CC BY
26
Краткие сообщения
использование олигосахаридов иммуноглобулинов для модификации моноклональных антител
А.С. Гриневич, м.н. краева, о.С. Бурова, П.к. Иванов
ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Aнатолий Станиславович Гриневич [email protected]
Введение. Моноклональные антитела (МКАТ) служат надежным и удобным инструментом диагностики патологий человека. Чаще всего они используются в качестве конъюгатов с флуоресцентными и иными метками. Классический подход создания таких конъюгатов сводится к химическим реакциям с использованием белковой основы моноклональных антител. Вместе с тем для целого ряда МКАТ изготовление конъюгата сопровождается встраиванием метки в антигенсвязывающий участок, что приводит к уменьшению или полной потере специфической активности конъюгата. Выходом из данной ситуации может стать синтез флуоресцентных конъюгатов методами углеводной химии через пространственно удаленные от активного центра олигосахариды антител.
Цель исследования — показать принципиальную возможность химической модификации олигосахаридов МКАТ серии ICO и получить на их базе флуоресцентные конъюгаты.
Материалы и методы. В работе использовалась панель МКАТ серии ICO высокой степени очистки. Олигосахариды МКАТ, окисляясь до альдегидных групп, подвергались взаимодействию с гидразиновым производным биотина и конъюгировались со стрептавидин-флуоресцеином. Полученный комплекс был использован для прямой реакции иммунофлуоресценции. Результаты. Все модифицированные МКАТ сохраняли специфичность связывания с клетками-мишенями, присущую натив-ным антителам.
Заключение. Данный метод может быть альтернативой для конъюгирования флуоресцентных меток с МКАТ, для которых методы белкового синтеза приводят к потере активности конъюгата.
Ключевые слова: моноклональные антитела, флуоресцентные конъюгаты, олигосахарид IgG, проточная цитометрия
the use of oligosaccharides of immunoglobulin for modification
of monoclonal antibodies
A.S. Grinevich, M.N. Kraeva, O.S. Burova, P.K. Ivanov
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow, 115478, Russia
Bakground. Monoclonal antibodies are reliable and convenient tool for the diagnosis of human pathologies. Most often they are used as conjugates with fluorescent or other labels. The classical approach of creating such conjugates reduces chemical reactions using monoclonal antibodies protein base. However, for a number of manufacturing monoclonal antibodies conjugate followed by embedding tags in the antigen binding site, which leads to reduction or complete loss of specific activity of the conjugate. The way out of this situation could be the synthesis of fluorescent conjugates, methods of carbohydrate chemistry through spatially distant from the active site of the antibody oligosaccharides.
The purpose of the study — to show the fundamental possibility of chemical modification of the oligosaccharides monoclonal antibodies ICO series and get to their base fluorescent conjugates.
Materials and methods. We used monoclonal antibodies panel ICO series of high purity. Oligosaccharides monoclonal antibodies oxidized to aldehyde groups, is reacted with a hydrazine derivative of biotin and streptavidin-conjugated flyuoristsiinom. The resulting complex was used for the direct reaction immunofluorescence.
Results. All modified monoclonal antibodies retain binding specificity to target cells inherent to native antibodies.
Conclusions. This may be an alternative method for conjugating a fluorescent label with monoclonal antibodies to protein synthesis
methods which lead to loss of activity of the conjugate.
Key words: monoclonal antibody, fluorescent conjugates, oligosaccharide IgG, flow cytometry
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-4-44-48
Краткие сообщения 45
Введение 30 мин. К реакционной смеси добавляли 50 мкл эти- Иммуноглобулины по химической природе яв- ленгликоля и продолжали инкубировать еще 15 мин. ляются гликопротеидами. Классический подход По завершении реакции МКАТ отделяли от непрок модификации моноклональных антител (МКАТ) реагировавших продуктов. для их использования в иммунометрическом анали- взаимодействие окисленных мкАГ с модифици-зе сводится к химическим реакциям, затрагивающим рующими агентами. Сразу после окисления МКАТ белковую часть молекулы IgG. Наличие достаточно инкубировали гидразинактивированное производное большого количества стерически доступных амино- биотина (Biotin-LC-Hydrazide) в темноте при 25 групп на «поверхности» IgG позволяет вводить в струк- или 37 °С при постоянном перемешивании в течение туру этой молекулы флуоресцентные и иные маркеры, 2—24 ч. Далее МКАТ отделяли от непрореагировав-связывать IgG c хроматографическими сорбентами ших продуктов. Часть МКАТ после реакции с Biotin-и т. д. Однако наш опыт показывает, что для некото- LC-Hydrazide инкубировали со стрептавидин-флуо-рых МКАТ возможно получение конъюгата с потерей рисценином (STREPT-FITC) в темноте при комнатной специфической активности, что вероятно связано температуре при постоянном перемешивании в тес блокированием активного центра. Вместе с тем чение 18—24 ч для получения комплекса МКАТ-олигосахаридные детерминанты МКАТ расположены [спейсер]-флуоресцеин. Степень включения флуо-в области CH2 домена и связаны с аспарагином 297, ресцеина в IgG определяли спектрофотометрически, находясь вне антигенсвязывающего центра антител. измеряя поглощение конечного продукта при 2 дли-Показана принципиальная возможность использо- нах волн — 280 и 495 нм. Расчеты проводили по фор-вания олигосахаридов для модификаций поликло- мулам: нальных антител [1—3]. В течение нескольких лет в РОНЦ им. Н.Н. Бло- а _ (035 х А ) хина под руководством профессора А.Ю. Барышни- 80 ' 495 — [IgG] кова была создана коллекция гибридом-продуцентов 1,4 МКАТ серии ICO, сейчас они активно используются для диагностики онкологических и других заболева- где А280 - оптическая плотность раств°ра при 280 нм; ний. А495 — оптическая плотность раствора при 495 нм. Цель настоящего исследования — показать принципиальную возможность химической модификации 2,87 х А олигосахаридов МКАТ серии ICO и получить на их (0 35 х А ) ФЛ/ IgG, базе флуоресцентные конъюгаты. А280 ( , 495) Материалы и методы где [IgG] — концентрация МКАТ мг/мл; Получение и фракционирование мкат. В работе ФЛ/IgG — молярное отношение FITC в МКАТ. использованы клоны ICO 31 (анти-CD8), ICO 86 реакцию прямой и непрямой иммунофлуоресценции (анти-CD4), ICO 90 (анти-CD3), ICO 150 (анти-CD24), (риф) ставили с использованием клеток крови здо-ICO 160 (анти-CD95) и ICO 180 (анти-CD20). Источ- ровых доноров по стандартной методике [8]. ником МКАТ служили асцитные жидкости мышей линии BALB/c. Фракционирование МКАТ проводи- Результаты и обсуждение ли с использованием аффинной хроматографии После окисления углеводов МКАТ NaIO4 и по-на белке А [4], сульфата аммония, анионообменника следующей конъюгации с Biotin-LC-Hydrazide все MonoQ и гель-фильтрации на Superdex 200 [5], а так- исследованные МКАТ имели включенную биотино-же каприловой кислоты (КК) [6]. Чистоту получен- вую метку. Степень «биотинилирования» МКАТ и, ных МКАТ анализировали SDS-ПААГ электрофоре- следовательно, «окисленность» олигосахаридов мы зом по Лэммли [7]. оценивали косвенно по их реакции с STREPT-FITC, Периодатное окисление углеводов мкАт. МКАТ исследуя продукт МКАТ- [спейсер] -флуоресцеин переводили в 0,9 % раствор хлорида натрия, pH 6,5 (табл. 1). (ФР). Здесь и далее для смены буфера использовали Как видно из табл. 1, все исследованные МКАТ обессоливающие колонки PD-10, для концентриро- имели плотность включения флуоресцеина от 2 вания образцов — центрифужный фильтр Centriclon. до 4,5 молей на моль МКАТ. Такая степень включе-Готовили свежий 100 мМ раствор натрия периодата ния метки вполне согласуется с ранними результа-(NaIO4) на деионизированной воде. К образцам тами по изготовлению работоспособных МКАТ при МКАТ добавляли NaIO4 до конечной концентрации прямом включении флуоресцеин-изотиоцианата [9]. 1—10 мМ и выдерживали в темноте при температуре Плотность включения флуоресцеина в МКАТ незна-25 °С при постоянном перемешивании в течение чительно менялась при изменении концентрации
4 2016 том 15 1 vol. 15 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
46
Краткие сообщения
таблица 1. Характеристика конечного продукта синтеза MKAT-[спейсер]-флуоресцеин*
Характеристика продукта модифицированные мКАт
ICO 31 ICO 86 ICO 90 ICO 150 ICO 160 ICO 180
Метод выделения МКАТ КК КК Prt A** 3 сТ*** КК PrtA**
Концентрация МКАТ 0,7 0,4 0,6 0,4 0,5 0,6
Отношение флуоресцеин/белок 1,8 3,94 2,6 4,5 2,5 2,6
Примечание. МКАТ — моноклональные антитела; КК — каприловая кислота; * периодатное окисление проводили 10мМNaIO4; **PrtA — хроматография на белке А; *** — трехступенчатый метод фракционирования МКАТ (сульфатное осаждение, ионообменная хроматография и гель-фильтрация).
■
■
окислителя на 1-м этапе в диапазоне от 1 до 10 мМ ШЮ4 (табл. 2).
таблица 2. Характеристика конечного продукта синтеза МКАТ-[спейсер]-флуоресцеин для 1С090, окисленного различными концентрациями ШЮ4
Характеристика продукта Концентрации NaIO4
1 мм 5 мм 10 мм
Концентрация МКАТ 0,52 0,49 0,6
Отношение флуоресцеин/белок 2,9 3,0 2,6
На характеристики полученных конъюгатов МКАТ- [спейсер] -флуоресцеин не оказывал заметного эффекта способ их очистки (см. табл. 1). Так, флуоресцентные конъюгаты МКАТ 3 клонов (ICO31, ICO86 и ICO160) были получены самым грубым методом очистки — с помощью КК, 2 — 1С090 и 1С0180 — на белке А, 1С0150 — подвергнут самой тщательной 3-ступенчатой очистке. Вместе с тем максимальное соотношение флуоресцеин/белок отмечалось именно для ICO 150.
Таким образом, проведенные исследования показали, что для 6 исследованных образцов МКАТ серии ICO, фракционированных тремя различными методами, окисление NaIO4 в диапазоне концентраций от 1 до 10 мМ в течение 30 мин при 25 °С, дальнейшее взаимодействие с Biotin-LC-Hydrazide и STREPT-FITC
приводит к образованию комплекса МКАТ-[спей-сер]-флуоресцеин с количеством флуоресцеиновых групп не менее 2 на молекулу МКАТ.
На следующем этапе было проведено исследование способности полученных комплексов МКАТ-[спейсер] -флуоресцеин взаимодействовать с лимфоцитами человека в прямой РИФ. Контрольными значениями служили данные о непрямой РИФ с натив-ными, немодифицированными МКАТ тех же клонов (табл. 3).
Как видно из табл. 3, все модифицированные МКАТ сохраняли специфичность связывания с клетками-мишенями, присущую нативным антителам. Примеры гистограмм распределения меченых клеток для двух МКАТ (ICO31 и ICO180) приведены на рис. 1 и 2.
Заключение
Таким образом, проведенные исследования показали принципиальную возможность использования олигосахаридной части молекулы иммуноглобулинов МКАТ серии ICO для приготовления флуоресцентных конъюгатов. Установлено, что степень включения флуоресцентной метки принципиально не зависит от метода фракционирования МКАТ. Определены оптимальные условия для проведения такого рода конъюгации. Данный метод может быть альтернативой для конъюгирования флуоресцентных меток с МКАТ, для которых методы белкового синтеза приводят к потере активности конъюгата.
таблица 3. Специфическое связывание комплекса МКАТ-[спейсер]-флуоресцеин с лимфоцитами человека в реакции иммунофлуоресценции
мКАт
Характеристика ICO 31 ICO 86 ICO 90 ICO 150 ICO 160 ICO 180
CD8 CD4 CD3 CD24 CD95 CD20
% выявляемых данных МКАТ клеток от контроля той же специфичности 97 49 95 100 95 102
Примечание. MKAT — монклональные антитела.
Краткие сообщения
47
Рис. 1. Гистограммы распределения клеток при взаимодействии Рис. 2. Гистограммы распределения клеток при взаимодействии
с МКАТ 1С031: а — неокрашенный контроль; б — непрямая РИФ с 1С031 в концентрации 5 мкг/мл, проявленная Fab»2-антимышиными
с МКАТ 1С0180: а — неокрашенный контроль; б — непрямая РИФ с 1С0180 в концентрации 5 мкг/мл, проявленная Fab»2-анти-
антителами, меченными FITC; в — прямая РИФ с комплексом 1С031- мышиными антителами, меченными FITC; в — прямая РИФ с ком-
[спейсер]-флуоресцеин в концентрации 10 мкг/мл
плексом 1С0180-[спейсер]-флуоресцеин в концентрации 5 мкг/мл
а
а
б
б
в
в
48 Краткие сообщения
ЛИТЕРА
1. Buchowicz I., Zakrzewski K. Carbohydrate oxidation and antibody function in equine anti-diphtheria immunoglobulin T. Immunochemistry 1975;12:795-800. PMID: 173648.
2. Hage D.S., Wolfe C.A., Oates M.R. Development of a Kinetic Model
To Describe the Effective Rate of Antibody Oxidation by Periodate. Bioconjugate Chem 1997;8(6):914-20.
DOI: 10.1021/bc970112o. PMID: 9404666.
3. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2013.
4. Ey P.L., Prowse S.J., Jenkin C.R. Isolation of pure IgG1, IgG2a, and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using
ТУРА / R E F
protein A-sepharose. Immunochemistry 1978;15(7):429-36. PMID: 30693.
5. Голубцова Н.В., Бурова О.С., Барышников К.А. и др. Моноклональ-ные антитела ICO-406 против антигена CD117. Российский онкологический журнал 2015;2:99-104.
6. Temponi M., Kageshita T., Perosa F. et al. Purification of murine IgG monoclonal antibodies by precipitation with caprylic acid: comparison with other methods
of purification. Hybridoma 1989;8:85-95. DOI: 10.1089/hyb.1989.8.85. PMID: 2784406.
7. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly
R E N C E S
of the Head of Bacteriophage T4. Nature 1970;227(5259):680-5. PMID: 5432063.
8. Толчева Е.В., Барышников А.Ю., Оборотова Н.А. и др. Анти-от5-иммуно-липосомы как транспортная система для направленной доставки лекарственных препаратов к от5+-клеткам. Российский биотерапевтический журнал 2005;4:38-43.
9. Murata M., Kawamura A.Jr. Effect of molar ratio of fluorescent dye to IgG on the detection of lymphocyte surface immunoglobulins by immunofluorescence. Microbiol Immunol. 1980;24(1):65-78. PMID: 6767174.
