CC BY
90
УДК 579.82:630.905
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОТХОДОВ ДЕЛИГНИФИКАЦИИ
ДЛЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КСИЛОТРОФНЫХ ГРИБОВ
В.П. Саловарова, В.А. Мелентьев, О.А. Берсенева
Иркутский государственный университет,
Российская Федерация, 664003, г. Иркутск, ул. К. Маркса, 1.
metagenom2011 @дтаН.сот
Исследована метаболизируемость лигнина, выделенного в процессе щелочной и окислительно-щелочной делигнификации. При глубинном культивировании макромицетов на питательных средах со щелочным лигнином наблюдался высокий уровень лакказной активности. Наибольшую способность к синтезу лакказы - одного из основных ферментов лигнинолитического комплекса, выполняющего ключевую роль в процессе деградации лигнина, продемонстрировал гриб Trametes риЬвзсвпв. Ил. 4. Библиогр. 11 назв.
Ключевые слова: лигнин, биодеградация, грибы, лигнолитические ферменты, глубинное культивирование.
ВВЕДЕНИЕ
Формирование современного рынка наукоемких промышленных технологий невозможно без фундаментальных разработок биотехнологического профиля. Возрастающая ограниченность сырьевых ресурсов и нежелательные экологические изменения в природной среде все острее ставят вопрос о разработке комплексной и экологически оправданной технологии переработки вторичных растительных ресурсов. Серьезной проблемой, препятствующей масштабированию процессов биологической конверсии, являются структурные особенности основных полимеров различных лиг-ноцеллюлозных субстратов, которые придают растительным тканям устойчивость к ферментам. Существенное повышение реакционной способности материала к ферментативному гидролизу обеспечивает использование предварительной делигнификации, в основе которой лежат процессы, связанные с освобождением лигнина из лигноуглеводной матрицы [1].
Исследования ряда делигнификационных процессов с целью получения субстратов эффективно конвертируемых целлюлазами, показали, что целесообразно применять для этого лиственные породы деревьев, так как в этом случае возможно использование мягких условий обработки. Одним из химических способов делигнификации является щелочная и окислительно-щелочная предобработка. Применение щелочной и окислительно-щелочной делигни-фикации древесины березы и пшеничной соломы позволяет значительно снизить содержание лигнина в субстрате при почти полном сохранении целлюлозного комплекса, т. е. обеспечивает существенное повышение реакционной способности растительного матери ала к ферментативному гидролизу. Однако при щелочном и окислительно-щелочном способе предобработки происходит накопление щелочного лигнина, который выделяют подкислени-ем соляной кислотой варочного щелока, остающегося после отделения предобработанно-
го субстрата. В случае пшеничной соломы выход щелочного лигнина при обработке только щелочью составляет 18,6%, при окислительно-щелочной обработке 6,15%, а в случае древесины березы 2,61% и 0,35% соответственно [2].
Одним из возможных путей использования щелочного лигнина является получение на их основе дешевых питательных сред для выращивания ксилотрофных грибов, которые синтезируют активный комплекс лигнолитических ферментов, разлагающих лигнин. Использование высокопродуктивных деструкторов лигнина и их высокой окислительной способности открывает широкие возможности для применения, как самих продуцентов, так и их ферментов в системах детоксификации и деградации ксенобиотиков, биоремедиации вод и почв [3, 4].
В связи с вышесказанным, представляло интерес исследовать возможность использования щелочного лигнина в качестве компонента питательных сред для глубинного культивирования ксилотрофных грибов, изучить особенности их роста и синтеза ферментов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В качестве объектов исследования использовали культуры дереворазрушающих грибов, характеризующихся высокой скоростью роста на агаризованной среде. Культуры грибов выращивали глубинным способом в колбах Эр-ленмейера, содержащих 250 мл питательной среды следующего состава, в %: NH4NOз 0,3; КН2РО4 0,1; MgSO4•7H2O 0,05; КС1 0,05; CuSO4 • 5Н2О 0,002; MnSO4•7H2O 0,001, кукурузный экстракт 0,2% и щелочной лигнин, который вносили в питательную среду в количестве 40-80 мл/л. Культивирование проводили при температуре 26-28 оС на качалке при 180-200 об/мин в течение 10 сут. В качестве посевного материала использовали 10-14 суточную культуру грибов. Инокулюм вносили в опытные колбы в количестве 15% от объема среды. Выращенный грибной мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием и оценивали прирост
биомассы. До и после культивирования снимали УФ-спектры образцов используемого лигнина с помощью спектрофотометра СФ-26 в диапазоне 220-350 нм [5]. Активность лакказы в культу-ральной среде определяли спектрофотомет-рически при 410 нм с использованием в качестве субстрата пирокатехина марки А, очищенного вакуумной возгонкой. Математическую обработку результатов экспериментов и оценки достоверности проводили по критерию Стьюдента для уровня вероятности не менее 95% с использованием пакета программ Microsoft Excel 97.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Известно, что эффективность деградации лигнина грибами зависит, прежде всего, от их лигнолитической системы, от активности отдельных ее компонентов [6]. Основная роль в процессах деструкции лигнина отводится ок-сидоредуктазам. Особый интерес представляют фенолоксидазы, синтезируемые экологической группой дереворазрушающих грибов, относящихся к классу Basidiomycetes. Ферментом, широко распространенным среди дерево-разрушающих грибов, является лакказа [7]. Лакказа (п-дифенол:кислород оксидоредукта-за, КФ 1.10.3.2) наряду с лигнинпероксидазой и марганецпероксидазой - один из основных ферментов, входящих в лигнолитический комплекс. Этот фермент играет ключевую роль в процессе деградации лигнина, относится к классу медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями непосредственно до воды, минуя стадию образования перекиси водорода [8]. Лакказа обладает широкой субстратной специфичностью по отношению к
различным органическим и неорганическим соединениям, являющимися донорами электронов в ферментативной реакции. Утрата этого фермента микробной культурой приводит к потере ее способности окислять фенольные подструктуры лигнина [9]. Для быстрого скрининга способности грибов к деструкции лигнина было проведено их тестирование по методу Бавендама на основании появления коричневой окраски в субстрате вблизи растущего мицелия [10]. Результаты быстрого скрининга грибов-деструкторов лигнина по реакции Бавендама показали, что грибы Pleurotus ostreatus (jacq.: Fr.) Kumm, Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quel., Trametes versicolor (L.: Fr.) Quel., Trametes pu-bescens (Fr.) Quel. образуют наибольшие по диаметру окрашенные зоны и были отобраны для дальнейших исследований. Культуры грибов Trametes pubesceus штамм 87; Trametes versicolor штамм 25 были любезно предоставлены |И.А Решетниковой (кафедра микологии и
альгологии МГУ), а культуры Реиг^ив ри!топа-пив штамм 001, Р!еигоив оЗгеа^в штамм 053 были выделены на территории Иркутской области и любезно предоставлены А.Н. Петровым (кафедра ботаники, ИГУ).
Изучение динамики продукции лакказы в ходе глубинной ферментации на питательной среде содержащей 40 мл/л щелочного лигнина березы (ЩЛБ) и пшеничной соломы (ЩЛС) показало, что высокий уровень активности лакказы наблюдается у Тгате(ев риЬевсепв 87 (рис. 1).
Исследуемые культуры грибов в условиях глубинного культивирования образуют сферические скопления мицелия (пеллеты) 1-3 мм в диаметре, в среде культивирования также присутствуют и отдельные гифы. Добавление щелочного лигнина в питательную среду для глубинного культивирования в указанной выше
" 1. Trametes pubescens (ЩЛБ) " 2. Pleurotus pulmonarius (ЩЛБ) -3. Pleurotus ostreatus 053 (ЩЛБ)
4. Trametes pubescens (ЩЛС)
5. Pleurotus pulmonarius 001 (ЩЛС)
6. Pleurotus ostreatus 053 (ЩЛС)
4 6 8
Продолжительность культивирования, суток
Рис. 1. Динамика образования лакказы при культивировании грибов на щелочном лигнине березы (ЩЛБ) и пшеничной соломы (ЩЛС):
1 - Tгametes риЬевсепв 87 (ЩЛБ); 2 - Р!еигоШв ри!топапив 001(ЩЛБ); 3 - Р!еиго}ив oвtгeatuв 053 (ЩЛБ); 4 - Tгametes риЬевсепв 87 (ЩЛС); 5 - Р!еигоШв ри!топапив 001 (ЩлС); 6 - Р!еигоШв ов&еаШв 053 (ЩлС)
□ .8
0,7
□ .6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
2
концентрации не вызывало угнетения роста культуры гриба. Содержание биомассы возрастало на протяжении всего периода культивирования и варьировало от 1,85-3,60 г/л (рис. 2).
В процессе культивирования грибов на средах со щелочным лигнином происходит осветление питательной среды. Сравнительный анализ спектров методом УФ-спектрофото-метрии хлороформенных экстрактов питательной среды со щелочным лигнином показал, что спектры экстрактов культуральной жидкости не имеют четко выраженного максимума поглощения при X = 280 нм, присущего для среды, содержащей лигнин. Это свидетельствует о способности грибов к деструкции лигниновых хромоформных компонентов, определяющих коричневую окраску щелочного лигнина, так как питательная среда в процессе культивиро-
вания осветляется.
Исследование действия косубстратов на синтез лакказы и накопление грибной биомассы показало, что за счет внесения дополнительного более доступного субстрата повышается и уровень биомассы в среде. Прирост биомассы на 10 сутки роста грибов на средах со щелочным лигнином березы в присутствии глюкозы у Trametes риЬезсепв 87 составил 8,48 г/л против 3,65 г/л в отсутствии целлюлозы, а у Pleurotus рШтопаг^ 001 - 7,82 г/л и 3,10 г/л соответственно (рис. 3).
Добавление в питательные среды со щелочным лигнином глюкозы 0,5% вызывало снижение уровня образования лакказы в большинстве случаев, что согласуется с литературными данными об ингибировании процесса деградации лигнина глюкозой [6, 11].
Биомасса, г/л
Рис. 2. Накопление биомассы макромицетами на среде со щелочным лигнином
|ь
|| с
и и п
= =1
Т
Р
Тгатеаез риЬепсепа Игате^^^ уегг1со1ог
Р1еиеП:и5 ри1топапии 001 I Р1еипП:и5 озСгепаии 003
Рис. 3. Накопление биомассы макромицетами на среде с разными соотношениями щелочного лигнина
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
□
9,00
8.00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Внесение в питательные среды в качестве ко-субстрата целлюлозы (0,5%) способствовало накоплению биомассы и в ряде случаев повышению уровня лакказной активности (рис. 4).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенные исследования показали, что щелочной лигнин может быть использован как компонент питательной среды для культивирования макромицетов, накопления их биомассы, и синтеза внеклеточных лигнолитических ферментов, в частности лакказы, которая инициирует окисление суб-
83
страта. Рост грибов на питательных средах со щелочным лигнином способствует их осветлению. Базидиальные грибы рода Tгametes быстрее адаптируются к искусственным условиям культивирования и в перспективе могут представлять интерес не только для деструкции щелочного лигнина, получения лакказы, но и для биологической очистки сточных вод предприятий по переработке древесины. При изучении их практической ценности перспективными могут быть исследования изменения эн-зиматической активности в ряду поколений на средах, содержащих источники лигнина.
£ 0.40
■ Trametes pubescens
■ Trametes versicolor
■ Pleurotus pulmonarius 001
■ Pleurotus ostreatus 053
I 3
i 3
i 3
Рис. 4. Активность лакказы макромицетов на средах с косубстратами
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Пен Р.З., Пен В.Р. Теоретические основы де-лигнификации. Красноярск : Красноярский писатель. 2007. С. 348.
2. Киселева З.Л. Окислительно-щелочная и воднобутанольная делигнификация растительного сырья для получения глюкозы ферментативным гидролизом : автореф. дис. канд. хим. наук. Иркутск, 1993. 24 с.
3. Королева О.В. Лаккказы базииомицетов; свойства, структура, механизм действия и практическое применение // Автореф. дис. д-ра. биол. наук. М., 2006. 50 с.
4. Белова Н.В., Денисова Н.П. Грибы белой гнили древесины и возможность их использования для утилизации отходов // Биотехнология. 2005. № 4. С. 55-58.
5. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофо-тометрический анализ в органической химии // Л. : Химия, 1986. 305 с.
6. Головлева Л.А., Ганбаров Х.Г. Микробная деградация лигнина // Успехи микробиологии. 1982. № 2. 192 с.
7. Теоретические основы биотехнологии дре-
весных композитов. Т. 2. Ферменты, модели, процессы / Болобова А.В. [и др.] // М. : Наука, 2002. С. 343.
8. Ревина А.А., Хайкин Г.И., Протасова Е.Л., Мезенцева Н.В., Степанова Е.В., Скоробогатько О.В. Кислородные эффекты в водных растворах лак-каз:спектральные свойства и реакционная способность // Известия Академии Наук. Химическая серия. 2000. № 8. С. 1471-1474.
9. Лакказы из базидиомицетов : физико-химические характеристики и субстратная специфичность по отношению к метоксифенольным соединениям / Смирнов С.А. [и др.] // Биохимия. 2001. Т. 66. № 7. С. 774-779.
10. Salovarova V.P., Pristavka А.А., Kozlov Y.P. The effectiveness of using microbiological methods in degradation of phenols // IXICM IX th International Congress of Mycology, Sydney, Australia, 16-20 august, 1999. Р. 1357-1359.
11. Ander P., Eriksson K.E. Lignin degradation and utilization by microorganisms // Progress Industrial. Microbiol. Elsevier. Scient. Publ. Comm. Oxford N-Y. 1978. V. 41. P. 1-58.
0.80
0.70
0.60
0.50
ь 0.30
0.20
0.10
0.00
