CC BY
14
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Интерферон-регулирующая активность противовирусного лекарственного средства целагрип и его влияние на экспрессию генов врожденного иммунитета и образование активных форм кислорода у больных фолликулярной лимфомой
Наровлянский А.Н.1, Полосков В.В.1, Иванова А.М.1, Кравченко С.К.2, Бабаева Ф.Э.2, Сычевская К.А.2, Мезенцева М.В.1, Суетина И.А.1, Руссу Л.И.1, Изместьева А.В.1, Оспельникова Т.П.1, Сарымсаков А.А.3, Ершов Ф.И.1
1ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия;
2ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, 125167, Москва, Россия; 3Институт химии и физики полимеров Академии наук Республики Узбекистан, 100128, Ташкент, Узбекистан
Введение. Лекарственные средства из группы индукторов интерферона (IFN) «включают» синтез интер-феронов 1-го типа (IFN-I) и индуцируют экспрессию IFN-стимулированных генов (ISG), которые регулируют реакции врожденного иммунитета и защищают хозяина от инфекционных агентов и опухолевой патологии. Цель исследования - определить роль лекарственного средства (ЛС) целагрип (ЦА) в активации генов врожденного иммунитета и влиянии на продукцию активных форм кислорода у больных фолликулярной лимфомой (ФЛ). Задачи: изучить интенсивность продукции активных форм кислорода (АФК) и уровень экспрессии генов IFN-a2, IFN-Ä1, ISG15, BCL2, Р53(ТР53) и USP18 в ответ на обработку ЦА клеток крови больных ФЛ.
Материал и методы. В исследовании участвовали первичные онкологические пациенты с диагнозом ФЛ и здоровые добровольцы, у которых выполнен кинетический анализ динамики продукции АФК клетками крови и определена экспрессия группы генов методом полимеразной цепной реакции в реальном времени в ответ на обработку ЦА.
Результаты и обсуждение. Выявлено статистически достоверное снижение продукции АФК клетками крови больных ФЛ и здоровых добровольцев в присутствии ЦА (P < 0,05). Кратность стимуляции генов ISG15, Р53(ТР53) и USP18 в группе больных ФЛ значительно превышала таковую в группе здоровых добровольцев. При обработке ЦА клеток крови становится возможным разделить больных ФЛ на группы с положительным и отрицательным ответом в соответствии с уровнем экспрессии гена USP18. Выводы. ЦА снижает продукцию АФК и одновременно стимулирует активность генов врожденного иммунитета ISG15, Р53(ТР53) и USP18 в клетках крови больных ФЛ.
Ключевые слова: индуктор интерферона; фолликулярная лимфома; активные формы кислорода; экспрессия генов; интерферон-стимулированные гены. Для цитирования: Наровлянский А.Н., Полосков В.В., Иванова А.М., Кравченко С.К., Бабаева Ф.Э., Сычевская К.А., Мезенцева М.В., Суетина И.А., Руссу Л.И., Изместьева А.В., Оспельникова Т.П., Сарымсаков А.А., Ершов Ф.И. Интерферон-регулирующая активность противовирусного лекарственного средства целагрип и его влияние на экспрессию генов врожденного иммунитета и образование активных форм кислорода у больных фолликулярной лимфомой. Вопросы вирусологии. 2020; 65(5): 284-293. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-5-5
Для корреспонденции: Наровлянский Александр Наумович, д-р биол. наук, проф., глав. науч. сотр. ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва. E-mail: [email protected]
Участие авторов: Наровлянский А.Н., Ершов Ф.И., Кравченко С.К., Иванова А.М., Сарымсаков А.А. - формулировка идеи, цели, задач, анализ литературы и экспериментальных данных, обсуждение, написание и оформление; Кравченко С.К., Бабаева Ф.Э., Сычевская К.А. - осуществление клинической части исследований; Полосков В.В., Иванова А.М., Мезенцева М.В., Оспельникова Т.П., Руссу Л.И., Изместьева А.В., Суетина И.А. - экспериментальная работа, статистическая обработка, оформление.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований по проекту (гранту) № 18-515-41001/19.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Поступила 28.08.2020 Принята в печать 01.09.2020
ORIGINAL RESEARCH
Interferon-regulating activity of the celagrip antiviral drug and its influence on formation of reactive oxygen species and expression of innate immunity genes in the follicular lymphoma patients
Alexander N. Narovlyansky1, Vladislav V. Poloskov1, Alla M. Ivanova1, Sergej K. Kravchenko2, Fatima E. Babayeva2, Kseniya A. Sychevskaya2, Marina V. Mezentseva1, Irina A. Suetina1, Leonid I. Russu1, Anna V. Izmest'eva1, Tatiana P. Ospelnikova1, Abdushukur A. Sarymsakov3, Feliks I. Ershov1
1National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya, Moscow, 123098, Russia;
2National Research Center for Hematology, Moscow, 125167, Russia; institute of Polymer Chemistry and Physics, Tashkent, 100128, Uzbekistan
Introduction. Medicines from the group of interferon inducers (IFNs) "swith on" the synthesis of type 1 interferons (IFN-I) and induce the expression of IFN-stimulated genes (ISGs) that regulate innate immunity reactions and protect the host from infectious agents and the tumour pathology.
The purpose of the study was to determine the role of the drug celagrip (CA) in the activation of innate immunity genes and the effect on the production of reactive oxygen species (ROS) in patients with follicular lymphoma (FL). Objectives: to study the intensity of ROS production and the level of expression of the IFN-a2, IFN-A1, ISG15, BCL2, P53(TP53) and USP18 genes in response to the treatment of blood cells of patients with FL with the preparation of CA. Material and methods. The study involved primary cancer patients diagnosed with follicular lymphoma (FL) and healthy volunteers. A kinetic analysis of the dynamics of production of reactive oxygen species (ROS) was performed in whose blood cells, and the expression of the group of genes was determined by real-time PCR in response to CA processing.
Results and discussion. ROS production by blood cells of patients with FL and volunteers in the presence of CA significantly decreased (P < 0.05). The level of gene expression of ISG15, P53(TR53) and USP 18 in the group of patients with FL was significantly higher than that in the group of volunteers. When treating blood cells with CA, it becomes possible to divide patients with FL into groups with a positive and negative response in accordance with the level of expression of the USP18 gene. We divided FL patients into groups with a positive and negative response in accordance with the level of USP18 gene expression after treatment of blood cells with CA. Conclusions. The CA drug reduces the production of ROS and simultaneously stimulates the activity of the innate immunity genes ISG15, P53(TP53) and USP18 in the blood cells of patients with FL.
Keywords: interferon inducer; follicular lymphoma, reactive oxygen species; gene expression; interferon-stimu-lated genes.
For citation: Narovlyansky A.N., Poloskov V.V., Ivanova A.M., Kravchenko S.K., Sychevskaya K.A., Babaeva F.E., Mezentseva M.V., Suetina I.A., Russu L.I., Izmest'eva A.V., Ospelnikova T.P., Sarymsakov A.A., Ershov F.I. In-terferon-regulating activity of the celagrip antiviral drug and its influence on formation of reactive oxygen species and expression of innate immunity genes in the follicular lymphoma patients. Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2020; 65(5): 284-293. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-5-5 For correspondence: Alexander N. Narovlyansky, DBS, Chief Researcher of the Cytokine Laboratory, National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya, Moscow, 123098, Russia. E-mail: [email protected] Information about the authors:
Narovlyansky A.N., http://orcid.org/0000-0003-0601-7148 Poloskov V.V., http://orcid.org/0000-0003-0001-2493 Ivanova A.M., http://orcid.org/0000-0002-6008-7967 Kravchenko S.K., https://orcid.org/0000-0002-7721-2074 Sychevskaya K.A., https://orcid.org/0000-0001-8053-9724 Babaeva F.E., https://orcid.org/0000-0002-5404-9024 Mezentseva M.V., http://orcid.org/0000-0001-7346-5536 Suetina I.A., http://orcid.org/0000-0003-2878-0590 Russu L.I., http://orcid.org/0000-0001-6353-9917 Izmest'eva A.V., http://orcid.org/0000-0002-0035-324X Ospelnikova T.P., http://orcid.org/0000-0002-1580-6096 Sarymsakov A.A., http://orcid.org/0000-0003-4562-7280 Ershov F.I. http://orcid.org/0000-0002-4780-7560
Contribution: Narovlyansky A.N., Ershov F.I., Kravchenko S.K., Ivanova A.M., Sarymsakov A.A. - formulation of ideas, goals, objectives, analysis of literature and experimental data, discussion, writing and design; Kravchenko S.K., Babayeva F.E., Sychevskaya K.A. - implementation of the clinical part of research; Poloskov V.V., Ivanova A.M., Mezentseva M.V., Ospelnikova T.P., Russu L.I., Izmest'eva A.V., Suetina I.A. - experimental work, computer data processing, design. Acknowledgments. This work was financially supported by the Russian Foundation for Basic Research for the project (grant) No. 18-515-41001/19.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 28 August 2020 Accepted 01 September 2020
Введение
Лекарственные средства (ЛС) из группы индукторов интерферона (ШК) «включают» синтез интер-феронов 1-го типа (№N-1) и вызывают экспрессию ШК-стимулированных генов (НО), которые регулируют реакции врожденного иммунитета и защищают хозяина от инфекционных агентов и опухолевой патологии [1-3].
Установлено, что стимулированный ШК продукт гена 15 (/5О15) представляет собой убиквитин-по-добный белок, который в процессе, называемом ISGylation, ковалентно связывается с целевыми белками через каскад ферментов. Кроме того, ISG15 существует в свободной форме как внутриклеточный и как секретируемый белок [4]. Большинство функций ISG15 и ISGylation связаны с ответом на патоген, а также с участием в ряде ключевых клеточных процессов: трансляции белка, реорганизации цито-скелета, секреции экзосом, аутофагии, поддержании стабильности генома и предупреждении развития злокачественных новообразований [5, 6]. С функционированием ISG15 тесно связана убиквитин-специ-фическая протеаза 18 (ШР18), которая противодействует ШвуМюп и к тому же является критическим отрицательным регулятором ШК-ответа [7]. ^Р18 индуцируется при окислительном стрессе и защищает клетки от оксидативного стресс-индуцированно-го апоптоза, по-видимому, через регулирование Р53 и каспазы 3 [8].
Активные формы кислорода (АФК) образуются в различных клеточных компартментах и играют важную роль в сигнальных путях. Избыточный уровень АФК приводит к развитию ряда патологий, в том числе злокачественных новообразований, сердечно-сосудистых, нейродегенеративных и метаболических нарушений. Окислительный стресс может способствовать возникновению опухоли, ее прогрессированию и сопротивлению терапии через повреждение ДНК, перепрограммирование клеточного метаболизма и передачу сигналов. Повышенная продукция АФК может также вызывать гибель опухолевых клеток [9].
Нами ранее было показано [10], что новое противовирусное ЛС целагрип [«celagrip» (ЦА)], которое разрешено Минздравом Республики Узбекистан (РУ) в качестве профилактического и лечебного средства при гриппе и ОРВИ [11], может регулировать экспрессию генов ряда цитокинов в клетках лимфомы Бёркитта (ЛБ) - №N-1, интерлейкинов (Щ)-1р, -6, -8 и -10. Также нами была обнаружена взаимосвязь ШК-индуцирующего действия ЦА с экспрессией гена /SG15 и продукцией АФК в перевиваемых культурах клеток ЛБ, продуцирующих и не продуцирующих антигены вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) [12]. Однако исследования в вышеуказанных работах были проведены только с использованием перевиваемых линий клеток. В настоящей работе изучено действие ШК-индуцирующего ЛС ЦА на экспрессию ряда генов врожденного иммунитета и продукцию АФК в клетках крови больных фолликулярной лимфомой (ФЛ).
Цель исследования - определить роль ЦА в активации генов врожденного иммунитета и влиянии на продукцию АФК у больных ФЛ. Задачи: изучить интенсивность продукции АФК и уровень экспрессии генов Ш-а2, Ш-Х1, Ш15, БС12, Р53(ТР53) и USP18 в ответ на обработку ЦА клеток крови больных ФЛ.
Материал и методы
В исследовании принимали участие 14 первичных онкологических пациентов 32-72 лет (4 мужчины и 10 женщин), ранее не получавших лечение. Диагноз: ФЛ 1-2 цитологических типов у 9 и 3А/Б -у 5 пациентов, с обширным вовлечением в патологический процесс различных лимфоузлов, костей, костного мозга.
Параллельно была сформирована группа сравнения относительно здоровых добровольцев без онкологических заболеваний, 3 мужчины и 2 женщины 18-24 лет. У всех здоровых добровольцев и больных изучили уровень спонтанной продукции АФК и продукцию АФК в присутствии ЦА при концентрациях в реакционной смеси 0,5 и 0,05 мг/мл, а также определяли уровень экспрессии генов IFN-a2, ^N-11, /SG15, BCL2, Р53(ТР53) и USP18.
Взятие крови: кровь больных ФЛ и здоровых добровольцев в стерильных условиях забирали из локтевой вены утром натощак в вакуумную пробирку (V = 5 мл) с гепарином натрия для хемилюминес-центного метода и с цитратом натрия для проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ). Все исследования выполняли в день забора крови.
Соблюдение этических стандартов. Всех пациентов обследовали после поступления в стационар согласно правовым аспектам оказания медицинской помощи с получением от них информированного письменного согласия. Больные проходили обследование и лечение в ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России в отделении интенсивной высокодозной химиотерапии гемобластозов с круглосуточным и дневным стационарами.
Препарат. ЦА является натриевой солью сополимера (1^-4)-6-0-карбоксиметил-Р^-глюкозы, (1^4)-р^-глюкозы, (2^24)2,3,14,15,21,24,29,32-ок-тагидрокси-23-(карбоксиметоксиметил)-7,10-ди-метил-4,13-ди(2-пропил)-19,22,26,30,31-пентаок-сагенацикло [23,3,2,21605,28091801217] дотриактон-та 1,3,5(28),6,6(27),9(18),10,12(17),13,15-декаена; препарат предоставлен Институтом химии и физики полимеров Академии наук Республики Узбекистан.
Определение уровня экспрессии генов Ш-Х1, Ш15, БСЬ2, Р53(ТР53) и USP18. Цельную кровь больных ФЛ (п = 14) и добровольцев (п = 5) разводили в 3 раза в среде RPMI-1640 с глютамином, содержащей 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота и антибиотики. Разведенную кровь разливали по 1,8 мл и добавляли по 200 мкл ЦА с расчётом получения конечных концентраций 0,5 и 0,05 мг/мл, в контрольный образец добавляли 200 мкл
ORIGINAL RESEARCH
среды RPMI-164Q. Пробы инкубировали в термостате в течение 2 ч. Затем образцы центрифугировали при 1QQQ об./мин 1Q мин. Осадки лизировали с помощью лизирующего буфера из набора «РНК-экстран» от компании «Синтол».
Олигонуклеотидные ПЦР-праймеры. Использовали готовые структуры олигонуклеотидных прайме-ров, ранее рассчитанные в программе Primer S Blast NCBI GB и апробированные к исследованным видам мРНК: Р53(ТР53) [1S], IFN-a2, BCL2 [14], IFN-X1, ISG15 [15], USF18 [16], глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназа (GAFDH) [17]. Синтез олигонуклеотидов осуществлён фирмой «Синтол» (Россия).
Выделение РНК. Суммарную РНК выделяли с помощью готового набора для выделения РНК «РНК-экс-тран» от компании «Синтол».
Реакция ОТ. Реакцию ставили с помощью готового набора для проведения ОТ компании «Синтол» с универсальным праймером random 6 согласно инструкции по применению. Полученные кДНК хранили при -7Q°Q
ОТ-ПЦР-РВ проводили на амплификаторе CFX-96, как описано ранее [12]. Обработка данных амплификации выполнена в программе CFX Manager Software Gene expression analysis (Bio-Rad, СШA) в автоматическом режиме. Определены стандартные отклонения величин Cq ± SD логарифмической фазы и изменения уровней в опытных пробах (ACq ± SD). Ген «домашнего хозяйства» GAFDH был использован как стабильный референс-нормализатор генной экспрессии. Изменения генной активности (2аAСq) оценивали относительно контроля (контрольного образца), принятого равным 1. Cпецифичность ДНК-продуктов устанавливали по Т-плавления.
Кинетический анализ динамики продукции АФК клетками крови у больных ФЛ и здоровых добровольцев проводили хемилюминесцентным методом [18] в присутствии люминола (конечное разведение в реакции 5,6*1Q~4 M). Постановку реакции проводили в 96-луночных планшетах в объеме 2QQ мкл/лунку. Б каждом постановочном варианте проводили не менее S повторов, из которых рассчитывали средний показатель. Оценку спонтанной и индуцированной ЦA хемилюминесценции осуществляли в течение 9Q мин при температуре 37°С на приборе Synergy H1 (BioTek, USA). При измерении учитывали максимальные показатели спонтанной и индуцированной интенсивности свечения (I), а также площадь (S) под кривой динамики свечения за период наблюдения. Для определения интенсивности продукции AФK в каждом временном периоде определяли индекс активации (activation index - AI) в соответствии с формулой: AI(I)=I /I
опыт с
или AI(S)=S /S .
опыт спон
Статистическую обработку результатов проводили непараметрическим методом с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2Q1Q (14.Q.6Q24.1QQQQ) и статистической программы BioStat (версия 7). Различия в группах оценивали по U-критерию Манна-Уитни, а также согласно серийному критерию Вальда-Вольфовица для двух независимых выборок; F < Q,Q5.
опыт спон
Результаты
Продукция АФК клетками крови больных ФЛ и здоровых добровольцев.
Сравнили продукцию АФК клетками крови больных ФЛ и здоровых добровольцев по показателям I и S в присутствии ЦА в двух концентрациях (0,5 и 0,05 мг/мл). Выявили статистически достоверное снижение показателей А1(1) и А1^) (рис. 1) у больных ФЛ по сравнению с добровольцами (Р < 0,05).
AI(I) p = 0,0263 AI(S) p = 0,1385 AI(I) p = 0,0263 AI(S) p = 0,0095
0,5 мг/мл
Больные (n = 14) Patients
0,05 мг/мл Здоровые
добровольцы (n = 5) Healthy volunteers
Рис. 1. Продукция АФК клетками крови больных ФЛ (n = 14) и здоровых добровольцев (n = 5) по показателям AI(I) и AI(S) в присутствии ЦА за период измерения (t = 90 мин). Выявлено статистически достоверное снижение AI(I) и Al(S) при обработке ЦА (0,5 и 0,05 мг/мл) клеток крови больных ФЛ по сравнению со здоровыми добровольцами (P < 0,05). Оценку спонтанной и индуцированной ЦА хемилюминесценции осуществляли на приборе Synergy H1 (BioTek, USA). AI определяли в соответствии с формулой Al(I)=I /I или Al(S)=S /S ,
т: г j \ / опыт спон v ' опыт спон;
где I - максимальные показатели спонтанной и индуцированной
интенсивности свечения; S - площадь под кривой динамики спонтанного и индуцированного свечения за период наблюдения.
По оси абсцисс - обозначение показателей и концентрации лекарственного средства целагрип; по оси ординат - значение индекса активации. АФК - активные формы кислорода; ФЛ - фолликулярная лимфома;
AI - индекс активации; ЦА - целагрип. Fig. 1. Production of ROS by blood cells of patients with FL (n = 14) and healthy volunteers (n = 5) by the indicators of AI (I) and AI (S) in the presence of the CA for the measurement period (t = 90 min). A statistically significant decrease in the AI (I) and AI (S) indices was revealed during the treatment with CA (0.5 and 0.05 mg/ml) of blood cells of patients with FL compared with healthy volunteers (P < 0.05). Evaluation of spontaneous and induced CA chemiluminescence was carried out using a Synergy H1 device (BioTek, USA). The AI was determined in accordance with the formula AI (I) = Iexpert / Ispon or AI (S) = Sexpert / Sspon, where I are the maximum indices of spontaneous and induced luminescence
intensity; S is the area under the curve of the dynamics of spontaneous and induced luminescence over the observation period.
On X-axis - designation of indicators and concentration of the CA; on Y-axis the value of the activation index. ROS - Reactive Oxygen Species; FL -Follicular Lymphoma; AI - activation index; CA - celagrip.
16,00
1 п пп
0,00
ISG15* P53* IFN-a IFN-A BCL2 USP18*
0,00
ISG15* P53*
IFN-a IFN-A BCL2
USP18*
Больные (n = 14) Patients
Здоровые
добровольцы (n = 5) Healthy volunteers
Больные (n = 14) Patients
Здоровые
добровольцы (n = 5) Healthy volunteers
Рис. 2. Действие ЦА на экспрессию генов IFN-a2, IFN-X1, ISG15, BCL2, Р53(ТР53) и USP18 у больных ФЛ (n = 14) и здоровых добровольцев (n = 5). Экспрессию генов определяли с помощью ОТ-ПЦР-РВ, как описано в разделе «Материал и методы».
A. КС генов ISG15 (КС 2,81), Р53(ТР53) (КС 8,55), USP18 (КС 5,79) в группе больных ФЛ достоверно превышала КС генов ISG15 (КС 1,40), Р53(ТР53) (КС 0,87), USP18 (2,41) в группе здоровых добровольцев при обработке клеток крови ЦА в концентрации 0,5 мг/мл (*Р < 0,005 согласно критерию
серий Вальда-Вольфовица).
B. КС генов ISG15 (КС 5,41), Р53(ТР53) (КС 4,47), USP18 (КС 3,36) в группе больных ФЛ достоверно превышала КС генов ISG15 (КС 0,81), Р53(ТР53) (КС 1,25), USP18 (2,31) в группе здоровых добровольцев при обработке клеток крови ЦА в концентрации 0,05 мг/мл (*Р < 0,005 согласно критерию
серий Вальда-Вольфовица).
По оси ординат показана кратность стимуляции генов. По оси абсцисс - название генов интерферонов (IFN) и сигнальных молекул. КС генов IFN-a2, BCL2, IFN-A1 при обработке клеток крови ЦА как у больных ФЛ, так и у здоровых добровольцев не является значимой. ФЛ - фолликулярная лимфома; ЦА - целагрип; КС - кратность стимуляции; IFN-a2 - альфа-2-интерферон; IFN-A1 - лямбда-1-интерферон; ISG15 - ИФН-стимулированный ген 15; BCL2 - регулятор апоптоза Bcl-2 (B-cell lymphoma 2); Р53(ТР53) - ген-супрессор (ТР53) опухолей; USP18 - ген, кодирующий убиквитин-специфическую пептидазу 18; ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в режиме реального времени; *статистически достоверные значения.
Fig. 2. The effect of CA on the expression of genes IFN-a2, IFN-X1, ISG15, BCL2, Р53(ТР53) and USP18 in patients with FL (n = 14) and healthy volunteers (n = 5). Gene expression was determined by Real-Time qRT-PCR as described in the Material and Methods section.
A. MoS of genes ISG15 (2.81), Р53(ТР53) (8.55), USP18 (5.79) in the group of FL patients significantly exceeded MoS of genes ISG15 (1.40), Р53(ТР53) (0,87), USP18 (2.41) in a group of healthy volunteers when treating blood cells with CA at a concentration of 0.5 mg/ml (*P < 0.005 according to the criterion
series of Wald-Wolfowitz).
B. MoS of genes ISG15 (5.41), Р53(ТР53) (4.47), USP18 (3.36) in the group of FL patients significantly exceeded MoS of genes ISG15 (0.81), Р53(ТР53) (1.25), USP18 (2.31) in a group of healthy volunteers when treating blood cells with CA at a concentration of 0.05 mg/ml (*P < 0.005 according to the criterion
series of Wald-Wolfowitz).
Y-axis shows the multiplicity of gene stimulation. X-axis shows the names of the interferon genes and signaling molecules. FL - Follicular Lymphoma; CA -celagrip; MoS - Multiplicity of Stimulation; IFN-a2 - Alfa-2-Interferon; IFN-A1 - Lambda-1-Interferon; ISG15 - Interferon-stimulated gene 15; BCL2 - apop-tosis regulator (B-cell lymphoma 2); Р53(ТР53) - a tumor suppression, gene that codes for a protein that regulates the cell cycle; USP18 - a Protein Coding gene of Ubiquitin Specific Peptidase 18; Real-Time qRT-PCR - Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; *statistically reliable values.
Экспрессия группы генов интерферона и сигнальных молекул №N^2, №N-21, ISG15, ВСЬ2, ¥53(ТР53) и USP18. При сравнении генной экспрессии в группах больных ФЛ и добровольцев были выявлены различные уровни стимуляции при обработке ЦА (рис. 2 А, В). Как видно на рис. 2, кратность стимуляции (КС) генов 18015 (КС 2,81 и 5,41), Р53(ТР53) (КС 8,55 и 4,47), иБПв (КС 5,79 и 3,36) в группе больных ФЛ достоверно превышала КС Ш15 (КС 1,40 и 0,81), Р53(ТР53) (КС 0,87 и 1,25), ШР18 (2,41 и 2,31) в группе здоровых добровольцев при обработке клеток крови ЦА в концен-
трации 0,5 или 0,05 мг/мл соответственно (Р < 0,005 согласно критерию серий Вальда-Вольфовица).
При этом не обнаруживается значимой КС генов №N^2, В^2, ^N-21 при обработке клеток крови ЦА как у больных ФЛ, так и у здоровых добровольцев. КС генов В^2, ^N-21 в ответ на действие
ЦА находилась на уровне экспрессии генов в контрольной группе без обработки ЦА (то есть фактически стимуляция отсутствовала), поэтому мы считали такую КС незначимой, и данная группа генов далее не рассматривалась.
ORIGINAL RESEARCH
30,00
-5 25,00
20,00
15,00
10,00
CP
5,00
0,00
25,00
ISG15 P53* IFN-a IFN-X BCL2* USP18*
IFN-X BCL2* USP18*
Больные с положительным ответом по USP18 (n = 7) Patients with a positive response for USP18
Больные с отрицательным ответом по USP18 (n = 5) Patients with a negative response for USP18
Больные с положительным ответом по USP18 (n = 7) Patients with a positive response for USP18
Больные с отрицательным ответом по USP18 (n = 5) Patients with a negative response for USP18
Рис. 3. Действие ЦА на экспрессию генов IFN-a2, IFN-X1, ISG15, BCL2, Р53(ТР53) и USP18 в клетках крови больных ФЛ, распределенных в соответствии с положительным (n = 7) и отрицательным (n = 5) Ц?Р18-ответом. Генную экспрессию анализировали с помощью ОТ-ПЦР-РВ, как описано в разделе «Материал и методы».
A. Обработка клеток крови ЦА в концентрации 0,5 мг/мл. Сравнение КС генов в клетках крови больных ФЛ с положительным и отрицательным ответом по USP18: КС по гену USP18 9,82 против 0,98; *Р = 0,0058; КС по гену ISG15 4,94 против 0,94; Р = 0,4649; КС по гену P53(TP53) 13,62 против
0,58; *Р = 0,0424.
B. Обработка клеток крови ЦА в концентрации 0,05 мг/мл. Сравнение КС генов в клетках крови больных ФЛ с положительным и отрицательным ответом по USP18: КС по гену USP18 6,14 против 0,57; *Р = 0,0045; КС по гену ISG15 10,45 против 0,34; Р = 0,1229; КС по гену P53(TP53) 8,07 против
0,47; *Р = 0,0284.
По оси ординат показана КС генов. По оси абсцисс - название генов интерферонов и сигнальных молекул. Статистическая обработка согласно U-критерию Манна-Уитни; ФЛ - фолликулярная лимфома; ЦА - целагрип; КС - кратность стимуляции; IFN-a2 - альфа 2-интерферон; IFN-A1 -лямбда-1-интерферон; ISG15 - ИФН-стимулированный ген 15; BCL2 - регулятор апоптоза Bcl-2 (B-cell lymphoma 2); Р53(ТР53) - ген-супрессор (ТР53) опухолей; USP18 - ген, кодирующий убиквитин-специфическую пептидазу 18; ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная
реакция в режиме реального времени; *статистически достоверные значения.
Fig. 3. The effect of CA on the expression of genes IFN-a2, IFN-X1, ISG15, BCL2, P53 (TP53) and USP18 genes in the blood cells of FL patients, distributed according to positive (n = 7) and negative (n = 5) USP18 responses. Gene expression was determined by Real-Time qRT-
PCR as described in the Material and Methods section.
A. Treatment of blood cells with CA at a concentration of 0.5 mg/ml. Comparison of MoS genes in blood cells of FL patients with USP18-positive and USP18-negative responses: MoS for the USP18 gene is 9.82 versus 0.98; P = 0.0058; MoS for the ISG15 gene 4.94 versus 0.94; P = 0.4649; MoS for gene P53(TP53)
13.62 versus 0.58; P = 0.0424.
B. Treatment of blood cells with CA at a concentration of 0.05 mg / ml. Comparison of MoS genes in blood cells of FL patients with USP18-positive and USP18-negative responses: MoS for the USP18 gene is 6,14 versus 0,57; Р = 0,0045; MoS for the ISG15 gene is 10,45 versus 0,34; Р = 0,1229; MoS for gene
P53(TP53) is 8,07 против 0,47; Р = 0,0284. Y-axis shows the multiplicity of gene stimulation. X-axis shows the names of the interferon genes and signaling molecules. Statistical processing according to the Mann-Whitney U-test; FL - Follicular Lymphoma; CA - celagrip; MoS - Multiplicity of Stimulation; IFN-a2 - Alfa-2-Interferon; IFN-A1 - Lambda-1-Interferon; ISG15 - Interferon-stimulated gene 15; BCL2 - apoptosis regulator (B-cell lymphoma 2); P53(ТР53) - a tumor suppression, gene that codes for a protein that regulates the cell cycle; USP18 - a Protein Coding gene of Ubiquitin Specific Peptidase 18; Real-Time qRT-PCR - Real-Time Quantitative Reverse
Transcription Polymerase Chain Reaction; * statistically reliable values.
Сравнение кратности стимуляции ЦА генов врожденного иммунитета в клетках крови больных ФЛ, распределенных в соответствии с положительным (п = 7) и отрицательным (п = 5) USP18-от-ветом. В таблице представлены группы больных ФЛ и здоровых добровольцев, различающихся по КС гена иБР18 в ответ на обработку клеток крови ЦА. При КС
>2 больных считали чувствительными к действию ЦА, при КС <2 - не чувствительными к действию ЦА.
Как показано на рис. 3, при обработке клеток крови ЦА у больных ФЛ с положительным ответом по сравнению с больными с отрицательным ответом по гену иБР18 (КС 9,82 против 0,98; Р = 0,0058, при обработке ЦА 0,5 мг/мл - рис. 3, А и КС 6,14 про-
Распределение больных фолликулярной лимфомой (ФЛ) и здоровых добровольцев по кратности стимуляции гена USP18 в ответ на обработку клеток крови ЦА
Distribution of patients with follicular lymphoma (FL) and healthy volunteers according to the multiplicity of USP18 gene stimulation in response to the treatment of blood cells with CA
№ Группа Число больных/здоровых Кратность стимуляции гена
п/п Group The number of patients / healthy USP18
USP18 gene stimulation ratio
1 Больные ФЛ, чувствительные к действию ЦА 7 > 2
Patients with FL sensitive to CA
2 Больные ФЛ, не чувствительные к действию ЦА 5 < 2 Patients with FL, not sensitive to the action of CA
3 Здоровые добровольцы, чувствительные к действию ЦА 2 > 2 Healthy volunteers sensitive to CA
4 Здоровые добровольцы, не чувствительные к действию ЦА 3 < 2 Healthy volunteers, not sensitive to the action of CA
тив 0,57; Р = 0,0045, при обработке ЦА 0,05 мг/мл -рис. 3, В) также наблюдается высокая КС генов Ш15 (КС 4,94 против 0,94; Р = 0,4649 при обработке ЦА 0,5 мг/мл - рис. 3, А и КС 10,45 против 0,34; Р = 0,1229, при обработке ЦА 0,05 мг/мл - рис. 3, В) и Р53(ТР53) (КС 13,62 против 0,58; Р = 0,0424 при обработке ЦА 0,5 мг/мл - рис. 3, А и КС 8,07 против 0,47; Р = 0,0284 при обработке ЦА 0,05 мг/мл -рис. 3, В). При этом не отмечено достоверных изменений КС в отношении добровольцев с положительным ответом по гену иБР18 по сравнению с добровольцами с отрицательным ответом по тому же гену (данные не показаны). КС генов №Ы-а2, Б^2, ШЫ-Х1 при обработке клеток крови ЦА как у больных ФЛ, так и у здоровых добровольцев не является значимой.
Обсуждение
В ранее проведенных исследованиях на клеточных культурах, продуцирующих и не продуцирующих антигены ВЭБ, была обнаружена взаимосвязь между генерацией АФК и экспрессией генов врожденного иммунитета Ш015 и ТР53 при воздействии ЛС ЦА. Данные свидетельствовали о возможном выявлении с помощью ЦА 1КЫ-опосредованных ответов генов врожденного иммунитета при онкопатологии, которые могли бы быть связаны с продукцией АФК. Для проверки этого предположения нами проведены исследования на группе больных ФЛ и сравнительной группе здоровых добровольцев. При этом исследовали ряд генов врожденного иммунитета 1ЕМа, 1ЕМХ, ISG15, Р53(ТР53), ВСЬ2 и иБР18. Полученные данные свидетельствовали о способности противовирусного ЛС ЦА в клетках крови больных ФЛ влиять на образование АФК и экспрессию ряда генов врожденного иммунитета. Показано, что достоверно снижается продукция АФК у больных ФЛ по сравнению со здоровыми добровольцами и возрастает уровень экспрессии генов ЖР18, Ш15 и Р53(ТР53) при обработке ЦА в концентрациях 0,5 и 0,05 мг/мл.
Известно, что АФК образуются как естественные побочные продукты нормальной клеточной активности [19, 20]. Повышение уровня АФК нарушает гомео-стаз, структуру и функции клеток и приводит к окисли-
тельному стрессу. Смещение клеточного окислительно-восстановительного баланса является фактором риска развития различных патологий [21]. АФК могут вызывать нарушения в ДНК-последовательности, делеции, мутации, генные перестройки, приводящие к включению апоптозных сигналов, последующей гибели клеток или инактивации генов-супрессоров опухоли либо к активации протоонкогенов. Напротив, антиканцерогенные средства могут ингибировать образование АФК, окислительное повреждение ДНК, приводя к снижению апоптоза [22]. В нашем исследовании ЦА подавлял образование АФК у больных ФЛ. ФЛ, как хорошо известно, это индолентная лимфома с хорошим ответом на лечение, длительными ремиссиями заболевания и медленным прогрессированием. Медиана выживаемости 80% больных при современном лечении составляет более 15 лет. Тем не менее примерно 20% пациентов составляют прогностически неблагоприятную группу: заболевание рецидивирует в ранние сроки, в течение 1-2 лет от достижения первой ремиссии. Оксидативный стресс, мутации ТР53 и транслокации МУС, Вс1-2 и Вс1-6 при многих новообразованиях связываются с этиологией и плохим прогнозом [23]. Известно, что риск возникновения неходжкинской лимфомы связан с воспалением, а один из возможных механизмов может включать окислительный стресс, поскольку АФК могут генерировать провоспалительные сигналы [24]. По-видимому, ЦА, подавляя генерацию АФК, у некоторых больных может способствовать снижению продукции провоспалительных цитокинов. Например, при обработке ЦА клеток крови больных ФЛ мы наблюдали (предварительные данные) подавление продукции 1 и ^-6 у 3 из 10 больных, у которых выявлялось снижение образования АФК, у остальных наблюдались разнонаправленные изменения.
Одним из ключевых компонентов врожденного иммунного ответа является активация сигнальных путей ^ 1-го типа, которые индуцируются при вирусной инфекции и при развитии рака. IFN 1-го типа как участвует в антивирусном ответе, так и подавляет пролиферацию клеток и способствует апоптозу [25]. ISG15 индуцируется при действии IFN 1-го типа [26, 27] при вирусной инфекции [28, 29], и может функциониро-
ORIGINAL RESEARCH
вать как онкогенный белок в случае нарушения регуляции ISG15 [30, 31] и/или как белок-супрессор опухоли [32-34]. Как говорилось выше, ISG15 является убикви-тин-подобным белком и осуществляет ISGylation. Было показано, что ISGylation может происходить котранс-ляционно на вновь синтезированных белках без явной специфичности к мишени [35]. ISGylation является обратимой реакцией, и основным ^G^^ra^^m-рующим ферментом in vivo считается USP18/UBP43 [36]. Недавние исследования показали, что USP18 может выступать в качестве онкогена при различных видах рака [37]. Известно также [38], что нокдаун USP18 может привести к снижению жизнеспособности клеток и увеличению апоптотической гибели клеток при окислительном стрессе. Показано, что ISGylation Р53 играет критическую роль в ингибировании роста клеток и, следовательно, в подавлении развития опухоли в условиях повреждения ДНК [39].
Учитывая, что активность продукта гена USP18 связывается с подавлением ферментативной активности ISG15 и супрессией интерферонового ответа, мы сгруппировали больных ФЛ и здоровых добровольцев по уровню стимуляции гена USP18 на обработку ЦА. Такое разделение было обосновано тем, что как больные ФЛ, так и здоровые добровольцы либо отвечали, либо не отвечали активацией гена USP18 на обработку ЦА (см. табл. 1). Например, у больного 2 с высокой КС по гену USP18 в ответ на обработку ЦА (КС 46,6 и 10,3 при обработке ЦА в концентрации 0,5 и 0,05 мг/мл соответственно) наблюдали также высокую КС экспрессии генов ISG15 (КС 15,6 и 64,5 при обработке ЦА в концентрациях 0,5 и 0,05 мг/мл соответственно) и Р53(ТР53) (КС 80,3 и 25,3 при обработке ЦА в концентрациях 0,5 и 0,05 мг/мл соответственно). В то же время у больного 3, у которого не определялась экспрессия гена USP18 в ответ на обработку ЦА (КС 0,6 и 0,7 при обработке ЦА в концентрациях 0,5 и 0,05 мг/мл соответственно), также отсутствовала экспрессия остальных исследованных генов (КС по генам ISG15, P53(TP53), IFN-a, IFN-k, BCL2 находилась в пределах значений 0,011,4). Мы выдвинули рабочую гипотезу, что высокая КС гена USP18 может свидетельствовать о подавлении пути проведения ИФН-сигнала, поскольку известно, что USP18 функционирует также как критический отрицательный регулятор IFN ответа и отменяет вызванную продуктом гена ISG15 ISGilation, которая может стимулировать белок Р53 и каспазу-3 и тем самым способствовать апоптозу [8, 36]. В таком случае ЦА, по-видимому, может являться детектирующим агентом, на основании применения которого могут быть определены активность генов врожденного иммунитета и возможность связать их c прогностическими параметрами течения антивирусного или противоопухолевого процесса. Перспективность такого подхода покажут дальнейшие исследования.
Выводы
1. При сравнении продукции АФК клетками крови больных ФЛ и здоровых добровольцев в присутствии
ЦА выявлено статистически достоверное снижение показателей AI(I) и AI(S) у больных ФЛ по сравнению с добровольцами (P < 0,05).
2. КС генов ISG15, P53(TP53) и USP18 в группе больных ФЛ значительно превышала таковую в группе добровольцев (P < 0,005). Не обнаруживается значимой КС генов IFN-a2, BCL2, IFN-X1 при обработке клеток крови ЦА как у больных ФЛ, так и у здоровых добровольцев.
3. При обработке клеток крови ЦА у больных ФЛ с положительным ответом по гену USP18 также наблюдается высокая КС генов ISG15 и P53(TP53) по сравнению с больными с отрицательным ответом по этому гену.
4. ЦА снижает продукцию АФК и одновременно стимулирует активность генов врожденного иммунитета ISG15, Р53(ТР53) и USP18 в клетках крови больных ФЛ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Schneider W.M., Chevillotte M.D., Rice C.M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annu. Rev. Immunol. 2014; 32: 513-45. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-032713-120231
2. Ершов Ф.И., Киселев О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М.: ГЭОТАР-Медиа; 2005.
3. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н. Интерфероны и индукторы интерферонов. В кн.: Хаитов Р.М., Атауллаханов Р.И., Шуль-женко А.Е., ред. Иммунотерапия: руководство для врачей. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2018: 123-47.
4. Iglesias-Guimarais V., Ahrends T., de Vries E., Knobeloch K-P., Volkov A., Borst J. IFN-stimulated gene 15 IS an Alarmin that boosts the CTL response via an innate, NK Cell-dependent route. J Immunol. 2020; 204(8): 2110-21. https://doi.org/10.4049/jimmunol.1901410
5. Zhao C., Collins M.N., Hsiang T.-Y., Krug R.M. Interferon-induced ISG15 pathway: an ongoing virus-host battle. Trends Microbiol. 2013; 21(4): 181-6. https://doi.org/10.1016/j.tim.2013.01.005
6. Perng Y.C., Lenschow D.J. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat. Rev. Microbiol. 2018; 16(7): 423-39. https://doi.org/10.1038/ s41579-018-0020-5
7. Fernández D.J., Hess S., Knobeloch K.P. Strategies to target ISG15 and USP18 toward therapeutic applications. Front. Chem. 2020; 7: 923. https://doi.org/10.3389/fchem.2019.00923
8. Keng Po Lai, Cheung A.H.Y., Tse W.K.F. Deubiquitinase Usp18 prevents cellular apoptosis from oxidative stress in liver cells. Cell Biol. Int. 2017; 41(8): 914-21. https://doi.org/10.1002/cbin.10799
9. Alfadda A.A., Sallam R.M. Reactive oxygen species in health and disease. J. Biomed. Res. Int. 2012; 2012: 936486. https://doi. org/10.1155/2012/936486
10. Наровлянский А.Н., Мезенцева М.В., Суетина И.А., Руссу Л.И., Иванова А.М., Полосков В.В. и др. Цитокин-регулирующая активность противовирусного препарата ЦелАгрип в перевиваемых В-клеточных линиях лимфомы Бёркитта. Вопросы вирусологии. 2019; 64(4): 165-72. https://doi.org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-165-172
11. Атаханов А.А., Сарымсаков А.А., Рашидова С.Ш. Наносисте-мы целлюлозы и серебра: синтез, структура и свойства. Ташкент; 2016.
12. Наровлянский А.Н., Полосков В.В., Иванова А.М., Мезенцева М.В., Суетина И.А., Руссу Л.И. и др. Интерферон-регулирую-щая активность препарата ЦелАгрипп и его влияние на образование активных форм кислорода и экспрессию генов врождённого иммунитета в перевиваемых культурах клеток лимфомы Бёркитта. Вопросы вирусологии. 2020; 65(2): 87-94. https://doi. org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-87-94
13. Шувалов А.Н., Соколова Т.М., Шаповал И.М., Ершов Ф.И. Модуляция транскрипции клеточных генов препаратом им-муномакс: активация генов интерферонов и интерлейкинов. Иммунология. 2014; 35(1): 16-20. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2015-1-7-18
14. Соколова Т.М., Шувалов А.Н., Колодяжная Л.В., Оспельни-кова Т.П., Ершов Ф.И. Механизмы действия препарата «Каго-цел» в клетках человека. Сообщение 1. Регуляция транскрипции генов системы интерферона и апоптоза. В кн.: Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н., ред. Сборник научных трудов «Интерфе-рон-2011». М.; 2012: 389-401.
15. Соколова Т.М., Кособокова Е.Н., Шувалов А.Н., Шаповал И.М., Косоруков В.С., Ершов Ф.И. Активность генов системы интерферона в клетках аденокарциномы толстого кишечника htc 116: регуляция рекомбинантными интерферонами альфа-2 из бактериальных и растительных продуцентов. Российский биотерапевтический журнал. 2013; 12(3): 39-44.
16. Hashemi S.M.A., Sarvari J., Fattahi M.R., Dowran R., Ramezani A., Hosseini S.Y. Comparison of ISG15, IL28B and USP18 mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis B virus infected patients and healthy individuals. Gastroenterol. Hepatol. Bed Bench. 2019; 12(1): 38-45.
17. Li L.D., Sun H.F., Liu X.X., Gao S.P., Jiang H.L., Hu X., et al. Down-regulation of NDUFB9 promotes breast cancer cell proliferation, metastasis by mediating mitochondrial metabolism. PLoS One. 2015; 10(12): e0144441. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0144441
18. Федоров Г.Н., Леонов С.Д. Особенности хемилюминесценции цельной разведенной крови. Математическая морфология. Электронный математический и медико-биологический журнал. 2007; 6(4).
19. Snezhkina A.V., Kudryavtseva A.V., Kardymon O.I., Savva-teeva M.V., Melnikova N.V., Krasnov G.S., et al. ROS generation and antioxidant defense systems in normal and malignant cells. Oxid. Med. Cell Longev. 2019; 2019: 6175804. https://doi. org/10.1155/2019/6175804
20. Zhang J., Wang X., Vikash V., et al. ROS and ROS-mediated cellular signaling. Oxid. Med. Cell Longev. 2016; 2016: 4350965. https:// doi.org/10.1155/2016/4350965
21. Brieger, K., Schiavonea S., Miller F.J., Krausea K.H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med. Wkly. 2012; 142: w13659. https://doi.org/10.4414/smw.2012.13659
22. Pourahmad J., Salimi A., Seydi E. Role of oxygen free radicals in cancer development and treatment, free radicals and diseases, Rizwan Ahmad, 2016. IntechOpen. https://doi.org/10.5772/64787 Available at: https://www.intechopen.com/books/free-radi-cals-and-diseases/role-of-oxygen-free-radicals-in-cancer-develop-ment-and-treatment
23. Peroja P. Oxidative stress in diffuse large B-cell lymphoma and follicular lymphoma, and TP53 mutations and translocations of MYC, Bcl-2 and Bcl-6 in diffuse large B-cell lymphoma. Available at: http://jultika.oulu.fi/files/isbn9789526218595.pdf
24. Lightfoot T.J., Skibola C.F., Smith A.G., Forrest M.S., Adamson P.J., Morgan G.J., et al. Polymorphisms in the oxidative stress genes, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase and risk of non-Hodgkin's lymphoma. Haematologica. 2006; 91(9): 1222-7.
25. Young J.J., Yoo H.M., Chung C.H. ISG15 and immune diseases. Biochim. Biophys. Acta. 2010; 1802(5): 485-96. https://doi. org/10.1016/j.bbadis.2010.02.006
26. Farrell P. J., Broeze R.J., Lengyel P.L. Accumulation of an mRNA and protein in interferon-treated Ehrlich ascites tumour cells. Nature. 1979; 279(5713): 523-5. https://doi.org/10.1038/279523a0
27. Haas A.L., Ahrens P., Bright P.M., Ankel H. Interferon induces a 15-kilodalton protein exhibiting marked homology to ubiquitin. J. Biol. Chem. 1987; 262(23): 11315-23.
28. Yuan W., Krug R.M. Influenza B virus NS1 protein inhibits conjugation of the interferon (IFN)-induced ubiquitin-like ISG15 protein. EMBO J. 2001; 20(3): 362-71. https://doi.org/10.1093/ emboj/20.3.362
29. Nielsch U., Pine R., Zimmer S.G., Babiss L.E. Induced expression of the endogenous beta interferon gene in adenovirus type 5-transformed rat fibroblasts. J. Virol. 1992; 66(4): 1884-90. https:// doi.org/10.1128/jvi.66.4.1884-1890.1992
30. Andersen J.B., Aaboe M., Borden E.C., Goloubeva O.G., Hassel B.A., Orntoft T.F. Stage-associated overexpression of the ubiq-uitin-like protein, ISG15, in bladder cancer. Br. J. Cancer. 2006; 94(10): 1465-71. https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6603099
31. Desai S.D., Haas A.L., Wood L.M., Tsai Y.C., Pestka S., Rubin E.H., et al. Elevated expression of ISG15 in tumor cells interferes
with the ubiquitin/26S proteasome pathway. Cancer Res. 2006; 66(2): 921-8. https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-05-1123
32. Andersen J.B., Hassel B.A. The interferon regulated ubiqui-tin-like protein, ISG15, in tumorigenesis: friend or foe? Cytokine Growth Factor Rev. 2006; 17:411-421. https://doi.org/10.1016/j. cytogfr.2006.10.001
33. Kitareewan S., Pitha-Rowe I., Sekula D., Lowrey C.H., Nemeth M.J., Golub T.R. et al. UBE1L is a retinoid target that triggers PML/ RARalpha degradation and apoptosis in acute promyelocytic leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99(6): 3806-11. https://doi. org/10.1073/pnas.052011299
34. Zhao C., Denison C., Huibregtse J.M., Gygi S., Krug R.M. Human ISG15 conjugation targets both IFN-induced and constitu-tively expressed proteins functioning in diverse cellular pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005; 102(29): 10200-5. https://doi. org/10.1073/pnas.0504754102
35. Durfee L.A., Lyon N., Seo K., Huibregtse J.M. The ISG15 conjugation system broadly targets newly synthesized proteins: implications for the antiviral function of ISG15. Mol. Cell. 2010; 38(5): 722-32. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2010.05.002
36. Malakhov M.P., Malakhova O.A., Kim K.I., Ritchie K.J., Zhang D.E. UBP43 (USP18) specifically removes ISG15 from conjugated proteins. J. Biol. Chem. 2002; 277(12): 9976-81. https://doi. org/10.1074/jbc.M109078200
37. Tan Y., Zhou G., Wang X., Chen W., Gao H. USP18 promotes breast cancer growth by upregulating EGFR and activating the AKT/Skp2 pathway. Int. J. Oncol. 2018; 53(1): 371-83. https://doi. org/10.3892/ijo.2018.4387.
38. Lai K.P., Cheung A.H.Y., Tse W.K.F. Deubiquitinase Usp18 prevents cellular apoptosis from oxidative stress in liver cells. Cell Biol. Int. 2017; 41(8): 914-21. https://doi.org/10.1002/cbin.10799
39. Park J.H., Yang S.W., Park J.M., Ka S.H., Kim J.H., Kong Y.Y., et al. Positive feedback regulation of p53 transactivity by DNA damage-induced ISG15 modification. Nat. Commun. 2016; 7: 12513. https://doi.org/10.1038/ncomms12513
REFERENCES
1. Schneider W.M., Chevillotte M.D., Rice C.M. Interferon-stim-ulated genes: a complex web of host defenses. Annu. Rev. Immunol. 2014; 32: 513-45. https://doi.org/10.1146/annurev-immu-nol-032713-120231
2. Ershov F.I., Kiselev O.I. Interferons and Their Inductors (From Molecules to Drugs) [Interferony i ikh induktory (ot molekul do le-karstv)]. Moscow: GEOTAR-Media; 2005. (in Russian)
3. Ershov F.I., Narovlyanskiy A.N. Interferons and inducers of interferons. In: Khaitov R.M., Ataullakhanov R.I., Shul'zhenko A.E., eds. Immunotherapy: A Guide for Doctors [Immunoterapiya: ruk-ovodstvo dlya vrachey]. Moscow: GEOTAR-Media; 2018: 123-47. (in Russian)
4. Iglesias-Guimarais V., Ahrends T., de Vries E., Knobeloch K-P., Volkov A., Borst J. IFN-stimulated gene 15 IS an Alarmin that boosts the CTL response via an innate, NK Cell-dependent route. J Immunol. 2020; 204(8): 2110-21. https://doi.org/10.4049/jimmu-nol.1901410
5. Zhao C., Collins M.N., Hsiang T.-Y., Krug R.M. Interferon-induced ISG15 pathway: an ongoing virus-host battle. Trends Microbiol. 2013; 21(4): 181-6. https://doi.org/10.1016/j.tim.2013.01.005
6. Perng Y.C., Lenschow D.J. ISG15 in antiviral immunity and beyond. Nat. Rev. Microbiol. 2018; 16(7): 423-39. https://doi.org/10.1038/ s41579-018-0020-5
7. Fernández D.J., Hess S., Knobeloch K.P. Strategies to target ISG15 and USP18 toward therapeutic applications. Front. Chem. 2020; 7: 923. https://doi.org/10.3389/fchem.2019.00923
8. Keng Po Lai, Cheung A.H.Y., Tse W.K.F. Deubiquitinase Usp18 prevents cellular apoptosis from oxidative stress in liver cells. Cell Biol. Int. 2017; 41(8): 914-21. https://doi.org/10.1002/cbin.10799
9. Alfadda A.A., Sallam R.M. Reactive oxygen species in health and disease. J. Biomed. Res. Int. 2012; 2012: 936486. https://doi. org/10.1155/2012/936486
10. Narovlyanskiy A.N., Mezentseva M.V., Suetina I.A., Russu L.I., Ivanova A.M., Poloskov V.V., et al. Cytokine-regulating activity of anti-virus preparation Celagripus in Burkitt's lymphoma stable B-cell lines. Voprosy virusologii. 2019; 64(4): 165-72. https://doi. org/10.36233/0507-4088-2019-64-4-165-172 (in Russian)
ORIGINAL RESEARCH
11. Atakhanov A.A., Sarymsakov A.A., Rashidova S.Sh. Nanosystems of Cellulose and Silver: Synthesis, Structure and Properties [Nano-sistemy tsellyulozy i serebra: sintez, struktura i svoystva]. Tashkent; 2016. (in Russian)
12. Narovlyanskiy A.N., Poloskov V.V., Ivanova A.M., Mezentseva M.V., Suetina I.A., Russu L.I., et al. Interferon-regulating activity of the CelAgrip drug and its influence on the formation of reactive oxygen species and expression of innate immunity genes in Burkitt's lymphome cell cultures. Voprosy virusologii. 2020; 65(2): 87-94. https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-87-94 (in Russian)
13. Shuvalov A.N., Sokolova T.M., Shapoval I.M., Ershov F.I. Modulation of cellular gene transcription by drug "immu-nomax": activation of interferon and interleukine genes. Immunologiya. 2014; 35(1): 1620. https://doi.org/10.15789/1563-0625-2015-1-7-18 (in Russian)
14. Sokolova T.M., Shuvalov A.N., Kolodyazhnaya L.V., Ospel'niko-va T.P., Ershov F.I. The mechanisms of action of the drug "Kago-cel" in human cells. Communication 1. Regulation of transcription of genes of the interferon system and apoptosis. In: Ershov F.I., Narovlyanskiy A.N., eds. Collection of Proceedings «Interfer-on-2011» [Sbornik nauchnykh trudov «Interferon-2011»]. Moscow; 2012: 389-401. (in Russian)
15. Sokolova T.M., Kosobokova E.N., Shuvalov A.N., Shapoval I.M., Kosorukov V.S., Ershov F.I. Interferon system gene activity in colon adenocarcinoma cells HCT-116: regulation by interferon-alpha-2B from bacteria or plants. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal. 2013; 12(3): 39-44. (in Russian)
16. Hashemi S.M.A., Sarvari J., Fattahi M.R., Dowran R., Ramezani A., Hosseini S.Y. Comparison of ISG15, IL28B and USP18 mRNA levels in peripheral blood mononuclear cells of chronic hepatitis B virus infected patients and healthy individuals. Gastroenterol. Hepatol. BedBench. 2019; 12(1): 38-45.
17. Li L.D., Sun H.F., Liu X.X., Gao S.P., Jiang H.L., Hu X., et al. Down-regulation of NDUFB9 promotes breast cancer cell proliferation, metastasis by mediating mitochondrial metabolism. PLoS One. 2015; 10(12): e0144441. https://doi.org/10.1371/journal. pone.0144441
18. Fedorov G.N., Leonov S.D. Features of chemiluminescence of whole diluted blood. Mathematical morphology. Elektronnyy matematicheskiy i medikobiologicheskiy zhurnal. 2007; 6(4). (in Russian)
19. Snezhkina A.V., Kudryavtseva A.V., Kardymon O.I., Savva-teeva M.V., Melnikova N.V., Krasnov G.S., et al. ROS generation and antioxidant defense systems in normal and malignant cells. Oxid Med. Cell Longev. 2019; 2019: 6175804. https://doi. org/10.1155/2019/6175804
20. Zhang J., Wang X., Vikash V., et al. ROS and ROS-mediated cellular signaling. Oxid. Med. Cell Longev. 2016; 2016: 4350965. https:// doi.org/10.1155/2016/4350965
21. Brieger, K., Schiavonea S., Miller F.J., Krausea K.H. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med. Wkly. 2012; 142: w13659. https://doi.org/10.4414/smw.2012.13659
22. Pourahmad J., Salimi A., Seydi E. Role of oxygen free radicals in cancer development and treatment, free radicals and diseases, Rizwan Ahmad, 2016. IntechOpen. https://doi.org/10.5772/64787 Available at: https://www.intechopen.com/books/free-radi-cals-and-diseases/role-of-oxygen-free-radicals-in-cancer-develop-ment-and-treatment
23. Peroja P. Oxidative stress in diffuse large B-cell lymphoma and follicular lymphoma, and TP53 mutations and translocations of MYC, Bcl-2 and Bcl-6 in diffuse large B-cell lymphoma. Available at: http://jultika.oulu.fi/files/isbn9789526218595.pdf
24. Lightfoot T.J., Skibola C.F., Smith A.G., Forrest M.S., Adamson P. J., Morgan G.J., et al. Polymorphisms in the oxidative stress genes, superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase and risk of non-Hodgkin's lymphoma. Haematologica. 2006; 91(9): 1222-7.
25. Young J.J., Yoo H.M., Chung C.H. ISG15 and immune diseases. Biochim. Biophys. Acta. 2010; 1802(5): 485-96. https://doi. org/10.1016/j.bbadis.2010.02.006
26. Farrell P. J., Broeze R.J., Lengyel P.L. Accumulation of an mRNA and protein in interferon-treated Ehrlich ascites tumour cells. Nature. 1979; 279(5713): 523-5. https://doi.org/10.1038/279523a0
27. Haas A.L., Ahrens P., Bright P.M., Ankel H. Interferon induces a 15-kilodalton protein exhibiting marked homology to ubiquitin. J. Biol. Chem. 1987; 262(23): 11315-23.
28. Yuan W., Krug R.M. Influenza B virus NS1 protein inhibits conjugation of the interferon (IFN)-induced ubiquitin-like ISG15 protein. EMBO J. 2001; 20(3): 362-71. https://doi.org/10.1093/ emboj/20.3.362
29. Nielsch U., Pine R., Zimmer S.G., Babiss L.E. Induced expression of the endogenous beta interferon gene in adenovirus type 5-transformed rat fibroblasts. J. Virol. 1992; 66(4): 1884-90. https:// doi.org/10.1128/jvi.66.4.1884-1890.1992
30. Andersen J.B., Aaboe M., Borden E.C., Goloubeva O.G., Hassel B.A., Orntoft T.F. Stage-associated overexpression of the ubiq-uitin-like protein, ISG15, in bladder cancer. Br. J. Cancer. 2006; 94(10): 1465-71. https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6603099
31. Desai S.D., Haas A.L., Wood L.M., Tsai Y.C., Pestka S., Rubin E.H., et al. Elevated expression of ISG15 in tumor cells interferes with the ubiquitin/26S proteasome pathway. Cancer Res. 2006; 66(2): 921-8. https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-05-1123
32. Andersen J.B., Hassel B.A. The interferon regulated ubiquitin-like protein, ISG15, in tumorigenesis: friend or foe? Cytokine Growth Factor Rev. 2006; 17:411-421. https://doi.org/10.1016Zj.cytogfr.2006.10.001
33. Kitareewan S., Pitha-Rowe I., Sekula D., Lowrey C.H., Nemeth M.J., Golub T.R. et al. UBE1L is a retinoid target that triggers PML/ RARalpha degradation and apoptosis in acute promyelocytic leukemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99(6): 3806-11. https://doi. org/10.1073/pnas.052011299
34. Zhao C., Denison C., Huibregtse J.M., Gygi S., Krug R.M. Human ISG15 conjugation targets both IFN-induced and constitu-tively expressed proteins functioning in diverse cellular pathways. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 2005; 102(29): 10200-5. https://doi. org/10.1073/pnas.0504754102
35. Durfee L.A., Lyon N., Seo K., Huibregtse J.M. The ISG15 conjugation system broadly targets newly synthesized proteins: implications for the antiviral function of ISG15. Mol. Cell. 2010; 38(5): 722-32. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2010.05.002
36. Malakhov M.P., Malakhova O.A., Kim K.I., Ritchie K.J., Zhang D.E. UBP43 (USP18) specifically removes ISG15 from conjugated proteins. J. Biol. Chem. 2002; 277(12): 9976-81. https://doi. org/10.1074/jbc.M109078200
37. Tan Y., Zhou G., Wang X., Chen W., Gao H. USP18 promotes breast cancer growth by upregulating EGFR and activating the AKT/Skp2 pathway. Int. J. Oncol. 2018; 53(1): 371-83. https://doi.org/10.3892/ ijo.2018.4387.
38. Lai K.P., Cheung A.H.Y., Tse W.K.F. Deubiquitinase Usp18 prevents cellular apoptosis from oxidative stress in liver cells. Cell Biol. Int. 2017; 41(8): 914-21. https://doi.org/10.1002/cbin.10799
39. Park J.H., Yang S.W., Park J.M., Ka S.H., Kim J.H., Kong Y.Y., et al. Positive feedback regulation of p53 transactivity by DNA damage-induced ISG15 modification. Nat. Commun. 2016; 7: 12513. https://doi.org/10.1038/ncomms12513
