CC BY
127
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ЗОНДЫ... 27
УДК 543.426:57.083.34:57.086
Е.Н. Захарова, П.К. Иванов, Т.Н. Заботина, Н.В. Голубцова,
М.Н. Краева, И.В. Чинарева, А. С. Гриневич, Д.Ю. Блохин
ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ЗОНДЫ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ICO-31 И ЦИАНИНОВОГО КРАСИТЕЛЯ IMD-506
ДЛЯ АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Захарова Елена Николаевна, научный сотрудник лаборатории медицинской биотехнологии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; тел: +7(499)612-96-16 e-mail: [email protected]
Статья поступила 28.10.2013, принята к печати 01.11.2013.
Резюме
Нами была разработана методика получения конъюгатов моноклональных антител ICO-31 с цианиновым красителем Imd-506. Данная методика не меняет иммунологические свойства антител в составе иммунофлуо-ресцентного конъюгата. Оптимальная ПМ* для конъюгата IC0-31/Imd-506 находится в диапазоне 3,5-5,0, при этом максимальное соотношение «сигнал-шум» соответствует концентрации антител 5-25 мкг/мл, что позволяет эффективно использовать полученные конъюгаты для специфического выявления CD8+ клеток методом проточной цитометрии.
Ключевые слова: моноклональные антитела, проточная цитометрия, флуоресцентные красители.
E.N. Zakharova, P.K. Ivanov, T.N. Zabotina, N. V. Golubtsova,
M.N. Kraeva, I.V. Chinareva, A.S. Grinevich, D.Y.Blokhin
FLUORESCENCE IMMUNOASSAY PROBES BASED ON MONOCLONAL ANTIBODIES ICO-31 AND CIANINE DYE IMD-506
TO ANALYZE CELL POPULATIONS BY FLOW CYTOMETRY
FSBI« N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
This work was developed monoclonal antibody conjugates ITO-31 with cianine dye Imd-506. This method of conjugating ICO-31 fluorophor does not change the immunological properties of antibody conjugate. The optimal density" of tags for conjugate IC0-31/Imd-506 range is 3.5 -5.0, with a maximum signal-to-noise ratio corresponds to the concentration of antibodies 5-25 ^g/ml, which allows you to efficiently use the conjugates for specific detection of CD8-positive cells by flow cytometry.
Key words: monoclonal antibody, flow cytometry, fluorescent dye.
Введение
Метод проточной цитометрии широко используется в клинической практике и научноисследовательской работе в области медицины и биологии для многофакторного анализа состава и свойств клеточных популяций. Метод основан на комплексном анализе оптических свойств отдельных клеток, взвешенных в растворе: измеряются показатели прямого и бокового светорассеивания при пересечении лазерного луча движущейся в потоке жидкости клеткой, а также интенсивность возбуждаемого этим лучом вторичного светового излучения (флуоресценции) в разных спектральных диапазонах. Кроме аутофлуоресценции, которой обладают все биологические объекты, флуоресцентный сигнал исходит от специальных зондов, соединенных с поверхностью клетки или окрашивающих ее внутренние структуры в процессе предварительной подготовки образцов к анализу. Соответственно, возможности метода прямо зависят от разнообразия и свойств применяемых флуоресцентных зондов, подавляющее большинство которых получают конъю-
* D - оптическая плотность; ПМ - плотность метки
P
гированием специфических для анализируемых молекул лигандов, в том числе - моноклональных антител к поверхностным и внутриклеточным антигенам, с флуоресцентными молекулами-метками (флуорофорами).
Несмотря на огромное количество способных к флуоресценции веществ, список пригодных для проточной цитометрии флуорофоров резко ограничен жесткими требованиями к их физикохимическим и биохимическим свойствам:
■ спектры возбуждения и эмиссии таких веществ должны совпадать с оптическими диапазонами, предусмотренными для этого в конструкции цитометра;
■ их конъюгирование с биоактивными лигандами не должно изменять их собственных оптических характеристик, а также специфичности лиганда.
■ Желательным, хотя и не обязательным, свойством таких молекул должна быть их способность к необратимому (чаще всего - ковалентному) связыванию с молекулой лиганда.
Традиционно в качестве флуорофоров для получения зондов используют низкомолекулярный флуоресцеин (в виде изотиоцианатного производ-
ного - Р1ТС), цианиновые красители Су3 и Су5 (в виде моно- и дисукцинимидных эфиров), а также флуоресцентные растительные белки РЕ и АРС.
Цианиновым флуорофорам свойствен высокий квантовый выход флуоресценции и устойчивость к «выгоранию», присущая флуоресцеину, что позволяет получать на их основе стабильные зонды с надежно регистрируемым сигналом флуоресценции [4; 7; 9]. Это семейство выглядело бы весьма перспективным для использования в проточной цитометрии, однако спектры возбуждения и эмиссии этих веществ достаточно узки, и любая химическая модификация их молекулы параллельно смещает как максимум эмиссии, так и максимум возбуждения флуоресценции. В результате модифицированное производное перестает флуоресцировать под монохроматическим лучом лазера, что ограничивает число возможных вариантов подобных модификаций. Разнообразия оптических характеристик удается достичь за счет применения так называемых «тандемных» флуорофоров -конъюгатов фикобилипротеина в качестве первичного акцептора излучения с цианиновыми производными в качестве вторичного эмиттера. В таких конструкциях смещение спектра возбуждения циа-нинового производного уже не играет существенной роли, а смещение спектра эмиссии расширяет список пригодных флуорофоров [5; 8].
В России синтезирована группа оригинальных цианиновых флуорофоров, сходных по физикохимическим свойствам с Су3, в частности - соединение 1ш^306, а также краситель 1ш^506, спектральный аналог Су5. 1ш^306 возбуждается лучом аргонового лазера (Х=488 нм), а 1ш^506 - диодного (Х= 635 нм), что делает последний потенциально пригодным не только для прямого конъюгирования с биоактивным лигандом и последующего использования полученных зондов в двулазерных проточных цитометрах, но и для создания «тандемных» меток. Ранее 1ш^506 в качестве флуорофора для проточной цитометрии не изучался.
В качестве специфических лигандов нами использована панель МКА к поверхностным антигенам лейкоцитов человека, полученная в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН под руководством проф. А.Ю. Барышникова и проф. З.Г. Кадагидзе (МкА серии 1СО) [1-3]. Эти МКА достаточно охарактеризованы и более 20 лет используются в проточной цитометрии как в реакциях непрямой, так и прямой флуоресценции (в виде конъюгатов с Р1ТС или РЕ).
Цель работы: разработать технологию конъю-гирования МКА серии 1СО с активной флуоресцентной меткой 1ш^506 и определить пригодность получаемых зондов для анализа субпопуляций лимфоцитов человека методом проточной цитометрии.
Материалы и методы
Биологический материал
В качестве исследуемого биологического материала использовали образцы периферической крови практически здоровых доноров. Кровь забирали из локтевой вены натощак, в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА.
Флуоресцентные красители
Цианиновый краситель 1ш^506-8и-натриевая соль (производство ИМБ им. Энгельгардта РАН, Россия) готов для мечения молекул, содержащих аминогруппы. Характеристики использованного флуорофора: ММ 803,9 Да; максимум оптического поглощения
его водного раствора - 644 нм; максимум эмиссии флуоресценции - 659 нм; содержание активного компонента в виде моносукцинимидного эфира - 80-85 %; содержание нереакционноспособной кислоты Imd-506-C00H - 15-20 %.
Для Cy5, как и для Imd-506, оптимальными источниками возбуждения флуоресценции являются HeNe-лазер, Kr-лазер с %. соответственно 633 и 647 нм, а также лазерные диоды с длиной волны около 635-650 нм [4].
Моноклональные антитела
В качестве специфичного лиганда в работе использовали МКА к поверхностному антигену CD8 Т-лимфоцитов человека (клон ICO-31) производства ООО «НПЦ «МедБиоСпектр» (Россия).
Эталонный реагент - препарат сравнения
В качестве эталонного реагента использовали коммерческие конъюгаты МКА a-CD8/FITC производства компании BD Bioscience, США.
Реактивы
Фосфатно-солевой буфер (ООО «ПанЭко», Россия) готовили по инструкции производителя, pH готового раствора составляет 7,4.
Азид натрия (Sigma, США): 10 %-ный водный раствор.
Лизирующий раствор FACS Lysing Solution (BD Biosciences, США)
Сорбент Сефадекс - SephadexTM G-25 Superfine - (Amersham Biosciences, Швеция).
Получение асцитной жидкости
МКА выделяли из асцитной жидкости мышей BALB/c с инокулированными внутрибрюшин-но клетками гибридомы клона ICO-31. За 3-10 дней до инокуляции клеток гибридомы мышам внутри-брюшинно вводили 0,5 мл вазелинового масла или 3 % пептона на вазелиновом масле для индукции роста гибридомы в асцитной форме. 107 клеток гибридомы вводили мышам внутрибрюшинно и через 7-8 дней собирали асцитную жидкость, осаждали клетки центрифугированием в течение 20 мин при 300 g и температуре +4 °С. Супернатант, содержащий МКА, хранили при -50°С.
Выделение и очистка антител
МКА выделяли путем комбинированной очистки с использованием каприловой кислоты и высаливания иммуноглобулиновой фракции сульфатом аммония.
Для этого точно измеренный объем асцитной жидкости разводили в 5 раз 0,06 М ацетатным буфером (рН 4,0), центрифугировали при ускорении 350 g, 10 мин. К надосадочной жидкости медленно, по капле, добавляли каприловую кислоту из расчета 25 мкл на каждый 1 мл супернатанта и инкубировали при постоянном встряхивании 30 мин. Смесь центрифугировали 30 мин при ускорении 350 g и температуре +4С. Затем супернатант фильтровали, доводили рН до 7,4 и охлаждали в течение 30 мин в холодильной камере при +6 °С.
К охлажденному супернатанту добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, смесь перемешивали и инкубировали в течение 1 ч. Осадок, полученный после центрифугирования смеси (350 g, 10 мин), растворяли и переводили в фосфатно-солевой буфер (рН 7,4) гель-фильтрацией на хроматографической колонке Сефа-декс G-25.
Определение концентрации белка
Спектрофотометрический метод количественного определения концентрации белка в водном растворе основан на способности ароматических аминокислот (триптофан и тирозин) поглощать свет с длиной волны 280 нм. В зависимости от содержания этих аминокислот различные индивидуальные белки имеют разные коэффициенты молярной экстинкции при Х=280 нм. Аминокислотный состав различных по специфичности иммуноглобулинов мыши (изотипа IgG) примерно одинаков, вследствие чего принято считать, что концентрации IgG в растворе, равной 1 мг/мл, соответствует величина оптической плотности 1,4 ОЕ (при Х=280 нм и толщине слоя 1 см). Таким образом, концентрацию белка QgG рассчитывали по формуле:
C — ОП280
CIgG 1,4
Прямая реакция иммунофлуоресценции
Прямая РИФ использовалась для оценки пригодности (специфической активности) конъюгатов МКА с флуорофором Imd-506 (флуоресцентных зондов), полученных по изложенной в 1-ой части раздела «результаты» настоящей статьи технологии, для анализа клеточных популяций лимфоцитов человека методом проточной цитометрии. Для постановки прямой РИФ к образцам периферической крови здоровых доноров (100 мкл) добавляли раствор одного из конъюгатов в дробно-понижающихся количествах - диапазон конечных концентраций МКА от 100 до 0,1 мкг/мл («титрование» раствора зондов), инкубировали образцы в течение 20 мин при 18-25 °С в темноте. Эритроциты разрушали последующим осмотическим гемолизом в растворе FACS Lysing Solution (BD Bioscience, США). Не связавшийся с лейкоцитами избыток зондов удаляли двукратной отмывкой клеточного осадка центрифугированием/ресуспендированием в фосфатносолевом буфере (pH 7,4). Отмытые клетки суспендировали в 0,5 мл того же буфера с добавлением к нему раствора формальдегида до конечной концентрации последнего 0,4%.
Проточная цитометрия клеточных суспензий
В работе использован проточный двулучевой цитометр FACSCalibur (BD Bioscience, США) с программным пакетом CellQuest. Возбуждение флуоресценции происходило при прохождении клеткой фокального пятна аргонового (для FITC) и красного диодного (для Imd-506) лазеров (мощность 15 mW, длина волны 488 нм и 635 нм соответственно). Флуоресценцию учитывали в спектральных диапазонах 512-547 нм (FL1 для FITC) и >610 нм (FL4 для Imd-506). Для анализа клеточных популяций учитывали также показатели прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеи-вания, на основании которых выполняли гейтиро-вание - программное «выделение» субпопуляции лимфоцитов и дискриминацию иных субпопуляций. В каждом образце анализировали 5000 событий в гейте лимфоцитов. Обработку файлов первичных цитометричес-ких данных проводили с использованием программного пакета WinMDI2.8, находящегося в свободном доступе в сети Интернет.
Результаты
1. Получение конъюгатов МКА
с цианиновыми красителями Imd-506
Сукцинимидные эфиры (в данном случае флуорофора 1ш^506) связываются с молекулами пептидов и белков по первичным (менее эффективно - по вторичным) аминогруппам последних, в основном - по є-аминогруппам лизина или по N концевым а-аминогруппам. Ковалентная связь образуется в результате реакции ацилирования аминогрупп. Поскольку конъюгирование белков с флуорофорами происходит в водных растворах, то параллельно с реакцией ацилирования происходит спонтанный гидролиз сукцинимидных эфиров с образованием неактивных продуктов, не пригодных для ковалентного мечения белков (происходит необратимая потеря реагента). Скорости обеих реакций значительно возрастают при защелачивании реакционной смеси, которое, однако, имеет определенный предел, связанный с устойчивостью белков к таким воздействиям. Большинство иммуноглобулинов сохраняет корректную конформацию белковых молекул в водных растворах при значениях рН до 9,3-9,5.
Для получения конъюгатов МКА с красителем 1ш^506 подбирали оптимальные условия проведения реакции. Для этого к раствору белка (1 мг/мл) в бикарбонатном буфере рН 9,3 добавляли водный раствор моносукцинимидного эфира флуо-рофора 1ш^506 в молярном соотношении 10 : 1 ПМ, смесь перемешивали, делили на четыре фракции (I - IV) и инкубировали каждую фракцию по следующей схеме:
I - 30 мин, +18-25 °С;
II - 6 ч, +18-25 °С;
III - 6 ч, +2-8 °С;
IV - 24 ч, +2-8 °С.
По окончании времени инкубации реакционную смесь переносили на колонку 8ер1іа<ех в-25, уравновешенную фосфатно-солевым буфером рН 7,4, для отделения белковых конъюгатов от несвя-завшегося флуорофора. Далее проводили спектрофотометрический анализ полученных конъюгатов при двух длинах волн, соответствующих максимумам оптической плотности белка (Х=280 нм) и красителя (Х=644 нм), и рассчитывали плотность метки - количество молекул флуорофора, связавшихся с одной молекулой иммуноглобулина ПМ, исходя из коэффициентов молярной экстинкции (є) флуоро-фора и иммуноглобулина при этих длинах волн (є ^<^<5=129000 М-1см-1; є ^=224000 М-1см-1), по формуле:
D = 1,7 X ОП644 , где
P [°° 280 -(0,04 Х ОП644)]
ОП280 и ОП644 - величина оптической плотности раствора конъюгата при X 280 и 644 нм соответственно, коэффициент 1,7 - величина отношения коэффициентов молярной экстинкции белка и красителя, а поправочный коэффициент 0,04 отражает тот факт, что при X 280 нм поглощение водного раствора флуорофора !тіі-506 составляет около 4% от его поглощения при X 644 нм. Результаты представлены в табл.
Полученные флуоресцентные зонды использовали для специфического окрашивания СБ8+ лимфоцитов периферической крови человека (донор А.). Результаты цитометрического анализа представлены на рис. 1 - видно, что конъюгаты, полученные всеми четырьмя способами, выявляют одинаковое количество антигенпозитивных клеток в широком диапазоне концентраций зондов: от 0,1 до 5,0 мкг/мл.
Таким образом, при всех использованных вариантах инкубирования реакционной смеси результаты реакции оказались достаточно сходными: с белком связывается третья часть использованного красителя, иммуноглобулин в составе конъюгатов сохраняет свою биологическую активность и специфичность. Этот результат достигается уже в течение 30 мин инкубации при +18-25 °С. Увеличение времени реакции или изменение температуры реакционной смеси не оказывают влияния на результат конъюгирования. Очевидно, что при указанных условиях происходит полное исчерпание активной формы флуорофора в реакционной среде. В дальнейших исследованиях использовали именно такой режим конъюгирования: реакцию вели в течение 30 мин при +18-25 °С.
По такой технологии, изменяя лишь молярное соотношение внесенного в раствор белка флуо-рофора, были получены конъюгаты с ПМ от 2,5 до
8, которые исследовались далее на предмет их специфической активности и пригодности для цито-метрического анализа в прямой РИФ.
2. Изучение специфической активности конъюгатов МКА с цианиновым флуо-рофором !шй-506
Для получения корректных и воспроизводимых результатов количественного анализа клеточных популяций в прямой РИФ важным обстоятельством является использование в таких исследованиях валидированных аналитических реагентов, в данном случае - флуоресцентных зондов, каковыми являются конъюгаты МКА с флуорофорами. В частности, в зависимости от природы и уровня экспрессии на клеточной поверхности анализируемого антигена, аффинности и авидности использованных для получения конъюгатов МКА, плотности метки белковой молекулы и физико-химических свойств использованного флуорофора, требуют эмпирической оптимизации по крайней мере два параметра:
1) оптимальная ПМ молекулы МКА;
2) рабочая концентрация раствора зонда, используемого в прямой РИФ.
1. Оптимальная плотность метки должна обеспечивать достаточную интенсивность флуоресцентного сигнала, получаемого от каждой молекулы зонда. Известно, что для цианиновых флуорофоров не существует прямой зависимости интенсивности флуоресценции от количества молекул красителя, связанных с одной молекулой лиганда. Так, оптимальная флуоресценция наблюдается при связывании 6-8 молекул красителей Су3 и Су3.5, 4-5 молекул флуорофора Су5.5 и лишь 2-3 молекул Су 5 на одну молекулу иммуноглобулина [6]. Конъюгация в высоких молярных соотношениях метки к белку может приводить к снижению флуоресценции, вероятно, вследствие взаимодействия метки с меткой с последующей миграцией энергии или формирования агрегатов. Тушение флуоресценции конъюгатов цианино-вых красителей ограничивает их использование [6]. Кроме того, избыточная химическая модификация белковой молекулы увеличивает вероятность изменения конформации белка со снижением, а то и полной утратой им своей специфической активности, например, при модификации антигенсвязывающих областей молекулы иммуноглобулина.
2. Оптимальная концентрация зондов в прямой РИФ должна обеспечивать насыщение зондом всех молекул исследуемого антигена на поверхности клеток, но не приводить к заметному неспецифическому связыванию зонда с клеточной поверхно-
стью. Для определения рабочего разведения полученных конъюгатов с плотностью метки от 2,5 до 8 молекул красителя Imd-506 на одну молекулу иммуноглобулина ICO-31, использовали методику титрования антител, предложенную Stewart C.C. [10]. Методика основана на дробном понижении концентрации зондов в прямой РИФ с определением их минимальной концентрации, при которой еще сохраняется максимальная интенсивность флуоресценции антигенпози-тивных клеток. Дальнейшее понижение концентрации зондов приводит к смещению антигенпозитивного пика на гистограмме влево и уменьшению соотношения «сигнал»/«шум» (S/N). Изучали выявляемость различными конъюгатами антиген+ событий в одном и том же образце периферической крови (%) и отношение интенсивности специфического сигнала флуоресценции антиген+ клеток к «шуму» (S/N) аутофлуоресценции. Результаты представлены на рис. 2 - наибольшие значения отношения S/N характерны для конъюгатов с ПМ в диапазоне 3,5-5,0.
Далее, используя конъюгат ICO-31/Imd-506 с плотностью метки ПМ=5, определили диапазон рабочих концентраций этого зонда и адекватность получаемых результатов результатам цитометрическо-го анализа того же образца крови с использованием эталонного реагента - коммерческого продукта МКА a-CD8/FITC производства компании BD Bioscience, США. На рис. 3 представлены гистограммы распределения популяции лимфоцитов периферической крови донора с использованием ICO-31/Imd-506 в диапазоне концентраций 0,5-100 мкг/мл.
Видно, что снижение концентрации зонда ниже 5 мкг/мл приводит к смещению пика специфической флуоресценции (на гистограммах он справа) влево, следовательно концентрация 5 мкг/мл является минимально допустимой для выполнения цитометрического анализа клеточных популяций. При концентрациях зонда в диапазоне 2,5-25 мкг/мл (рис. 4) в составе лимфоцитов перифе+рической крови донора Д. выявляется около 25 % CD8 клеток, однако при концентрации зонда 2,5 мкг/мл величина соотношения S/N снижается.
Цитометрический анализ лимфоцитов того же донора, выполненный с использованием эталонного реагента (МКА a-CD8/FITC производства BD Biosciences, США), выявил такое же содержание антигенпозитивных клеток в образце (рис. 5), что говорит об адекватности применения для цитомет-рического анализа полученных нами иммунофлуо-ресцентных конъюгатов ICO-31/Imd-506.
Заключение
Для конъюгирования МКА ICO-31 с флуорофо-ром Imd-506 достаточно применение простых методов выделения и очистки иммуноглобулинов: использование каприловой кислоты, осаждение сульфатом аммония. Оптимальными условиями для мечения МКА ICO-31 красителем Imd-506 являются: концентрация антител в бикарбонатном буфере с рН 9,3 - 1 мг/мл, время инкубации - 30 минут, температура - +18-25 “С, выделение образовавшегося конъюгата гель-хроматографией на колонке с Sephadex G-25. Данная методика конъюгирования МКА с флуорофором не меняет иммунологические свойства антител в составе иммунофлуоресцентного конъюгата. Оптимальная ПМ для конъюгата ICO-31/Imd-506 находится в диапазоне 3,5-5,0, при этом максимальное соотношение «сигнал-шум» соответствует концентрации антител 5-25 мкг/мл, что позволяет эффективно использовать полученные конъюгаты для специфического выявления CD8+ клеток методом проточной цитометрии.
Таблица
Результаты спектрофотометрического анализа конъюгатов МКА с 1ш^506, полученных при разных условиях связывания
Номер образца* ОП280 ОП644 ПМ
I (30 мин., +18-25°С) 0,372 0,635 3,1
II (6 ч., +18-25 °С) 0,355 0,651 3,4
III (6 ч., +2-8 °С) 0,380 0,672 3,2
IV (24 ч., +2-8 °С) 0,345 0,662 3,5
*условия инкубирования
Рис. 1. Конъюгаты МКА Ю0-31Лт^506, выделенные из 1-1У фракций реакционной смеси, выявляют одинаковое количество антигенпозитивных клеток в широком диапазоне концентраций зондов.
Рис.2. Зависимость отношения интенсивности специфического сигнала к «шуму» (Б/Ы) от концентрации а-СБ8Лт^506 с различной ПМ.
Рис. 3. Анализ лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата 1С0-31/1т^506 с ПМ=5 в диапазоне концентраций 0,5-100 мкг/мл.
32 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ЗОНДЫ...
S/N 157.4 SW 166.4
S/N14'4
S/N US 5
Рис. 4. Анализ лимфоцитов периферической крови донора Д. с использованием ГС0-31Лт^506 с ПМ=5 в диапазоне концентраций 2,5-25 мкг/мл.
Рис. 5. Анализ лимфоцитов периферической крови донора Д. с использованием эталонного реагента МКА CD8/FITC (BD Bioscience, США).
CD8 FITC
Литература
1. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. - М.: Медицина, 1997. - 212 с.
2. Иванов П.К. Терапевтические моноклональные антитела в онкологии: Автореф. дис... д-ра мед. наук. - М., 2001. - 44 с.
3. Кадагидзе З.Г., Заботина Т.Н., Короткова О.В. Современные возможности использования иммунологических показателей при иммунотерапии онкологических больных // Вестник. Рос. онкол. науч. центра им Н.Н. Блохина. - 1996. - № 1. - С. 50-5.
4. Ernst L.A., Gupta R.K., Mujumdar R.B., Waggoner A.S. Cyanine dye labeling reagents for sulfhydryl groups // Cytometry. - 1989. - 10(1). - P. 3-10.
5. Glazer A.N., Stryer L. Fluorescent tandem phycobiliprotein conjugates: emission wavelength shifting by energy transfer // Biophys. J. - 1983. - 43. - P. 383-6.
6. Gruber H.J., Hahn C.D., Kada G. et al. Anomalous fluorescence enhancement of Cy3 and Cy3.5 versus anomalous fluorescence loss of Cy5 and Cy7 upon covalent linking to IgG and noncovalent binding to avidin // Bioconjug. Chem. - 2002. - 11. - P. 696-704.
7. Mujumdar R.B., Ernst L.A., Mujumdar S.R. et al. Cyanine dye labeling reagents: sulfoindocyanine succinimidyl esters // Bioconj. Chem. - 1993. - 4. - P. 105-11.
8. Roederer M., Kantor A.B., Parks D.R., Herzenberg L.A. Cy7PE and Cy7APC: bright new probes for immunofluorescence // Cytometry. - 1996. - 1(24). - P. 191-7.
9. Sowell J., Strekowski L., Patonay G. DNA and protein applications of near-infrared dyes // J Biomed Opt. - 2002. -7. - P. 571-5.
10. Stewart C.C, Stewart S.J. Titering Antibodies // Current Protocols in Cytometry, (J.P.Robinson, Z. Darzynkiewicz, P. Dean. L. Dressler, P.Rabinovitch, C. Stewart, H. Tanke, L. Wheeless, eds.) J.Wiley & Sons, Inc., New York, 4.1.1 - 4.1.13, 1997.
