CC BY
12
УДК 577. 112. 855
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ рРНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ ДЛЯ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО ВВЕДЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МЕТКИ
О.В. Сергеева, Д.Е. Бураковский, П.В. Сергиев, Т.С. Зацепин, М. Томкувиене*, С. Климасаускас*, О.А. Донцова
(кафедра химии природных соединений; e-mail: olga.sergeeva.v@gmail.com)
Исследована возможность использования аналога S-аденозилметионина - пент-2-ен-4-инилS-аденозилгомоцистеина (AdoEnYn) в качестве кофактора для рРНК метилтрансферазы. Проведен подбор условий для реакции циклоприсоединения азида флуоресцентной метки к аналогу S-аденозилметионина. В различных условиях протестирована функциональная активность рибосом E. coli. Обнаружено, что встраивание алкинильного радикала проходит успешно и не влияет на функциональную активность рибосом, но в условиях последующей реакции циклоприсоединения происходит инактивация рибосом.
Ключевые слова: рибосома E. coli, метилтрансфераза, флуоресцентное мечение, реакция циклоприсоединения.
В настоящее время технологии включения флуоресцентных меток в биологические объекты повсеместно замещают технологии использования радиоактивных изотопов. Причем наиболее распространены способы, не нарушающие структуру и функциональную активность биомолекул. Известны несколько флуоресцентных групп, которые можно вводить в биомолекулы для изучения их роли в клеточных процессах [1]. Например, широко применяются флуоресцентные белки, имеющие разное происхождение и различные спектральные характеристики. Флуоресцентные белки имеют достаточно крупные молекулы по сравнению с низкомолекулярными флуорофорами и могут менять структуру биологических макромолекул при присоединении. Кроме того, невозможно введение флуоресцентных белков в РНК. Перспективным инструментом, который можно использовать для введения флуорофоров в биомолекулы, могут служить клеточные ферменты-трансферазы. Например, РНК метилтрансферазы используют S-аденозил^ метио-нин (SAM) в качестве донора метильной группы для процесса метилирования РНК. Причем рРНК метилтрансферазы обладают уникальным свойством - они способны узнавать и модифицировать один нуклео-тид из 4500 нуклеотидных остатков рибосомы. Известно, что некоторые метилтрансферазы способны связывать и использовать в качестве кофактора аналоги SAM, содержащие ненасыщенные связи, сопряженные с атомом углерода, соседствующим с атомом
серы и эквивалентным метильной группе SAM [2]. В результате появляется возможность ферментатив-но вводить в субстраты метилтрансфераз различные органические радикалы. Особенно перспективным является введение функциональных групп, не встречающихся в живых клетках и способных в дальнейшем селективно присоединять флуорофорные группы. Исходя из этого мы предположили, что рРНК метилтрансферазы могут использовать модифицированный аналог SAM, что можно применить для флуоресцентного мечения рибосом. Этот аналог содержит не встречающийся в биологических макромолекулах алкин, способный вступать в специфические реакции циклоприсоединения.
Одним из способов введения флуорофора в макромолекулу, модифицированную алкином, стала реакция 3+2-циклоприсоединения с участием азидо-группы. Она привлекательна тем, что является специфичной, быстрой и использует слабополяризованные реагенты [3]. Реакция 1,3-циклоприсоединения (реакция Хьюсгена) лучше всего подходит для биологических объектов, куда легко вводится азидная или алкильная группа, а их функциональные свойства при этом не изменяются. Основным катализатором этой реакции является одновалентная медь, образующаяся при восстановлении Cu(II). При этом возможно образование радикал-ионов, которые могут повредить биомолекулы, да и сама по себе одновалентная медь в определенных концентрациях токсична для клеток
*Институт Биотехнологии, Вильнюсский университет, Литва.
[4]. Для решения этой проблемы были предложены различные способы стабилизации Cu(I) в водных растворах: подбор концентраций реагентов, добавление ацетонитрила и подбор лигандов к Cu(I) [1, 4]. Использование рРНК метилтрансфераз как агентов для введения алкинильной группы в рРНК, объединенное с реакцией Хьюсгена (присоединением азид-ного производного флуоресцентной метки), могло бы стать отличным способом для флуоресцентного мечения рибосом и рРНК.
В рамках данной работы алкинильная группа входила в состав пент-2-ен-4-инилS-аденозингомоцис-теина (AdoEnYn) (рис. 1) - кофермента для реакции метилирования рРНК при помощи метилтрансферазы RsmD [2, 5]. Субстратом для фермента служит собранная 30S-субчастица рибосомы. Следующей стадией является реакция циклоприсоединения азидогруп-пы флуоресцентной метки к алкину в составе 30S-субчастицы. Основная задача состоит в том, чтобы не только ввести флуоресцентную метку в рРНК, но и сохранить функциональную активность рибосомы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Выделение 30S-cy64aci^ рибосомы ARsmD
Субчастицы 30S ARsmD выделены из штамма E. coli, где ген yhhF был заменен на ген устойчивости к антибиотику канамицину [6]. Клетки выращивали в среде LB в присутствии канамицина (50 мкг/мл) до установления оптической плотности 0,6. После разрушения клеток путем механического перетирания с окисью алюминия в буфере (20 мМ Трис; 100 мМ хлорид аммония; 10,5 мМ ацетат магния; 3 мМ ß-меркаптоэтанол) и после осаждения дебри-са рибосомы их осаждали ультрацентрифугированием через 40%-ю сахарозную подушку (28000 rpm) в течение 13 ч. Рибосомы были получены зональным ультрацентрифугированием в градиенте концентрации сахарозы 10-40% при 28000 rpm (19 ч), после чего были дополнительно очищены ультрацентрифугированием через 40%-ю сахарозную подушку (28000 rpm) в течение 13 ч. Отдельные субчастицы были вы-
Рис. 1. Пент-2-ен-4-инилS-аденозингомоцистеин (AdoEnYn)
делены с помощью зонального ультрацентрифугирования в диссоциирующем буфере (20 мМ Трис; 60 мМ хлорид аммония; 1,25 мМ ацетат магния;
3 мМ Р-меркаптоэтанол). Фракции, содержащие 30S-субчастицы рибосомы собрали, а затем осадили субчастицы ультрацентрифугированием при 50000 rpm в течении 24 ч. Для проверки функциональной активности рибосом измеряли связывание fMet-тРНК в присутствии факторов инициации.
Выделение метилтрансферазы RsmD
Рекомбинантная метилтрансфераза RsmD была выделена из клеток E. coli (штамм М15), содержащих плазмиду pCA24N-RsmD. В этой плазмиде ген rsmD находится под контролем Т51ас-промотера, индуцируемого изопропил-Р-тиогалактопиранозидом (IPTG) [7]. Клетки растили в среде LB при температуре 37°C до установления оптической плотности 0,6, затем добавляли индуктор IPTG (0,5 мМ) и растили еще 2 ч. Затем клетки разрушали с помощью ультразвука в буфере (20 мМ Хепес (pH 7,5); 200 мМ ацетат аммония; 10 мМ имидазол; 0,1% тритон, 1 мг/мл лизоцим). Белок очищали методом афинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. После трех промывок градиентом 10-80 мМ имидазола белок элюировали буфером, содержащим имидазол (500 мМ). Для очистки от совыделяющегося SAM проводили серию диализов в течение 4 ч в буфере (20 мМ Хепес (pH 7,5); 200 мМ ацетат аммония; 1 мМ ацетат магния; 0,1%-й тритон, 5 мМ Р-меркаптоэтанол; 10%-й глицерин); в таком же буфере, но в присутствии 200 мкМ S-аденозилгомоцистеина; в буфере с 20 мМ Хепес (pH 7,5); 200 мМ ацетат аммония; 1 мМ ацетат магния; 0,1% тритон; 5 мМ Р-меркаптоэтанол; 10%-й глицерин. Чистоту белка проверяли на SDS-ПААГ.
Алкинилирование in vitro
Алкинилирование in vitro проводили в буфере, содержащем 50 мМ Хепес (pH 7,6); 70 мМ хлорид аммония; 30 мМ хлорид калия; 7 мМ ацетат магния;
4 мкМ AdoEnYn. Концентрация 30S-субчастиц, не-модифицированных по нуклеотидному остатку G966, и белка составляла 0,5 и 1,0 мкМ соответственно. Смесь инкубировали 10, 30, 60, 120, 180, 240 мин при 37°С. Для определения выхода алкинилирования к реакционным смесям добавляли радиоактивный [14C] SAM, инкубировали еще 1 ч при 37°С. Из всех образцов выделяли рибосомную РНК (при помощи набора Qiagen) и по уменьшению количества встроившихся радиоактивных метильных групп, измеренному с по-
мощью сцинтилляционного счетчика, оценивали количество включенного AdoEnYn.
Реакция Хьюсгена
Реацию циклоприсоединения проводили с использованием 1 мкМ раствора алкинилированных 30S-субчастиц рибосомы в буфере, содержащем 50 мМ Хепес (pH 7,6); 70 мМ хлорид аммония, 30 мМ хлорид калия, 7 мМ ацетат магния, 5-50 мкМ сульфата меди(П), 50-250 мкМ THPTA; 0,25-2,5 мМ аскорбата натрия; 1 мМ аминогуанидина; 30 мкМ азида флуоро-фора Alexa 555 («Invitrogen») в течение 40-60 мин при комнатной температуре. Образцы очищали от избытка флуорецентной метки методом гель-фильтрации на колонках «Zeba Spin» («Thermo Fischer Scientific»). Количество встроенной метки оценивали по калибровочной кривой стандартных концентраций чистого флуорофо-ра, нм (0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10; 15; 25, 50, 100).
Инициация трансляции in vitro
Для оценки функциональной активности 30S^6-частиц рибосомы использовали метод сорбции ини-циаторных комплексов на нитроцеллюлозных фильтрах. Сначала проводили активацию 30S-субчастиц в буфере, содержащем 50 мМ Хепес (pH 7,6), 70 мМ хлорида аммония, 30 мМ хлорида калия и 100 мМ ацетата магния, при 37°С в течение 30 мин, затем разбавляли до концентрации ацетата магния 20 мМ, добавляли ДТТ* (до концентрации 0,5 мМ), ГТФ** до концентрации (0,5 мМ), 5-кратный избыток мРНК, 3-кратный избыток радиоактивной (удельная активность 8000 dpm/пмоль). Концентрация факторов инициации (IF1, IF2, IF3) была в два раза выше концентрации рибосом (0,2 мкМ). После добавляли 50S-субчастицы в количестве, эквивалентном 30S-субчастицам. Пробы фильтровали через нитро-целлюлозные фильтры и количество сорбированного комплекса оценивали с помощью сцинтилляционного счетчика по уровню радиоактивности.
Результаты и обсуждение
Метилтрансфераза RsmD способна использовать алкинильное производное SAM и переносить алки-нильный радикал на экзоциклическую аминогруппу нуклеотида G966 16S рРНК в составе 30S-субчастицы, неметилированной по этому остатку. Нуклеотид G966 16S рРНК участвует в образовании Р-участка рибосомы, связывающего пептидил-тРНК [8]. Зависимость выхода алкинильного производного 30S-субчастицы
от времени реакции измеряли с помощью радиоактивного [14C] SAM. Радиоактивный [14C] SAM добавляли в реакционную смесь через определенные промежутки времени после алкинильного производного SAM. При этом использовали в основном природный кофактор, и фермент RsmD проводил включение радиоактивных метильных групп в те 30S-субчастицы, которые остались немодифицированными, т.е. не содержали алкинильных групп. Подобраны оптимальные условия процесса: 37°С, 4 ч (рис. 2). В данных условиях включение алкинильных радикалов в 30S-субчастицы достигает 88%.
Известно, что для реакции циклоприсоединения азида флуоресцентной метки можно использовать различные условия. В основном, варьирование усло-
Рис. 2. Кинетика включения алкинильных групп в 30S-субчастицы, выделенные из штамма ARsmD и не содержащие метильных групп, присоединенных к нуклеотиду G966. Выход алкинилирования измеряли по включению радиоактивных метильных групп [14C] SAM после реакции с алкинильным аналогом
Рис. 3. Трис-(3-гидроксипропилтриазолилметил) амин (THPTA)
* Дитиотреитол; **гуанозинтрифосфат.
вий направлено на стабилизацию Си(1), которая легко окисляется до Си(П), образуя при этом опасные для рибосомы радикал-ионы. Было предложено несколько лигандов ионов меди, но наибольшее распространение для применения к клеточным системам получили ТВТА и обладающий большей растворимостью в воде ТНРТА - трис-(З-гидроксипропилтриазолилметил) амин [9] (рис. 3).
ТНРТА успешно использовали в качестве лиганда Си(1) при флуоресцентном мечении мембранных гли-канов клеток млекопитающих [1]. В связи с этим мы попробовали начать наши эксперименты с таких же концентраций реагентов для циклоприсоединения: 50 мкМ С^04, 250 мкМ ТНРТА, 1 мМ аминогуани-дина, 2,5 мМ аскорбата натрия, 25 мкМ азид флуоресцентной метки А1еха 555, 40 мкМ алкинил-30S. Рассчитанное по калибровочной кривой стандартных концентраций А1еха 555 количество флуоресцентных
групп в 25 нМ растворе 16S рРНК составило 19,4 нМ, что соответствует 77% включения метки (рис. 4). При проверке функциональной активности, оказалось, что флуоресцентно-меченые Alexa555-30S не способны связывать Ш^-тРНК в инициаторном комплексе 70S в отличие 30S wt (рис. 5). Это может происходить по нескольким причинам. Во-первых, поскольку нуклео-тид G966 16S рРНК находится в непосредственной близости к Р-участку рибосомы, то добавление объемной флуоресцентной метки может мешать связыванию тРНК. Во-вторых, компоненты реакции циклоприсоединения могут повреждать рибосомную РНК или рибосомные белки. Для решения этого вопроса был проведен тест функциональной активности рибосом на каждой стадии (рис. 6).
Из результатов теста следует, что алкинилирова-ние рРНК не влияет на функциональную активность инициаторного комплекса 70S. Причиной инакти-
Рис. 4. Калибровочная кривая стандартных концентраций А1еха 555
Рис. 5. Тест функциональной активности флуоресцентно-меченых рибосом: 1 - 70S wt, 2 - 70S Fluo
вации Alexa555-30S служит не само введение флуорофора, а повреждение рибосомных субчастиц при инкубации в условиях реакции циклоприсоединения (сравнить 2 и 3 на рис. 6). Условия, подобранные для реакции присоединения флуоресцентной метки к гли-канам не подходят для использования в экспериментах с рибосомами in vitro. Для определения соединений, которые повреждают рибосомы, были отдельно проверены все компоненты реакционной смеси. Наибольшее повреждение рибосом вызывает смесь сульфата меди и аскорбата натрия (рис. 7). Поэтому для оптимизации методики в первую очередь решили понизить концентрации CuSO4 и аскорбат натрия.
Для тестирования возможности включения флуорофора в мягких условиях концентрации сульфата меди и аскорбата были снижены в 10 раз (с 50 до 5 мкМ CuSO4 и с 2,5 до 0,25 мМ аскорбата натрия). Для тестирования целостности рибосомных субчастиц в условиях реакции был проведен анализ ВЭЖХ 30S-субчастиц после инкубации (4-43 мин) со смесью 50 мкМ CuSO4 + 250 мкМ THPTA + 2,5 мМ аскорбата натрия. Наблюдаемое перераспределение оптической плотности позволяет предположить, что происходит деградация рРНК. Пик максимума оптической плотности 30S-субчастиц расширяется и сдвигается влево (рис. 8, а). При снижении концентрации всех реагентов (CuSO4 до 5 мкМ, THPTA до 50 мкМ, аскорбата натрия до 0,25 мкМ) с течением времени (4-19 мин) в 30S-субчастицах также происходят структурные изменения, однако максимум пика совпадает с максимумом 30S ARsmD без обработки (рис. 8, б). При проведении реакции циклоприсоединения в мягких условиях Alexa 555 включилась в 30% рРНК (рис. 8, в).
При проверке функциональной активности 30S-субчастиц, 30% из которых содержали флуоресцентную метку Alexa 555, только 20% оказались способными к взаимодействию с инициаторной тРНК. Проведение реакции циклоприсоединения в инертной атмосфере, изменение концентрации лиганда меди, добавление сорастворителей DMSO и ацетонитрила, попытки использования другого лиганда (TBTA) не приводят к увеличению доли активного инициаторно-го комплекса 70S. Возможно, использование реакции Хьюсгена в случае таких макрокомплексов, как рибосома, состоящих из белков и РНК, требует других, более специфических условий реакции или внесения дополнительных компонентов.
Таким образом, оптимизация условий встраивания флуоресцентной метки в рРНК не увенчалась успехом. Условия, в которых встраивание метки было
эффективным, способствовали инактивации рибосом. В условиях, когда эффективность встраивания метки заметно снижалась, лишь немногие из рибосомных субчастиц оставались активными. По-видимому, для создания эффективного неповреждающего метода встраивания флуорофора в рРНК необходимо отказаться от использования солей меди.
Рис. 6. Проверка функциональной активности 30S-субчастиц по выходу образования инициаторного комплекса 70S. Использовали следующие варианты обработки 30S-субчастиц, лишенных модификации G966: 1 - алкинил-30S (30SAdoEnYn); 2 - А1еха555-30S; 3 - 30S, инкубированные со всеми компонентами смеси для реакции циклоприсоединения, кроме А1еха555; 4 - 30S, инкубированная с RsmD ; 5 - 30S без обработки
Рис. 7. Проверка функциональной активности инициаторного комплекса 70S ARsmD после инкубации 30SAdoEnYn c каждым или сочетаниями компонентов реакции циклоприсоединения в течение стандартного времени флуоресцентного мечения: 1 -CuSO4; 2 - THPTA; 3 - NH2-G; 4 - ask Na; 5 - Alexa 555; 6 - CuSO4 + THPTA; 7 - CuSO4+ ask Na; 8 - смесь всех компонентов; 9 - 30S без обработки
Рис. 8. ВЭЖХ-анализ целостности 30S-субчастиц: а - 30S AdoEnYn после инкубации с 50 мкМ CuSO4, 250 мкМ THPTA, 2.5 мМ аскорбатом натрия, 1 мМ аминогуанидином, 30 мкМ Alexa 555 (1 - 30S контроль, 2 -после 4 мин инкубации, 3 - после 19 мин инкубации, 4 - после 43 мин инкубации); б - 30S AdoEnYn после инкубации с 5 мкМ CuSO4, 50 мкМ THPTA, 0.25 мМ аскорбатом натрия, 1 мМ аминогуанидином, 30 мкМ Alexa 555 (1 - после 4 мин инкубации, 2 - после 15 мин инкубации, 3 - 30S контроль, 4 - после 19 мин инкубации, 4 - флуоресцентно меченые 30S); в - включение Alexa555 в 30S AdoEnYn (1 - оптическая плотность 30S,
2 - флуоресцентная активность 30S)
CnHCOK .HTEPATyPbl
1. Hong V., Steinmetz N., Finn M. // Bioconjug. Chem. 2010. 21. N 10. C. 1912.
2. Motorin Y., Burhenne J., Koynov K., Willnow S., Weinhold E., Helm A. // Nucleic Acids Res. 2011. 39. N 5. C. 1943.
3. Huisgen R. // 1,3-Dipo Cycloaddition Chemistry. Ed. A. Padwa. N.Y., 1984. C. 1.
4. Paredes E., Das S. // Chembiochem. 2011. 12. N 1. C. 125.
5. Lesnyak D., Osipiuk J., Skarina T., Sergiev P., Bogdanov A., Edwards A., Savchenko A., Joachimiak A., Dontsova O. // J. Biol. Chem. 2007. 282. N 8. C. 5880.
6. Baba T., Ara T., Hasegawa M., Takai Y., Okumura Y., Datsen-ko K.A., Tomita M., Wanner B.L., Mori H. // Mol. Syst .Biol. 2006. 2. C. 2006.
7. Datsenko K., Wanner B. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. 97. N 12. C. 6640.
8. Ahsen U., Noller H. // Identification of bases in 16S rRNA essential for tRNA binding at the 30S ribosomal P site. 1995. FScience. V. 267. N 5195. C. 234.
9. Chan T, Hilgraf R, Sharpless K., Fokin V. // Org. Lett. 2004. 6. N 17. C. 2853.
10. Baskin J., Prescher J., Laughlin S., Agard N., Chang P., Miller I., Lo A., Codelli J., Bertozzi C. // Proc. Natl. Acad Sci. USA. 2007. 104. N 43. C. 16793.
Поступила в редакцию 20.12.11
METHYLTRANSFERASE AS THE METHOD OF FLUORESCENT LABEL SITE-SPECIFIC INDUCTION
O.V. Sergeeva, D.Ye. Burakovsky, P.V. Sergiev, T.S. Zatsepin, M. Tomkuviene, S. Klimasauskas, O.A. Dontsova
(Division of Chemistry of Natural Compounds)
We investigate the possibility of usage the analog of S-adenosylmethionine - pent-2-en-4-ynyl S-adenosylhomocysteine (AdoEnYn) as a co-factor for the rRNA methyltransferase. We select the conditions for the cycloaddition rection of fluorescent label azide with the analog of SAM. The functional activity of ribosomes E.coli was tested in different conditions. It was found that incorporation of the alkynyl radical is successful and doesn't change the functional activity of the ribosomes, but next cycloaddition reaction lead to the inactivation of the ribosomes.
Key words: ribosome, E.coli, fluorescent labeling, 1,3-dipolar cycloaddition.
Сведения об авторах: Сергеева Ольга Владимировна - аспирант химического факультета МГУ (olga.sergeeva.v@gmail. com); Бураковский Дмитрий Евгеньевич - науч. сотр. Макс Планк Института биофизической химии (Германия); Сергиев Петр Владимирович - доцент кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ; Зацепин Тимофей Сергеевич - науч. сотр. кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ; Мигле Томкувиене -мл. науч. сотр. Института биотехнологии Вильнюсского университета, (Литва); Саулиус Климасаускас - профессор Института биотехнологии Вильнюсского университета (Литва); Донцова Ольга Анатольевна - профессор кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ, член корр. РАН.
