69 пациентов при определении иммуноферментным и хемилюминесцент-ным анализами соответственно. Высокопозитивные уровни в иммуноферментном анализе были выявлены у 9 (50%) из 18 больных, их медиана в хемилюминесцентном анализе была достоверно выше по сравнению с медианой низкопозитивных уровней (р=0,003) и по сравнению с медианой средне-позитивных уровней (р=0,02) (табл. 3). Средне-позитивные и низкопозитивные уровни IgM^2Fn1 по данным хемилюминесцентного анализа между собой не различались. У 9 пациентов отмечалось расхождение в уровнях IgM^2Fn1 по результатам обоих методов определения. У 4 пациентов, IgM^2rn1 отрицательных в им-муноферментном анализе, отмечались позитивные уровни в хемилюминесцентном анализе и колебались от 31,1 RLU до 61 RLU. У 5 пациентов с отрицательными значениями IgM^2Fn1 хемилюминесцентным анализом, значения этих антител в иммуноферментном анализе были позитивными и колебались от 18,2 до 54,9 Ед/мл. Отрицательные уровни IgM^2Fn1 в хемилюминесцентном анализе у 2 из этих 5 пациентов соответствовали среднепозитивным значениям в иммуноферментном анализе.
Обсуждение. В настоящее время определено более 30 различных аФЛ, некоторые из которых непосредственно связываются с отрицательно заряженными фосфолипи-дами (например, фосфатидилинозитол, фосфатидилсе-рин), а другие реагируют с фосфолипидсвязывающими белками (например, отдельные домены ß2rn1, протромбина, аннексина-V) [15, 16]. Исторически иммунофер-ментный анализ был ведущим методом определения аФЛ к ß2-гликопротеину 1 (ß2GPI) и его комплексу с кардио-липином (КЛ) из-за специфических иммунохимических свойств полистироловой поверхности в качестве твердой фазы для адсорбции основных аутоантигенов [17]. Альтернативой иммуноферментного анализа является автоматизированный хемилюминесцентный метод с рядом преимуществ: высокий уровень автоматизации, что потенциально может привести к улучшению воспроизводимости и снижению межлабораторных вариаций [11, 18, 19]. Системы хемилюминесцентного анализа сокращают время ручного труда по сравнению с трудоемкими системами иммуноферментного анализа. Тестирование хемилюминесцентным анализом основано на двухфазном методе иммуноанализа: вначале специфические антитела, присутствующие в образце, связываются с твердой фазой, содержащей магнитные частицы, покрытые антигеном, а затем, после добавления реагентов, запускающих реакцию хемилюминесценции, излучаемый свет детектируется оптической системой. Результаты обычно представляются в RLU, которые прямо пропорциональны концентрации аФЛ в образце [11, 20, 21]. По данным литературы хемилюминесцентный анализ имеет более низкую чувствительность в целом, по сравнению с иммуноферментным, но более специфичен, чем им-муноферментный анализ для идентификации пациентов с АФС [8]. Это связано с тем, что системы хемилюми-несцентного анализа отличаются от систем иммунофер-ментного анализа наличием антигенных и фосфолипид-протеиновых комплексов на магнитных частицах, а не на поверхности микротитровальных углублений. Важным является связывание ß2GPI с твердой фазой, поскольку это связывание влияет как на плотность антигена, так и на ориентацию и конформацию белка. Системы покрытий, используемые методом хемилюминесцентно-
IMMUNOLOGY
Таблица 3
Частота положительных значений IgG/IgM-аКЛ, IgG/IgM-ap2rni в иммуноферментном и хемилюминесцентном анализах
Показатель ИФА ХМА Х2; р
Число позитивных пациентов, n (%) Уровни позитивности в GPL/MPL Me [25-75%] Число позитивных пациентов, n (%) Уровни позитивности в RLU Me [25-75%]
IgG-аКЛ, n = 70 50(71) 109,0 [67,1-120,0] 61(87) 480,4 [205,0-1810,8] 5,2; 0,02
Низкопозитивные 2 (4) 30,2 [28,9-31,5] 294,5 [108,7-480,4]
Среднепозитивные 10 (20) 48,5 [43,6-50,7] 316,9 [205,0-386,5]
Высокопозитивные 38 (76) 120,0 [90,1-120,0] 704,8 [461,9-2024,0]*
IgM-аКЛ, n = 70 19 (27) 66,8 [49,7-80,0] 22 (31) 67,6 [30,1-236,0] НД; 0,6
Низкопозитивные 2 (10,5) 25,7 [24,9-26,5] 24,5 [22,4-26,7]
Среднепозитивные 2 (10,5) 36,0 [30,6-41,5] 43,5 [4,5-82,5]
Высокопозитивные 15 (79) 80,0 [50,1-82,4] 190,1 [20,3-248,1]
^-аР2ГП1, n = 69 56 (80) 100,0 [52,3-100,0] 64 (93) 1733,1 [529,3-6100,0] 4,0; 0,04
Низкопозитивные 6 (11) 24,0 [21,1-27,9] 529,3 [420,4-705,9]
Среднепозитивные 12 (21) 45,0 [40,8-52,3] 1726,2 [1214,4-2093,5]***
Высокопозитивные 38 (68) 100,0 [100,0-100,0] 3117,6 [1043,4-6100,0]**
^М-аР2ГП1, n = 69 18 (26) 58,5 [27,2-98,8] 17 (25) 144,5 [64,1-194,3] НД; 0,8
Низкопозитивные 5 (28) 26,0 [25,0-26,8] 15,5 [10,2-64,1]
Среднепозитивные 4 (22) 46,0 [39,0-52,9] 42,6 [4,7-117,8]
Высокопозитивные 9 (50) 98,8 [88,3-100,0] 194,3 [152,3-258,2]****
IgG+IgM-аКЛ 13 (19) 20 (29) НД; 0,2
IgG+IgM^rm 17 (24) 15 (21) НД; 0,7
Примечание. ИФА - иммуноферментный анализ, ХМА - хемилюминисцентный анализ, аКЛ - антитела к кардиолипину, а02ГП1 -антитела к р2-гликопротеину 1, Ме - медиана, [25%-75%] - интерквартильный размах, р - сравнение частоты встречаемости по таблице сопряжённости; НД - не достоверно; *р = 0,009 по сравнению со среднепозитивными уровнями в ХМА; **р = 0,008 по сравнению с низкопозитивными уровнями в ХМА; ***р = 0,005 по сравнению с низко-позитивными уровнями в ХМА; **** р = 0,003 по сравнению с низкопозитивными уровнями в ХМА и р=0,03 по сравнению со среднепозитивными уровнями в ХМА.
го анализа, обеспечивают принципиальную разницу по сравнению с иммуноферментным анализом, и вместе с реакцией амплификации по хемилюминесцентному принципу объясняют значительно более высокие уровни аФЛ (особенно аКЛ), которые выявляются с помощью автоматизированных систем. Таким образом, в диагностике АФС хемилюминесцентные анализаторы демонстрируют чувствительность, достигающую 100% при специфичности составляющей 72,3% [22]. По данным K. Oku и соавт., исследование аФЛ хемилюминесцентным анализом является более полным (так как этим методом помимо стандартных аФЛ исследуются такие антитела как: IgA-аКЛ, ^Ы-аР2ГП1, антитела к домену I Р2ГП1), быстрым и менее трудоемким процессом [23]. Проанализировав чувствительность и специфичность IgG/IgM-аКЛ и ^Ы-аР2ГП1, авторы пришли к выводу, что эти характеристики схожи в обоих методах исследования. По данным исследования А. Capozzi и соавт. [24], проведенного на 314 пациентах, было выявлено, что определение аКЛ хемилюминесцентным и иммуноферментным анализами не отличалось. Напротив, у 30,13% пациентов с отрицательным ВА, отрицательными аР2ГП1 и положительными аКЛ по данным иммуноферментного анализа, значения аР2ГП1 были положительные в хемилюминесцентном анализе. По результатам нашей работы, позитивные значения IgG/IgM-аКЛ и IgG/IgM-аP2ГП1 антител (см. табл. 2) выше в хемилюминесцентном методе, по сравнению с уровнями антител в иммуноферментном анализе. Однако, по литературным данным, не проводилось сопоставление уровней позитивности антител по данным обоих методов исследования. В нашей работе при проведении оценки уровней позитивности (низко-, средне- и высокопозитивные) в иммуноферментном анализе и при сопоставлении их с уровнями в хеми-
люминесцентном анализе было выявлено, что данные фирмы-производителя, а именно позитивные значения (>20 RLU), не соответствуют уровням позитивности антител, определяемых иммуноферментным анализом. Медиана низко-позитивных значений IgG-аКЛ при оценке хемилюминесцентным анализом составила 294,5 ЯЬи с разбросом от 108,7 до 480,4 RLU, что соответствовало отрицательным значениям по градации на уровни позитивности в иммуноферментном методе. При анализе 13 пациентов с IgG-аКЛ в хемилюминесцентном анализе (по уровню фирмы-изготовителя> 20 КЬЦ), которые были негативными в иммуноферментном анализе, у 8 пациентов значения IgG-аКЛ были ниже нижней границы (< 108,7 КЬЦ) в соответствии с градацией позитивности в иммуноферментного анализа. И только у 5 из 13 пациентов уровни IgG-аКЛ были выше 108,7 RLU.
Кроме несоответствия уровней позитивности в обоих методах исследования выявлено большое количество расхождений при сопоставлении хемилюминесцентного с иммуноферментным анализом по позитивным значениям. Так, у 2 IgG-аКЛ отрицательных пациентов в хемилю-минесцентном анализе их уровни в иммуноферментном анализе соответствовал высоко-позитивным уровням. У 3 из 5 пациентов с ^М-аКЛ отрицательными в хемилюми-несцентном анализе в иммуноферментном анализе их уровень был высоко-позитивным (более 100,0 МРЦ), у двух из этих 5 пациентов - средне-позитивным. У одного пациента отрицательного по IgG-аP2ГП1 в хемилюминесцентном анализе в иммуноферментном анализе уровень составил 100 Ед/мл, что соответствовало высоко-позитивным значениям. У 2 из 5 пациентов с отрицательным значением ^М-аР2ГП1в хемилюминесцентном анализе эти антитела в иммуноферментном анализе отмечались в средне-позитивных уровнях, у 3 из 5 - в низко-позитивных.
На результаты значений аКЛ и aß2rni при исследовании иммуноферментным анализом могут влиять множество факторов: свойства стандартных и контрольных сывороток (специфичность, авидность, стабильность), технология иммуноферментного анализа, аналитические характеристики используемых тест-систем, способ построения калибровочной кривой для количественной оценки полученных данных, наличие интеркуррентной инфекции и др. [14].
Наша работа является предварительной и приведены описательные методы статистики, без анализа отрицательной и положительной предсказательной ценности, а также ROC-кривых.
Заключение. Таким образом, наши предварительные результаты по сопоставимости двух методов исследования аФЛ (аКЛ и аß2ГП1) показали, что при оценке позитивности по данным фирмы-производителя (> 20 RLU) определение IgG-аКЛ и IgG^2Fn1 методом хемилюми-несцентного анализа информативнее, чем иммунофер-ментным анализом (р < 0,05), что согласуется с литературными данными [11, 12, 21, 22-24]. Но при учете уровней позитивности по данным иммуноферментного анализа, уровень положительных значений по результатам хеми-люминесцентного анализа был гораздо выше показателей фирмы-производителя, что указывает на необходимость дальнейшего исследования и наборе контроля для вычисления уровней позитивности IgG/IgM-аКЛ и IgG/IgM-аß2ГПl методом хемилюминесцентного анализа.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование выполнено в рамках темы ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой «Разработка методов персонифицированной терапии ревматических заболеваний с коморбидной патологией» (АААА-А19-119021190151-3, 0514-2019-0020).
ЛИТЕРАТУРА (пп . 2-13, 15, 16, 18, 20-24 см. REFERENCES)
1. Решетняк Т.М. Антифосфолипидный синдром: диагностика и клинические проявления (лекция). Научно-практическая ревматология. 2014;52(1):56—71. 3. Насонов Е.Л. Антифосфолипидный синдром. Монография. Москва: Литтера; 2004.
14. Александрова Е.Н., Новиков А.А., Решетняк Т.М., Клюквина Н.Г., Решетняк Д.В., Насонов Е.Л. и соавт. Антитела к ß2-гликопротеину 1 и антитела к кардиолипину при антифосфолипидном синдроме: анализ чувствительности и специфичности. Клиническая медицина. 2003;9: 25-31.
17. Волкова М.В., Кундер Е.В., Генералов И.И., Роггенбук Д. Антифосфо-липидные антитела: современные представления о патогенетическом действии и лабораторной диагностике. ВестникВГМУ. 2015;3: 6-15. 19. Ткаченко О.Ю., Лапин С.В., Лазарева Н.М., Шмонин А.А., Соловьева Л.Н., Бондарева Е.А. и соавт. Сравнительный анализ информативности тест-систем разных производителей для определения антифосфолипидных антител для диагностики антифосфолипидно-го синдрома. Клиническая лабораторная диагностика. 2017;62(1): 40-4.
REFERENCES
1. Reshetnyak T.M. Antiphospholipid syndrome: diagnosis and clinical manifestation (a lecture). Nauchno-prakticheskaya revmatologiya. 2014;52(1): 56-71. (in Russian)
2. Miyakis S., Lockshin M.D., Atsumi T., Branch D.W., Brey R.L., Cervera R. et al. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J. Thromb. Haemost. 2006;4(2):295-306.
3. Nasonov E.L. Antiphospholipid syndrome [Antifosfolipidnyi sindrom. Monografiya]. Moscow: Littera; 2004. (in Russian)
4. Devreese K.M. Standardization of antiphospholipid antibody assays. Where do we stand? Lupus. 2012;21:718-21.
ИММУНОЛОГИЯ
5. Ruffatti A., Olivieri S., Tonello M., Bortolati M., Bison E., Salvan E. et al: Influence of different IgG anticardiolipin antibody cut-off values on antiphospholipid syndrome classification. J Thromb. Haemost. 2008;6:1693-6.
6. Forastiero R., Papalardo E., Watkins M., Nguyen H., Quirbach C., Jaskal K. et al. Evaluation of different immunoassays for the detection of antiphospholipid antibodies: Report of a wet workshop during the 13th International Congress on Antiphospholipid Antibodies. Clin. Chim. Acta. 2014;428: 99-105.
7. Reber G., Boehlen F., de Moerloose P. Technical aspects in laboratory testing for antiphospholipid antibodies: is standardization an impossible dream? Semin. Thromb. Hemost. 2008;34(4): 340—6.
8. De Moerloose P., Reber G., Musial J., Arnout J. Analytical and clinical performance of a new, automated assay panel for the diagnosis of an-tiphospholipid syndrome. J. Thromb. Haemost. 2010;8(7):1540-6.
9. Chung Y., Kim J.E., Lim H.S., Kim H.K. Clinical performance of anticar-diolipin and antibeta2 glycoprotein I antibodies using a new automated chemiluminescent assay: Superior thrombotic prediction of combined results measured by two different methods. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2014;25:10-5.
10. Meneghel L., Ruffatti A., Gavasso S., Tonello M., Mattia E., Spiezia L. et al: The clinical performance of a chemiluminescent immunoassay in detecting anticardiolipin and anti-beta2 glycoprotein I antibodies. A comparison with a homemade ELISA method. Clin. Chem. Lab. Med. 2015;53:1083-9.
11. Van Hoecke F., Persijn L., Decavele A-S., Devreese K. Performance of two new, automated chemiluminescence assay panels for anticardiolipin and anti-p2-glycoprotein I antibodies in the laboratory diagnosis of the antiphospholipid syndrome. Int. J. Lab. Hematol. 2012;34(6): 630-40.
12. Zhang S., Wu Z., Li P., Bai Y., Zhang F., Li Y. Evaluation of the clinical performance of a novel chemiluminescent immunoassay for detection of anticardiolipin and antibeta2-Glycoprotein 1 antibodies in the diagnosis of antiphospholipid syndrome. Medicine. 2015;94:e2059.
13. Hochberg M.C. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 1997;40(9):1725.
14. Alexandrova E.N., Novikov A.A., Reshetnyak T.M., Klukvina N.G., Reshetnyak D.V., Nasonov E.L. et al. Antibodies to p2-glycoprotein 1 and antibodies to cardiolipin in antiphospholipid syndrome: sensitivity and specificity analysis. Klinicheskaya meditsina. 2003;9: 25-31. (in Russian)
15. Volkov I., Seguro L., Leon E.P., Kovacs L., Roggenbuck D., Schierack P. et al. Profiles of criteria and non-criteria anti-phospholipid autoanti-bodies are associated with clinical phenotypes of the antiphospholipid syndrome. Autoimmun. Highlights. 15;11(1): 8.
16. Mekinian A., Bourrienne M.C., Carbillon L., Benbara A., Noemie A., Chollet-Martin S. et al. Non-conventional antiphospholipid antibodies in patients with clinical obstetrical APS: prevalence and treatment efcacy in pregnancies. Semin. Arthritis Rheum. 2016;46(2): 232-7.
17. Volkova M.V., Kunder E.V., Generalov A.I., Roggenbuk D. Antiphos-pholipid antibodies: modern ideas about pathogenetic action and laboratory diagnosis. Vestnik VGMU. 2015;3:6-15. (in Russian)
18. Devreese K., Hoylaerts M.F. Laboratory diagnosis of the antiphospho-lipid syndrome: a plethora of obstacles to overcome. Eur. J. Haematol. 2009;83(1):1-16.
19. Tkachenko O.Y., Lapin S.V., Lazareva N.M., Shmonin A.A., Solovieva L.N., Bondareva E.A. et al. Comparative analysis of the informativeness of test systems from different manufacturers to determine antiphospholipid antibodies for diagnosis of antiphospholipid syndrome. Klinicheskaya laboratorna-ya diagnostika. 2017;62(1):40-4. (in Russian)
20. Sciascia S., Amigo M-C., Roccatello D., Khamashta M. Diagnosing antiphospholipid syndrome: 'extra-criteria' manifestations and technical advances. Nat. Rev. Rheumatol. 2017;13(9): 548-60.
21. Persijn, L., Decavele A-S., Schouwers S., Devreese K. Evaluation of a new set of automated chemiluminescense assays for anticardiolipin and anti-beta2-glycoprotein I antibodies in the laboratory diagnosis of the an-tiphospholipid syndrome. Thromb. Res. 2011;128(6): 565-9.
22. Noubouossie D., Valsamis J., Corazza F., Rozen L., Debaugnies F., De-mulder A. An automated chemiluminescence immunoassay may detect mostly relevant IgG anticardiolipin antibodies according to revised Sydney criteria. Acta Clin. Belg. 2012;67(3):184-9.
23. Oku K., Amengual O., Kato M., Bohgaki T., Horita T., Yasuda S. et al. Significance of fully automated tests for the diagnosis of antiphospho-lipid syndrome. Thrombosis Research. 2016;146:1-6.
24. Capozzi A., Lococo E., Grasso M., Longo A., Garofalo T., Misasi R. et al. Detection of antiphospholipid antibodies by automated chemilumines-cence assay. J. Immunol. Methods. 2012;379(1-2): 48-52.
Поступила 05.05.21 Принята к печати 21.05.21
