CC BY
77
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.21
Аналоги малых ядрышковых C/D-бокс-РНК человека как регуляторы альтернативного сплайсинга пре-мРНК-мишени
Г. А. Степанов1*, Д. В. Семенов1, Е. В. Кулигина1, О. А. Коваль1, И. В. Рабинов1, Ю. Я. Кит2,
В. А. Рихтер1
1Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090,
Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8
2Институт биологии клетки НАН Украины, 79005, Львов, ул. Драгоманова, 14/16 *E-mail: stepanovga@niboch.nsc.ru Поступила в редакцию 24.10.2011 г.
РЕФЕРАТ Малые ядрышковые РНК (мяоРНК) играют важную роль в биогенезе эукариотических рибосом-ных РНК (рРНК). C/D-бокс-мяоРНК направляют сайт-специфичное 2'-О-метилирование нуклеотидов рРНК и малых ядерных РНК (мяРНК). Некоторые природные C/D-бокс-РНК, а также их фрагменты участвуют в регуляции посттранскрипционной модификации и альтернативного сплайсинга пре-мРНК. В представленной работе сконструированы и синтезированы искусственные аналоги U24 C/D-бокс-мяоРНК, направленные на нуклеотиды 28S и 18S рРНК человека, пре-мРНК и зрелой мРНК белка теплового шока hsc70. Установлено, что в клетках линии MCF-7 человека, трансфицированных синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК в комплексе с липофектамином, аналоги мяоРНК проникают внутрь клеток и накапливаются в цитоплазме и ядре. Трансфекция клеток человека синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК, несущих область узнавания, комплементарную пре-мРНК белка hsc70, вызывает частичное нарушение сплайсинга мРНК-мишени. Трансфекция аналогами C/D-бокс-РНК, направленными на нуклеотиды 18S и 28S рРНК, ключевых для функционирования рибосом, приводит к снижению жизнеспособности клеток MCF-7. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА малые ядрышковые C/D-бокс-РНК, посттранскрипционная модификация РНК, альтернативный сплайсинг пре-мРНК.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ рРНК - рибосомные РНК; мяоРНК - малые ядрышковые РНК; мяРНК - малые ядерные РНК; ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией; офВЭЖХ -обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; MTT - бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия; FAM - карбоксифлуоресцеин.
ВВЕДЕНИЕ
Класс малых ядрышковых РНК (мяоРНК) представлен двумя основными семействами - C/D-бокс-РНК и H/ACA-бокс-РНК. В составе рибонуклеопротеид-ных комплексов эти РНК, выполняя функцию узнающего и направляющего элемента, участвуют в модификации нуклеотидов эукариотических рибосомных РНК. РНК, относящиеся к семейству C/D-бокс-РНК, направляют 2'-0-метилирование нуклеотидов рРНК.
C/D-бокс-РНК содержат консервативные структурные элементы - CUGA (D-бокс) и RUGAUGA (С-бокс) вблизи 5'- и З'-конца соответственно. В C/D-бокс-РНК выделяют область узнавания мишени -последовательность, комплементарную участку РНК-мишени. Некоторые РНК содержат две области узнавания и две пары C/D-боксов (C, D, C', D') [1].
В работе Cavaille J. и соавт. [2] показано, что если РНК содержит структурные элементы, определяющие ее принадлежность к семейству С^-бокс-РНК, то для определения мишени метилирования достаточно соответствующей области С^-бокс-мяоРНК, комплементарной РНК-мишени. Показана возможность направлять 2'-0-метилирование нуклеотидов РНК, не имеющих природных 2'-0-метильных групп, посредством аналогов С^-бокс-РНК [2].
Один из основных подходов к изучению свойств C/D-бокс-РНК - создание ДНК-конструкций, экспрессирующихся внутри клетки с образованием либо коротких неприродных мяоРНК, либо фрагментов пре-мРНК, из которых в результате процессинга образуются мяоРНК, направленные на заранее заданные мишени [2]. На основе этого подхода разрабо-
таны методы направленной модификации нуклеотидов в эукариотических РНК, а также картирования функционально важных сайтов рРНК, чувствительных к de novo 2'-0-метилированию [3, 4]. При этом круг мишеней искусственных малых ядрышковых РНК не ограничивается рРНК и мяРНК. Все большее внимание привлекает участие мяоРНК в процессе созревания мРНК. Уже известно, что C/D-бокс-РНК могут взаимодействовать и с продуктами транскрипции РНК-полимеразой I, локализованными в ядрышке, и с продуктами РНК-полимеразы II [2]. Кроме того, малая ядрышковая РНК HBII-52 (MBII-52) участвует в процессинге пре-мРНК серотонинового рецептора 5-HT2CR [5, 6]. Таким образом, структура малых ядрышковых C/D-бокс-РНК представляет перспективную основу для разработки средств направленной регуляции экспрессии генов в клетках человека.
В данной работе изучено влияние синтетических аналогов природных C/D-бокс-РНК на сплайсинг пре-мРНК-мишени и процессинг 18S и 28S рРНК клеток человека. Получены аналоги U24 C/D-бокс-РНК человека, направленные на пре-мРНК белка теплового шока hsc70 и рРНК человека. Показано, что трансфекция линии клеток MCF-7 - аденокарциномы молочной железы человека, синтетическими аналогами приводит к частичному нарушению сплайсинга - исключению одного из экзонов из пре-мРНК-мишени. Установлено, что трансфекция клеток MCF-7 синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК, направленными на рРНК, вызывает снижение жизнеспособности клеток.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение искусственных C/D-бокс-РНК
Синтетические аналоги C/D-бокс-РНК получали с помощью транскрипции in vitro ДНК-матриц, полученных методом ПЦР, с использованием РНК-полимеразы фага T7 («Fermentas», Литва).
Трансфекция клеток MCF-7 синтетическими РНК. Выделение суммарной клеточной РНК
Клетки MCF-7 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург) культивировали в среде IMDM с 10 мM L-глутамина и 40 мкг/мл гентамицина в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37оС. Синтетические аналоги C/D-бокс-РНК преинкубировали с липофектамином (Lipofectamine Reagent, «Invitrogen», США) согласно протоколу производителя и добавляли в культуральную среду. После инкубации клеток MCF-7 в течение 18 ч выделяли суммарную РНК с помощью Trizol Reagent
(«Invitrogen», США) согласно протоколу производителя.
Выделение цитоплазматической и ядерной фракций лизата клеток MCF-7
По завершении инкубации клетки MCF-7 охлаждали на льду. Среду отбирали, клетки промывали двумя сменами фосфатно-солевого буфера (PBS) и лизи-ровали на льду в течение 10 мин (0.5% Тритон Х-100 в буфере A, содержащем 150 мM NaCl, 50 мM Трис-НС1 рН 7.5, 10 hM EDТА). Лизат суспендировали и наслаивали на 10% раствор сахарозы в буфере А, центрифугировали в течение 20 мин при 600 д. Выделение РНК из супернатанта (цитоплазматическая фракция MCF-7) и осадка ядер, суспендированного в буфере A, проводили с помощью Trizol Reagent. Концентрацию РНК в препаратах определяли спектрофотометрически (^ = 260 нм) с учетом коэффициента экстинкции для РНК (є260 = 25 л/моль • см).
Анализ вариантов сплайсинга пре-мРНК гена HSPA8 методом ОТ-ПЦР
Обратную транскрипцию пре-мРНК HSPA8 и амплификацию кДНК проводили в реакционной смеси для ОТ-ПЦР «РеалБест Mастер микс ОТ» («Вектор-Бест», Новосибирск) с использованием праймеров hsp2.1 - 5'-ACTGAACGGTTGATCGGTGA-3' и hsp8.2 - 5'-AGATGAGCACGTTTCTTTCT-3'. Продукты анализировали в 4% полиакриламидном геле. Количество продуктов амплификации в геле оценивали с помощью программного обеспечения Gel-Pro Analyzer 3.1. Нуклеотидные последовательности определяли по методу Сэнгера с использованием флуоресцентно меченных терминаторов ДНК-полимеразы в составе смеси «BigDye 3.1» с последующим разделением ДНК на анализаторе ABI3100 «Applied Biosystems» (Mежинститутский центр секвенирования ДНК СО РАН).
Получение флуоресцентно меченной C/D-бокс-РНК и анализ накопления флуоресцентно меченной РНК в клетках человека
Флуоресцентно меченную РНК получали с помощью транскрипции in vitro РНК-полимеразой фага T7 («Fermentas», Литва) с использованием Flu-12-UTP («Биосан», Новосибирск). РНК-транскрипт выделяли с помощью ион-парной офВЭЖХ на приборе Mилихром А-02 на сорбенте ProntoSIL-120-5-C18 и колонке 2.0 х 7.5 мм. Накопление флуоресцентно меченной РНК в клетках MCF-7 анализировали с использованием флуоресцентной микроскопии (Центр коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН). С этой целью 3 х 104 клеток MCF-7 высаживали на пред-
метное стекло камеры Culture Slide («BD Falcon», США), через 24 ч трансфицировали флуоресцентно меченной РНК и инкубировали в течение 18 ч. После инкубации среду убирали, клетки дважды промывали PBS, препараты заключали в каплю красителя DAPI/Antifade («Millipore», США) и покрывали покровным стеклом. Препараты анализировали на микроскопе Axioskop 2 Plus («Carl Zeiss», Германия).
Анализ 2'-0-метилирования G1702 18S рРНК
2'-0-метильные группы рРНК выявляли при помощи частичного щелочного гидролиза как описано в работе [7]. Суммарную РНК клеток MCF-7 (2.5-5.0 мкг) инкубировали в растворе 50 мМ Na2CO3 (pH 9.0) в течение 18 мин при 90оС. Продукты гидролиза осаждали этанолом. Обратную транскрипцию проводили с использованием праймера 18.1702 -5'-GCCGATCCGAGGGCCTCACT-3', комплементарного участку 18S рРНК 1731-1750, с использованием обратной транскриптазы MMLV («Биосан», Новосибирск). Секвенирование участка рРНК методом обратной транскрипции в присутствии ddNTP проводили согласно [8].
Анализ жизнеспособности клеток MCF-7 с помощью MTT-теста
Для анализа влияния аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клетки MCF-7 культивировали в 96-луночном планшете (3 х 104 клеток на лунку). Через 24 ч к культуральной среде добавляли раствор РНК (в комплексе с липофектамином) до концентрации 3.0, 10.0 и 70.0 нМ. Клетки MCF-7 инкубировали с РНК в течение 3 сут, после чего в среду добавляли раствор MTT в PBS до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Инкубировали при 37°С в течение 90 мин, среду удаляли, кристаллы MTT-формазана растворяли в 100 мкл изопропилового спирта. Оптическую плотность раствора определяли (X, = 570 нм, контроль при X = 620 нм) на многоканальном спектрофотометре Apollo 8 LB 912 («Berthold Technologies», Германия). Данные представляли как снижение жизнеспособности (100% - (MTT-индекс)) по сравнению с контролем (клетки, инкубированные в тех же условиях с липо-фектамином без РНК).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние синтетических аналогов C/D-бокс-РНК на процессинг РНК в клетках человека изучали с использованием сконструированных нами аналогов природной U24 C/D-бокс-РНК человека. U24 РНК человека содержит последовательности CuGA и AUGAUGU (GUGAUGA) - D- и C (С')-боксы соответственно, а также две области узнавания мишеней, направляющие 2'-0-метилирование C2338
л
у
C-бокс
Tv^D'-бокс C'-бокс Области узнавания мишени
D-бокс
Праймер 1
Матрица
Праймер 2
TATA-бокс
5'
У S’
Амплификация
_____________3-
ДНК-матрица
Транскрипция с помощью РНК-полимеразы фага T7
AUGAUGU CUGA GUGAUGA CUGA
Сбокс | D'-бокс С-бокс ^ D-бокс
Область узнавания Вариабельная
мишени, направленная область узнавания
на G1702 '18Б рРНК мишени
Рис. 1. Структура Ш4 С/й-бокс-РНК (А) и схема синтеза аналогов С/й-бокс-РНК (Б).
и С2352 28S рРНК (рис. 1А) [9]. Полученные аналоги содержат консервативные участки, идентичные и24 С^-бокс-РНК, и области, комплементарные участкам РНК-мишеней, сконструированные таким образом, чтобы целевой нуклеотид в РНК-мишени был комплементарен пятому нуклеотиду от D ^')-бокса (CUGA) аналога С^-бокс-РНК [2]. Все полученные РНК содержали два набора С ^-боксов (С ^ и С'^') и соответственно две области узнавания (рис. 1Б).
Первая из областей узнавания ^-бокс-зависимая) была направлена на нуклеотиды пре-мРНК гена HSPA8, кодирующего белок теплового шока (hsc70). Подавление экспрессии белков, родственных hsp70, в том числе белка hsc70, вызывает гибель раковых клеток в культуре. При этом сам ген HSPA8 рассматривается в качестве перспективной мишени для ген-направленной терапии опухолей [10]. В качестве мишеней синтетических аналогов были выбраны нуклеотиды, модификация которых может отрицательно повлиять на процесс вырезания второго интрона при сплайсинге пре-мРНК: аденозин - точка разветвления при сплайсинге, донорный и акцепторный сайты сплайсинга, первый и последний нуклеотиды интрона. Вторая область узнавания ^'-бокс-зависимая) была направлена на G1702 18S рРНК
Б
Таблица 1. Синтетические аналоги Ш4 С^-бокс-РНК, направленные на нуклеотиды, критичные для сплайсинга пре-мРНК гена НРА8
Обозначение Нуклеотидная последовательность* Нуклеотид-мишень в пре-мРНК hsc70
РМ.7 Б'-ШСАОАиаАиеЦААААиАОСОАСОООСООШСиаАОАО АШЄиЄАиаАСАААШААААСАСиШСААисиаАШСА-3' Аденозин - точка разветвления сплайсинга
РМ.8 Б'-ШСАОАиаАиеЦААААиАОСОАСОООСООШСиаАОАО АШЄиЄАиаЛАААииАООААСиСАССААААСиаАШСА-3' Донорный сайт сплайсинга
РМ.9 Б'-ШСАОАиаАиеЦААААиАОСОАСОООСООШСиаАОАО АШЄиЄАиаЛАААииАООААСиСАССАААСиЄАШСА-3' Первый нуклеотид интрона
РМ.10 Б'-ШСАОАиаАиеЦААААиАОСОАСОООСООШСиаАОАО АШЄиЄАиаЛАСАОАШССАААСОиСШАисиаАШСА-3' Акцепторный сайт сплайсинга
РМ.11 5'-ШСАОАиЄАиЄЦААААиАОСОАСОООСООШСиЄАОАО АШЄиЄАиаАиАСАОАШССАААСОиСШАСиаАШСА-3' Последний нуклеотид интрона
*лиолиои - консервативные элементы С^-бокс-РНК; А - нуклеотиды, комплементарные нуклеотиду-мишени.
человека. Последовательности аналогов C/D-бокс-РНК представлены в табл. 1.
В результате трансфекции клеток MCF-7 синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК и анализа вариантов альтернативного сплайсинга пре-мРНК гена HSPA8 установлено, что в контрольных клетках MCF-7 детектируются два варианта альтернативного сплайсинга этой пре-мРНК - основная и минорная (рис. 2, дорожки К). Определение нуклеотидных последовательностей этих форм показало, что они отличаются наличием либо отсутствием второго экзо-на. В клетках, трансфицированных синтетическими С^-бокс-РНК, направленными на нуклеотиды, критичные для сплайсинга пре-мРНК, увеличивается содержание минорной формы, т.е. формы без второго экзона (рис. 2А, дорожки 1-5). Таким образом установлено, что аналоги С^-бокс-РНК, направленные на выбранные нуклеотиды пре-мРНК гена HSPA8, влияют на сплайсинг пре-мРНК-мишени и приводят к исключению второго экзона.
Эффективность трансфекции, распределение и стабильность синтетических аналогов C/D-бокс-РНК оценивали с помощью ОТ-ПЦР-анализа ядерной и цитоплазматической РНК клеток MCF-7, трансфицированных РМ.8 РНК. Из данных, представленных на рис. 3, видно, что через 3 ч после пассивной трансфекции клеток РНК РМ.8 без липофек-тамина РНК не удается детектировать ни в ядерной, ни в цитоплазматической фракции клеток MCF-7 (рис. 3, дорожки 1, 7). После трансфекции клеток аналогом C/D-бокс-РНК в комплексе с липофекта-мином РМ.8 РНК присутствует как в цитоплазматической, так и в ядерной фракции даже через 26 ч после трансфекции (рис. 3, дорожки 5, 11). Все это
1 2 3 4 5 К
I II III
I III
Б
Рис. 2. Влияние синтетических аналогов и24 РНК на сплайсинг пре-мРНК гена HSPA8. А — продукты ОТ-ПЦР вариантов сплайсинга пре-мРНК гена HSPA8. Дорожки соответствуют продуктам амплификации кДНК: 1-5 - клетки, трансфицированные аналогами РМ.10, РМ.7, РМ.8, РМ.9, РМ.11 соответственно; К -контрольные клетки МСР-7, инкубированные с липо-фектамином без РНК. Продукты ПЦР анализировали гель-электрофорезом в 4% ПААГ. Слева схематически представлены анализируемые варианты сплайсинга пре-мРНК-мишени. I, II, III - порядковые номера эк-зонов в структуре пре-мРНК. Б - Диаграмма соотношения выхода продуктов амплификации кДНК основной и минорной формы альтернативного сплайсинга пре-мРНК белка теплового шока hsc70. РМ.7-РМ.11 -клетки трансфицировали аналогами С^-бокс-РНК РМ.7-РМ.11 соответственно. К - Контрольные клетки МСР-7 инкубировали с липофектамином без РНК.
Время инкубации, ч 3 3 21 21 26 21 3 3 21 21 26 21
Аналог С^-РНК + + + + + - + + + + + -
Липофектамин - + - + + + - + - + + +
400----
300— 200-------
>
>
100-
->
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
— — — тт тттт
Ядерная фракция Цитоплазматическая фракция
Рис. 3. Анализ стабильности С^-бокс-РНК РМ.8 в клетках МСР-7 методом ОТ-ПЦР. Клетки инкубировали с аналогом РМ.8 в присутствии липофектамина (2, 4, 5, 8, 10, 11) либо без липофектамина (1, 3, 7, 9) в течение указанного времени (3, 21 либо 26 ч). Контрольные клетки инкубировали с липофектамином без РМ.8 (6, 12) в течение 21 ч. 1-6 - Продукты ОТ-ПЦР кДНК РНК, выделенной из ядерной фракции; 7-12 - продукты ОТ-ПЦР кДНК РНК, выделенной из цитоплазматической фракции. Продукты ОТ-ПЦР разделяли гель-электрофорезом в 2% агарозном геле. М - маркер молекулярной массы ДНК.
А • . Б в
Г Д Е
позволяет заключить, что в присутствии липофектамина синтетические C/D-бокс-РНК эффективно проникают в цитоплазму и ядро клеток, где могут участвовать в процессинге пре-мРНК-мишени.
Данные ОТ-ПЦР хорошо согласуются с результатами анализа распределения меченной FAM РНК РМ.8 в клетках MCF-7 при помощи флуоресцентной микроскопии. Так, при инкубации клеток в среде с меченной FAM РМ.8 C/D-бокс-РНК в комплексе с липофектамином происходит захват, интернализация и распределение РНК и в цитоплазме, и в ядре клеток (рис. 4).
Известно, что посттранскрипционным модификациям - псевдоуридилированию и 2'-0-метилированию - чаще подвергаются нуклеотиды рРНК, непосредственно вовлеченные в формирование активных центров рибосом или расположенные вблизи них [11]. Эти данные позволяют предположить, что посттранскрипционные модификации существенно влияют на структуру рРНК в процессе сборки и, в конечном счете, определяют функциональность рибосом [11-13].
Для оценки способности аналогов С^-бокс-РНК направлять модификацию рРНК анализировали индукцию 2'-0-метилирования мишени второй области узнавания - G1702 18S рРНК. G1702 был выбран в качестве мишени как один из ключевых нуклеотидов декодирующего центра человеческих рибосом
Рис. 4. Анализ накопления С^-бокс-РНК РМ.8 в клетках МСР-7 методом флуоресцентной микроскопии. Представлены изображения трансфицированных (А -В) и контрольных клеток (Г - Е): А, Г - зеленый фильтр (РАМ-меченый аналог С^-бокс-РНК РМ.8); Б, Д -синий фильтр (окрашивание ядер с помощью DAPI); в, Е - наложение двух изображений.
[14]. В структуре рРНК из клеток MCF-7, трансфицированных синтетическими аналогами, методом ограниченного щелочного гидролиза не удалось обнаружить дополнительного 2'-0-метилированного нуклеотида в положении G1702 18S рРНК (рис. 5). Присутствие 2'-0-метилированного нуклеотида в составе рРНК в продуктах обратной транскрип-
Рис. 5. Анализ индукции 2'-0-метилирования G1702 18Б рРНК. Продукты обратной транскрипции. 1—5 - рРНК клеток МСР-7, трансфицированных аналогами С^-бокс-РНК РМ.7-РМ.11 соответственно; 6 - рРНК контрольных клеток; 7—10 - продукты термина-ции обратной транскрипции рРНК клеток МСР-7 в присутствии ddNTP (секвенирование соответствующего участка 18Б рРНК человека). Продукты обратной транскрипции ограниченно гидролизованной рРНК разделяли гель-электрофорезом в 12% денатурирующем полиакриламидном геле. Стрелкой слева указано положение кДНК-продукта, снижение выхода которого может указывать на 2'-0-метилирование G1702 18Б рРНК.
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10
-С
-С
-С 1702 - мишень -С
-с
-с
■9
-и
-с
-д
-с
-U
-а
-с
-и
-а
-с
о
K
Таблица 2. Синтетические аналоги и24 С^-бокс-РНК, направленные на нуклеотиды 18Б и 28S рРНК человека
Обозначение Нуклеотидная последовательность* Нуклеотид-мишень в рРНК человека
РР.1827 Б'-ОООиОСАОАийАЦ'йи'ААААиАОСОАСОООСООиОСийА ОАОАШЄиаАиЄАССиШШАСОАСиШСиаАШСАССС-3' и182718S
РР.4499 Б'-ОООиОСАОАийАЦ'йЦААААиАОСОАСОООСООиОСийА ОАОАШеиаАиеЛАСООиСиАААСССАОСиаАШСАССС-3' G4499 28S
РР.4500 Б'-ОООШСАОАиЄАиЄЦААААиАОСОАСОООСООШСиЄА ОАОАШЄиаАиЄАОАСООиСиАААСССАСиаАШСАССС-3' и450028S
РР.4502 Б'-ОООШСАОАиЄАиЄЦААААиАОСОАСОООСООШСиЄА ОАОАиОСиСЛиСААСОАСООиСиААЛСССиСАиОСАССС-3' И4502 28S
* См. примечание к табл.1.
ции статистически гидролизованной рРНК приводит к снижению выхода кДНК-продукта, длина которого определяется положением нуклеотида, прилежащего с З'-стороны к 2'-0-метилированному нуклеотиду [8]. Однако, как видно из рис. 5, при трансфекции клеток человека любым из аналогов C/D-бокс-РНК выход кДНК-транскрипта, соответствующего 2'-0-метилированному G1702 18S рРНК, не снижается.
Влияние синтетических аналогов C/D-бокс-РНК на посттранскрипционную модификацию рРНК в клетках человека анализировали с использованием сконструированных и полученных аналогов и24 C/D-бокс-РНК, первая область узнавания которых
была направлена на нуклеотиды 18S и 28S рРНК человека. Нуклеотидные последовательности аналогов С^-бокс-РНК представлены в табл. 2. Выбранные мишени являются ключевыми нуклеотидами функциональных центров рибосом: Ш827 18S рРНК - входит в состав декодирующего центра рибосом; G4499, и4500, и4502 28S рРНК - в пептидилтрансферазный центр [3, 4]. Вторая область узнавания аналогов ф'-бокс-зависимая) направлена на G1702 18S рРНК человека (табл. 2).
Проведен сравнительный анализ влияния аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток MCF-7. Влияние аналогов С^-бокс-РНК оценивали после инкубации клеток в среде с начальной концен-
трацией РНК - 3.0, 10.0 и 70.0 нМ. Из рис. 6 видно, что наибольшее снижение жизнеспособности (>35%) вызывали C/D-бокс-РНК, направленные на U1827 18S рРНК, G4499, U4500 и U4502 28S рРНК. При этом аналоги U24 РНК, первая область узнавания которых направлена на пре-мРНК белка hsc70, вызывают снижение жизнеспособности и пролиферации клеток не более чем на 22% (рис. 6, РМ.7 и РМ.8).
Для анализа индукции de novo 2'-0-метилирования нуклеотидов-мишеней клетки MCF-7 трансфицировали аналогами C/D-бокс-РНК (табл. 2) и выявляли 2'-0-метилированные нуклеотиды рРНК методом ограниченного щелочного гидролиза. Установлено, что в пуле суммарной РНК трансфицированных клеток MCF-7 вклад форм рРНК, содержащих 2'-0-метилированный нуклеотид-мишень, был ниже уровня чувствительности метода детекции.
Совокупность данных об изменении жизнеспособности клеток под действием C/D-бокс-РНК и наблюдаемое отсутствие модификации нуклеотидов-мишеней позволяют предположить, что влияние аналогов на клетки человека может быть обусловлено участием C/D-бокс-РНК не только в 2'-0-метилировании нуклеотидов рРНК, но и в других этапах посттранскрипционного процессинга рРНК и сборки рибосом.
О I** о О IN I'v 00
(Х Оь Оь Оь
О. О. О. О.
Аналог C/D-бокс-РНК
Рис. 6. Влияние синтетических аналогов О/й-бокс-РНК на жизнеспособность клеток МОР-7. Клетки МОР-7 после трансфекции комплексом РНК/липофектамин инкубировали в течение 3 сут. Показано снижение жизнеспособности (средние и стандартные отклонения МТТ-индекса в серии из трех независимых экспериментов) клеток, инкубированных в присутствии: 3.0 нМ (зеленый); 10.0 нМ (синий); 70.0 нМ (красный) РНК. Снижение жизнеспособности 0% соответствует МТТ-индексу клеток, инкубированных с липофектамином безРНК.
ОБСУЖДЕНИЕ
Консервативные структурные элементы C/D-бокс-РНК - C/C' (RUGAUGA) и D/D' (^GA)^^^ а также область узнавания мишени обеспечивают способность этих РНК участвовать в формировании каталитического комплекса с белками метилтрансфе-разного комплекса и направлять 2'-0-метилирование заранее заданного нуклеотида [1, 2, 15]. Область узнавания мишени C/D-бокс-РНК представляет собой последовательность из 10-21 нуклеотида, комплементарную РНК-мишени, при этом метилируемый нуклеотид комплементарен пятому нуклеотиду мяоРНК с 5'-стороны от D-бокса [7].
Основными мишенями C/D-бокс-РНК в клетках эукариот являются рРНК и мяРНК. В то же время обнаружены мяоРНК, которые участвуют в процессинге пре-мРНК [6]. Ранее уже было установлено, что C/D-бокс-РНК могут взаимодействовать с транскриптами, синтезируемыми РНК-полимеразой II, и направлять 2'-0-метилирование заранее заданного нуклеотида РНК-мишени. При этом эффективность модификации нуклеотида-мишени значительно ниже, чем РНК-мишеней, синтезируемых в ядрышке РНК-полимеразой I [2]. Вместе с тем известно, что химическая модификация (в частности, метилирование) 2'-ОН-групп нуклеотидов, участвующих в сплайсинге пре-мРНК, существенно влияет на эффективность
этапов созревания пре-мРНК [16]. Поэтому аналоги С^-бокс-РНК, направляющие 2'-0-метилирование нуклеотидов пре-мРНК, представляют перспективную модель для разработки средств регуляции процессов сплайсинга.
В представленной работе сконструированы и получены аналоги и24 малой ядрышковой С^-бокс-РНК, направленные на нуклеотиды пре-мРНК гена HSPA8, кодирующего белок теплового шока (hsc70) (рис. 1). Нами установлено, что трансфекция клеток человека синтетическими аналогами С^-бокс-РНК, направленными на донорный и акцепторный сайты сплайсинга второго интрона, аденозин - точку разветвления сплайсинга, первый и последний нуклеотиды первого интрона пре-мРНК HSPA8 (табл. 1), приводит к увеличению количества продукта сплайсинга пре-мРНК без второго экзона (рис. 2). Можно предложить два основных механизма влияния аналогов С^-бокс-РНК на процессинг пре-мРНК-мишени - 2'-0-метилирование нуклеотида-мишени и комплементарное взаимодействие антисмыслового участка С/D-бокс-РНК с РНК-мишенью. Оба пути потенциально могут привести к ингибированию отдельных этапов сплайсинга и, как результат, к изменению соотношения вариантов альтернативного сплайсинга пре-мРНК-мишени.
Методы детекции 2'-0-метилированных нуклеотидов, широко применяемые в настоящее время, не позволяют эффективно выявлять такие модификации в мРНК и пре-мРНК. Поэтому нельзя однозначно сказать, происходит ли метилирование нуклеотида-мишени и обусловлено ли влияние на сплайсинг 2'-0-метилированием пре-мРНК-мишени. Известно, что ключевые точки сплайсинга пре-мРНК в разной степени чувствительны к модификациям 2'-ОН-групп остатков рибозы [16]. Полученные данные не позволяют говорить о существенных различиях в эффективности подавления сплайсинга аналогами C/D-бокс-РНК, направленными на разные нуклеотиды пре-мРНК, поэтому нельзя исключать возможность того, что наблюдаемое частичное изменение соотношения форм альтернативного сплайсинга пре-мРНК-мишени обусловлено ингибированием сплайсинга антисмысловой РНК по механизму, описанному для различных производных олигонуклеотидов [17-19].
Для участия в сплайсинге искусственная РНК должна взаимодействовать с пре-мРНК-мишенью внутри ядра. Как было показано, в присутствии ли-пофектамина аналоги C/D-бокс-РНК эффективно проникают в клетки человека (рис. З, 4). Из рис. З видно, что аналог C/D-бокс-РНК достоверно детектируется методом ОТ-ПЦР спустя 26 ч после однократной трансфекции с использованием липофек-тамина в ядерной и цитоплазматической фракциях РНК клеток MCF-7. Полученные данные указывают на то, что искусственные C/D-бокс-РНК потенциально доступны для взаимодействия с РНК-мишенями, локализованными внутри ядра. Накопление синтетической РНК в клетках подтверждается методом флуоресцентной микроскопии (рис. 4). Более того, установлено, что синтетические аналоги C/D-бокс-РНК в присутствии липофектамина эффективно сохраняются и обнаруживаются методом ОТ-ПЦР внутри клеток человека спустя 72 ч после однократной трансфекции (данные не иллюстрированы). В то же время в случае трансфекции без использования ли-пофектамина синтетические РНК не детектируются в клетках человека методом ОТ-ПЦР уже через З ч после добавления в культуральную среду (рис. З).
У всех полученных нами аналогов U24 мяоРНК одна из двух областей узнавания мишени сконструирована таким образом, чтобы направлять 2'-0-метилирование G1702 18S рРНК человека (табл. 1). Ранее мы показали, что трансфекция клеток человека синтетическими аналогами С/D-бокс-РНК, направленными на нуклеотиды рРНК (табл. 2), вызывает терминацию обратной транскрипции на нуклеотидах-мишенях [20, 21]. Однако анализ 2'-0-метилирования G1702 18S рРНК
клеток, трансфицированных аналогами C/D-бокс-РНК, методом частичного щелочного гидролиза не выявил дополнительной 2'-0-метильной группы в заданном положении (рис. 5). Не обнаружено также de novo 2'-0-метилирования нуклеотидов рРНК - мишеней аналогов, перечисленных в табл. 2 (после трансфекции клеток соответствующими РНК). При этом с помощью использованного метода нам удавалось определить положение ряда известных 2'-0-метилированных нуклеотидов рРНК человека.
Для объяснения отсутствия модификации нуклеотидов-мишеней (кроме известных ограничений методов анализа [8]) необходимо дополнительно рассмотреть следующие данные. Известно, что участие C/D-бокс-РНК в 2'-0-метилировании рРНК клеток человека возможно только при условии узнавания этой РНК белками - субъединицами метилтрансферазного комплекса - фибриларином, NOP56p, NOP58p и 15.5 кДа, и формирования комплекса с участием C/D-бокс-РНК [22-24]. Поэтому наблюдаемый низкий выход 2'-0-метилирования мишеней можно объяснить низкой эффективностью сборки каталитически компетентных метилтранс-феразных комплексов с аналогами C/D-бокс-РНК. Вместе с тем, ранее Liu В. и соавт. [З, 4, 25] при трансфекции клеток дрожжей ДНК-конструкциями, кодирующими аналоги C/D-бокс-РНК, показали, что в трансфицированных клетках происходит экспрессия и созревание искусственных мяоРНК. Оказалось также, что экспрессия C/D-бокс-РНК, направленных на ряд нуклеотидов рРНК, существенно снижала скорость пролиферации и жизнеспособность клеток. Совокупность полученных данных позволила заключить, что именно 2'-0-метилирование нуклеотидов рРНК, направляемое аналогами C/D-бокс-РНК, было основной причиной влияния ДНК-конструкций на скорость пролиферации клеток. Однако в случае ряда C/D-бокс-РНК [3, 4, 25] удалось выявить лишь низкий уровень 2'-0-метилирования (либо отсутствие модификации) нуклеотидов-мишеней. С другой стороны, известно, что посттран-скрипционные модификации - 2'-0-метилирование и псевдоуридилирование, происходят на стадии созревания 47S рРНК-предшественника [7, 26-28]. На стадии сборки функциональных рибосом проверяется качество рРНК-транскрипта, и неправильные, нефункциональные РНК-транскрипты подвергаются при этом деградации в экзосомах [29]. Синтетические аналоги C/D-бокс-РНК направлены на нуклеотиды рРНК, непосредственно участвующие в формировании и функционировании активных центров рибосомы. Возможно, 2'-0-метилирование рРНК, направляемое синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК, существенно влияет на структуру рРНК и функ-
циональность рибосом, что, как следствие, приводит к быстрой деградации модифицированной РНК и ее низкому содержанию в трансфицированных клетках [25, 29].
Несмотря на наблюдаемое отсутствие модификации нуклеотида-мишени, искусственные C/D-бокс-РНК, комплементарно взаимодействуя с рРНК-мишенью, могут участвовать в регуляции процессов созревания рРНК-транскриптов, а также в сборке и функционировании рибосом. Таким образом, синтетические аналоги C/D-бокс-РНК могут участвовать в процессах жизнедеятельности трансфицированных клеток и, как результат, влиять на жизнеспособность и пролиферацию клеток человека.
Влияние аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток человека MCF-7 мы оценивали с использованием MTT-теста. Полученные нами данные позволили заключить, что трансфекция клеток синтетическими аналогами, первая область узнавания которых направлена на нуклеотиды 18S и 28S рРНК (табл. 2), приводит к снижению их жизнеспособности на 36-48% при начальной концентрации синтетической РНК в среде 70.0 нМ (рис. 6, РР.1827, РР.4499, РР.4500, РР.4502). В то же время синтетические аналоги, направленные одновременно на пре-мРНК белка теплового шока hsc70 и на G1702 18S рРНК (табл. 1), снижали жизнеспособность клеток только на 20-25% в диапазоне начальной концентрации 3.0-70.0 нМ (рис. 6, РМ.7, РМ.8).
При трансфекции клеток MCF-7 синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК, направленными на U1827 18S рРНК, G4499, U4500 и U4502 28S рРНК, значительно снижалась скорость пролиферации и образования монослоя, а также изменялась морфология клеток. При этом уровень снижения жизнеспособности отличался у разных аналогов и зависел от нуклеотида-мишени и начальной концентрации РНК в культуральной среде (рис. 6).
Различие во влиянии синтетических аналогов C/D-бокс-РНК на жизнеспособность клеток MCF-7 указывает на то, что в процессе трансфекции эти РНК вовлекаются в регуляцию жизненно важных процессов в клетках человека. Тот факт, что это
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bachellerie J.P., Cavaille J., Huttenhofer A. // Biochimie. 2002. V. 84. P. 775-790.
2. Cavaille J., Nicoloso M., Bachellerie J.P. // Nature. 1996. V. 383. P. 732-735.
3. Liu B., Fournier M. // RNA. 2004. V. 10. P. 1130-1141.
4. Liu B., Ni J., Fournier M. // Methods. 2001. V. 23. P. 276-286.
5. Vitali P., Basyuk E., Le M.E., Bertrand E., Muscatelli F., Cavaille J., Huttenhofer A. // J. Cell. Biochem. 2005. V. 169.
P. 745-753.
6. Kishore S., Stamm S. // Science. 2006. V. 311. P. 230-232.
различие обусловлено изменением структуры области узнавания мишени, позволяет предположить, что основной процесс, модулируемый аналогами C/D-бокс-РНК, это посттранскрипционный процессинг пре-рРНК. Необходимо отметить, что в качестве мишеней мы выбрали нуклеотиды рРНК, которые входят в состав активных центров рибосом - декодирующего и пептидилтрансферазного (табл. 2). Ранее Liu B. и соавт. [3, 4, 25] показали, что экспрессия в клетках дрожжей C/D-бокс-РНК, направленных на эти нуклеотиды, вызывала подавление их роста и приводила к частичной деградации рРНК.
Подавление жизнеспособности клеток человека под действием аналогов C/D-бокс-РНК указывает на их участие в регуляции процессов жизнедеятельности трансфицированных клеток. Наблюдаемое отсутствие модификации нуклеотидов-мишеней позволяет предположить, что аналоги C/D-бокс-РНК, направленные на рРНК, слабо вовлекаются в процессы 2'-0-метилирования нуклеотидов рРНК, но, возможно, участвуют в других этапах посттранскрипци-онного процессинга рРНК и в созревании рибосом.
ВЫВОдЫ
В настоящей работе показано, что трансфекция клеток MCF-7 - аденокарциномы молочной железы человека, синтетическими аналогами C/D-бокс-РНК, направленными на нуклеотиды пре-мРНК белка теплового шока hsc70, приводит к нарушению сплайсинга пре-мРНК-мишени. Трансфекция клеток MCF-7 аналогами C/D-бокс-РНК, направленными на нуклеотиды 18S и 28S рРНК, ключевые для функционирования рибосом, вызывает снижение жизнеспособности клеток. Полученные результаты указывают на перспективность разработки средств регуляции трансляции и экспрессии генов человека на основе структуры мяоРНК.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № 10-04-01386-а и 10-04-01442-а), грантом Президиума СО РАН № 18 (2009-2011 гг.).
7. Kiss-Laszlo Z., Henry Y., Bachellerie J.P., Caizergues-Ferrer M., Kiss T. // Cell. 1996. V. 85. P. 1077-1088.
8. Maden B. // Methods. 2001. V. 25. P. 374-382.
9. Qu L.H., Henry Y., Nicoloso M., Michot B., Azum M.C., Re-nalier M.H., Caizergues-Ferrer M., Bachellerie J.P. // Nucl. Acids Res. 1995. V. 23. P. 2669-2676.
10. Rohde M., Daugaard M., Jensen M.H., Helin K., Nylandsted J., Jaattela M. // Genes Dev. 2005. V. 19. P. 570-582.
11. Decatur W.A., Fournier M.J. // Trends Biochem. Sci. 2002. V. 27. P. 344-351.
12. King T.H., Liu B., McCully R.R., Fournier M.J. // Mol. Cell.
2003. V. 11. P. 425-435.
13. Baxter-Roshek J.L., Petrov A.N., Dinman J.D. // PLoS ONE. 2007. V. 2. e174.
14. Graifer D.M., Karpova G.G., Knorre D.G. // Biochemistry. 2001. V. 66. P. 585-602.
15. Kiss-Laszlo Z., Henry Y., Kiss T. // EMBO J. 1998. V. 17.
P. 797-807.
16. Moore M., Sharp P. // Science. 1992. V. 256. P. 992-997.
17. Dominski Z., Kole R. // Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 74457454.
18. Sazani P., Kole R. // J. Clin. Invest. 2003. V. 112. P. 481-486.
19. Zalachoras I., Evers M.M., van Roon-Mom W.M., Aartsma-Rus A.M., Meijer O.C. // Front. Mol. Neurosci. 2011. V. 4. P. 1-12.
20. Semenov D.V., Stepanov G.A., Baryakin D.N., Koval O.A., Kuligina E.V., Richter V.A. // Circulating Nucleic Acids in Plasma and Serum / Ed. Gahan P.B. Springer Science+Business Media B.V. 2011. P. 233-237.
21. Semenov D.V., Vratskih O.V., Kuligina E.V., Richter V.A. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008. V. 1137. P. 119-124.
22. Watkins N.J., Segault V., Charpentier B., Nottrott S., Fabrizio P., Bachi A., Wilm M., Rosbash M., Branlant C., Luhrmann R. // Cell. 2000. V. 27. V. 103. P. 457-466.
23. Tollervey D., Lehtonen H., Jansen R., Kern H., Hurt E.C. // Cell. 1993. V. 72. P. 443-457.
24. Newman D.R., Kuhn J.F., Shanab G.M., Maxwell E.S. //
RNA. 2000. V. 6. P. 861-879.
25. Liu B., Liang X.-H., Piekna-Przybylska D. // RNA Biol. 2008. V. 5. P. 249-254.
26. Ganot P., Bortolin M.L., Kiss T. // Cell. 1997. V. 89. P. 799-809.
27. Panse V.G., Johnson A.W. // Trends Biochem. Sci. 2010. V. 35. P. 260-266.
28. Freed E., Bleichert F., Dutca L., Baserga S. // Mol. Biosyst. 2010. V. 6. P. 481-493.
29. Vanacova S., Stefl R. // EMBO Rep. 2007. V. 8. P. 651-657.
