CC BY
1199
УДК: 616-07
Р. А. Шамсутдинова, А.Я. Чепурных, Е.А. Савиных, Н.В. Коновалова, А.В. Бикметова
ИНФИЦИРОВАНИЕ HELICOBACTER PYLORI: МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Кировская государственная медицинская академия R.A. Shamsutdinova, A.J. Chepurnykh, E.A. Savinykh, N.V Konovalova, A.V Bikmetova
HELICOBACTER PYLORI INFECTION: METHODS OF DIAGNOSIS
Kirov state medical academy
Хеликобактерная инфекция - одна из значимых при чин развития заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки. В статье дан обзор основных методов диагностики инфицированности Helicobacter pylori.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, инфицирова ние, методы диагностики.
Helicobacter pylori infection is one of the most important causes of the stomach and duodenum diseases. The paper reviews the main methods of diagnosing Helicobacter pylori infection.
Key words: Helicobacter pylori, infection, diagnostic methods.
Одной из серьезных проблем в гастроэнтеро логии является хеликобактерная инфекция. Большое значение Helicobacter pylori (НР) играет в развитии таких заболеваний гастродуоденальной зоны, как хронический гастрит, язвенная болезнь, полипоз и рак желудка. Частота инфицирования ИР прогрес сивно возрастает. С момента открытия существо вания данного микроорганизма было разработано множество методов его диагностики, которые по стоянно подвергаются усовершенствованию. Тем не менее, ни один из методов диагностики хелико- бактерной инфекции не является универсальным.
Диагностические возможности различных методик могут ограничиваться возрастом и индивидуальны ми особенностями пациента, стадиями заболевания, чувствительностью, техническим обеспечением, временем проведения, стоимостью. В связи с чем для более точной диагностики наличия ЦР необходимо использование минимум двух методов. Ряд авторов рекомендует использование трех методик для уточ нения отсутствия инфекции [24]. Все многообразие методов обнаружения хеликобактерной инфекции основано на определении собственно Helicobacter pylori (прямые методы) либо продуктов его жизнеде ятельности (косвенные методики) (таб. 1.1) [1, 2].
Таблица № 1.1 Методы диагностики Helicobacter pylori
Прямые Косвенные
Бактериологический метод Уреазный тест
Гистологический метод Серологический метод
Молекулярно-биологический метод исследования биоптатов (полимеразная цепная реакция)
Молекулярно-биологический метод исследования кала (поли меразная цепная реакция)
Фазово-контрастная микроскопия
Иммуногистохимический метод
Также среди большого количества методов диа гностики данного микроорганизма можно выделить инвазивные и неинвазивные (таб. 1.2). Инвазивные методики требуют проведения фиброгастродуо-деноскопии, взятия биопсийного материала и, как правило, используются при прохождении комплекса первичных диагностических мероприятий. Неинва- зивные тесты обнаружения Helicobacter pylori в на стоящее время с учетом современных рекомендаций ведения пациентов с диспепсией приобретают все большую значимость.
_Таблица № 1.2 Методы диагностики Helicobacter pylori
Инвазивные Неинвазивные
Бактериологический метод Иммунологический метод (определение антител к НР в кале, слюне, моче)
Морфологические: -гистологический -цитологический Молекулярно-биологический метод исследования кала, слюны, зубного налета (полимеразная цепная реакция)
Быстрый уреазный тест Дыхательные тесты (уреазный, аммиачный)
Молекулярно-биологический метод исследования биоптатов (полимеразная цепная реакция)
Фазово-контрастная микроскопия
Иммуногистохимический метод
Серологический метод (ИФА)
Наиболее широко распространенными метода ми диагностики НР считаются гистологическое, ги-стобактериологическое и иммуногистохимическое исследование гастобиоптатов и их отпечатков на предметном стекле [3, 9, 12, 19, 21, 22]. В случаях невозможности проведения эзофагогастродуодено- скопии отдается предпочтение неинвазивным мето дикам (дыхательному уреазному тесту, серологиче скому методу, ПЦР). Для контроля эффективности эрадикации оптимальным является применение ды хательных тестов. Альтернативой может служить ис следование кала моноклональными антителами [12].
Инвазивные методики
Бактериологический (культуральный) метод является одним из наиболее информативных и спе цифичных методов. Специфичность его составляет практически 100%, чувствительность более 90% [20, 28, 31]. Данная методика также позволяет определять антибиотикорезистентность ЫР и проводить динами ческие наблюдения за ней, проводить внутривидовое типирование штаммов для дифференциальной диа гностики рецидивирования и реинфекции новыми штаммами [25, 28]. Бактериологический метод при меняется в научной практике для изучения факторов патогенности Helicobacter pylori, изготовления пре паратов серологической диагностики, создания бан ков штаммов для эпидемиологических исследований. Однако данный метод обладает рядом технических сложностей, ограничивающих его применение: от сроченное получение результатов на 7-10 дней, труд ность транспортирования материала для сохранения жизнеспособности микроорганизма, высокие требо вания к условиям культивирования, снижение эффек тивности высевания при низкой обсемененности и отсутствии визуальных признаков воспаления, доро гостоящее оборудование [25]. Недостатком данного метода считается неспособность выявлять кокковые формы Helicobacter pylori [7], тогда как в настоящее время в достаточно высоком проценте случаев у БР -позитивных пациентов в слизистой оболочке желудка преобладают именно кокковые формы возбудителя. В широкой клинической практике данный метод не применяется. Однако в связи с быстрым развитием резистентности НР к антибактериальным препаратам все больше исследователей считают необходимым определение чувствительности перед проведением лечения [16, 26]. Это значительно повышает значи мость бактериологического метода.
Морфологические методы
1) Гистологический метод выявления Helicobacter pylori считается «золотым стандартом» диагностики инфекции. Его специфичность оценива ется как 97%, а чувствительность - 80-90%. Исполь зуя именно этот метод, Warren и Marshall описали на личие спиралевидной бактерии в слизистой оболочке желудка больных активным хроническим гастритом. Взятие биопсийного материала проводится из мест с максимально выраженной гиперемией и отеком. Взя тие материала из дна и краев язв и эрозий является ошибочным, так как в них нет эпителиальных кле ток, необходимых для адгезии и колонизации микро организма. Для повышения чувствительности метода биоптаты рекомендуется брать из разных частей же лудка [20] (таб. 2).
Таблица № 2 Количество биопсийных образцов для диагностики НР
Вид исследования Количество биоптатов
Первичное исследование Антральный отдел вдоль большой кривизны - 2 Средняя часть желудка - 1
Контроль лечения Антральный отдел вдоль большой кривизны - 1 Средняя часть желудка - 2
Исследование биоптатов проводится с исполь зованием различных окрасок (акридиновым оран жевым, красителем Гимзы, серебрением по Варти- ну-Старри). Данная методика позволяет не только с высокой степенью надежности выявить наличие Helicobacter pylori, но и количественно определить степень обсеменения и морфологические изменения слизистой оболочки желудка, связанные с инвазией микроба (признаки воспаления, атрофия, метапла зия, дисплазия). Степень обсемененности слизистой оболочки желудка инфекцией Helicobacter pylori оце нивается методом световой микроскопии по критери ям Аруин Л.И. с соавт. (1993) [2], согласно которым выделяют три степени обсемененности слизистой оболочки: -слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зре ния (при x 630);
-средняя (++) - 20-50 микробных тел в поле зрения; -высокая (+++) - более 50 микробных тел в поле зрения.
К преимуществам этого метода диагностики относятся удобство хранения и транспортировки об разцов, возможность проведения ретроспективно го анализа, проведения оценки взаимосвязи между степенью обсемененности H. pylori и состоянием слизистой оболочки желудка. Недостатками метода являются длительное приготовление парафиновых срезов, некоторая субъективность в определении сте пени изменения слизистой оболочки желудка, невоз можность отдифференцировать виды Helicobacter и тем более их генотип, возможность получения лож- нонегативных результатов в связи с неправильным забором гастробиопсийного материала (биопсия только из антрального отдела желудка, скудные био- птаты, не содержащие эпителия и слизи), а также на личия участков кишечной метаплазии, погрешностей окраски [7].
2) Цитологический метод исследования Helicobacter pylori основан на изучении мазков - от печатков биоптатов, полученных при эндоскопии из участков слизистой оболочки желудка или две надцатиперстной кишки с наиболее выраженными морфологическими изменениями, что позволяет су щественно уменьшить время получения результатов анализа [28]. Микроскопия окрашенных мазков-от печатков позволяет выявить наличие НР и оценить степень обсемененности:
-слабая (+) - до 20 микробных тел в поле зре ния (при x 630); -средняя (++) - 20-50 микробных тел в поле зрения; -высокая (+++) - более 50 микробных тел в поле зрения.
В зависимости от способа получения материала выделяют различные варианты данной методики: раз давливание биоптата (crash cytology), прикосновение и отпечаток люминальной поверхности биоптата к предметному стеклу (imprint или touch cytology), по лучение пристеночной слизи (brash cytology). Мазки высушивают и окрашивают по Романовскому-Гимзе, по Папенгейму или после фиксации метанолазуро-эозиновой смесью. Цитологическое исследование позволяет также выявить наличие пролиферативных процессов, неоплазии, метаплазии, дисплазии, оце нить степень их выраженности. Однако ввиду низ кой чувствительности данной методики (18-20%) данный метод не применяется в странах дальнего зарубежья. Несмотря на существенные ограничения в диагностике Helicobacter pylori, данная методика в нашей стране играет не последнюю роль. Для повы шения его диагностической значимости проводилось сопоставление цитологических препаратов, приго товленных разными способами. Было показано, что brash-способ является наиболее приемлемым. Не обходимо также учитывать, что исследование с не скольких точек повышает диагностическую надеж ность методики. Сарсенбаева А.С., Игнатова Г.Л., Воротникова С.В. предлагают исследовать не менее 4 участков из обоих отделов желудка [20]. В результа те сравнительной оценки различных способов окра ски пришли к выводу о целесообразности использо вания двух методик: окраску мазков слизи по Граму и 0,05% р-ром акридинового оранжевого. Второй способ ограничивается наличием люминесцентного микроскопа и кокковой формой бактерии. Способ окраски по Граму по всем параметрам (простота, специфичность, надежность, доступность реактивов, стоимость) оказался наилучшим. Сарсенбаева А.С., Игнатова Г.Л., Воротникова С.В. предложили для оптимизации цитологического метода исследования свою модификацию окраски по Граму. Если обычно используется 1% р-р генциан- или кристаллвиолета, то в данной модификации р-р должен быть 0,1% и окрашивание проводиться не 1 мин, а 20-30 с. После каждого красителя обязательно нужно ополаскивать препарат проточной водой и осушать фильтроваль ной бумагой или марлевым тампоном. Ряд авторов указывает на то, что диагностическая чувствитель ность цитологического метода может достигать 80 90%, а специфичность - 100% [6, 13]. Предложенные способы выявления НР цитологическим методом в желудочном соке, полученном натощак [4], имеют низкую чувствительность и специфичность, поэтому в настоящее время не применяются.
Быстрый уреазный тест - оценка местной уреазной активности. По современным представле ниям, быстрый уреазный тест вместе с морфологиче ским методом является стандартом для диагностики инфекции БР в желудке [8]. Методика предполагает забор прижизненных биопсийных образцов тканей в ходе выполнения эзофагогастродуоденоскопии. В основу определения уровня желудочной уреазной активности положен специфический механизм жиз недеятельности бактерии Helicobacter pylori - рас щепление мочевины, находящейся в содержимом желудка, ферментом уреазой. В результате реакции образуется аммиак и углекислый газ. Кислотно-ще лочной баланс желудка (рН среды) сдвигается в ще лочную сторону, что фиксируется с помощью инди катора (рис. 1).
Выделение уреазы
рус. i. Схема проведения уреазного теста.
Полученный биоптат помещается в специаль ную ячейку с готовыми растворами. Быстрота изме нения окраски индикатора с желтого на ярко-крас ный зависит от уреазной активности, которая, в свою очередь, зависит от количества бактерий. При малом количестве бактерий изменение окраски в уреазном тесте может произойти через несколько часов. Время появления малинового тона косвенно указывает на количество микроорганизмов:
-малиновое окрашивание к концу суток - (+) незначительная инфицированность; -малиновое окрашивание появляется в тече ние 2 часов - (++) умеренная инфицированность; -малиновое окрашивание появляется в тече ние первого часа - (+++) значительная инфициро- ванность; -малиновое окрашивание не наступает - (-) отрицательный результат.
В настоящее время выпускаются уреазные те сты промышленного производства: «CLO-тест», «Де-Нол-тест», «PyloriTek», «CUT-тест», «ХЕЛПИЛ- тест», «Campy-test» и др. Чувствительность ука занных тестов колеблется от 65 до 95%, специфич ность - от 75 до 100%. В России часто используется уреазный тест, приготовленный, непосредственно, в лаборатории. Этот тест экономичен, надежен, прост в использовании. В российских «Рекомендациях по диагностике и лечению инфекции, вызванной Helicobacter pylori, у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки» [17] приве дена пропись уреазного теста: 2 г мочевины, 10 мл фенолрота (0,5%), 20 мг азида натрия доводят до 100 мл 0,001 М фосфатным буфером, рН 5,5. Сарсенбае- ва А.С., Игнатова Г.Л., Воротникова С.В. [20] пред ложили следующий состав реагентов: мочевина - 2 г, феноловый красный 0,5% - 10 г, 20 мг азида натрия, 0,01 М фосфатный буфер, рН 6,5 - 100 мл. Готовят по обычной рецептуре: 0,001 М фосфатный буфер рН 5,5 разливают по флаконам, стерилизуют при +1210С 15 мин. К охлажденному буферу добавляют мочеви ну - 2 г, раствор фенолового красного и азид натрия (обладающий свойствами консерванта). Цвет реак тива должен быть желто-розовым. При подкислении реактива его цвет меняется на соломенно-желтый, при подщелачивании - на малиновый. Приготовлен ный реактив должен быть соломенно-желтого цвета и может длительно храниться в темной упаковке при температуре +20С-+60С. Процедура выполнения те ста (с 2% мочевиной): поместить 2 капли реагента в пробирки типа эппендорфлпоместить биопсийный материал в первую пробирку, вторая пробирка ис пользуется в качестве контрольнойЛмикропробирки инкубируют при температуре 37°СЛучитывать ре зультат через 20 мин, 1 ч, 3 ч, 24 ч (таб. 3).
Время учета
20 мин 1 ч 3 ч 24 ч
% положительных результатов 75 85 90 95
Последующие модификации быстрого уреазно- го теста дали возможность получения более быстро го результата. При использовании незабуферного раствора мочевины положительный результат реги стрируют в течение 1 мин у 90% больных хелико- бактериозом, подтвержденным бактериологически. Однако этот метод может давать положительные результаты, если результат оценивается позже 1 ми нуты. В связи с этим было предложено использовать 6% раствор мочевины. В этом случае результаты теста учитываются в течение 15 мин. Основное на значение метода - первичная диагностика наличия Helicobacter pylori у пациентов. Чувствительность и специфичность данного метода составляет 98-99% [16]. Преимущество данного метода состоит в том, что он позволяет получить заключение быстро - от нескольких минут до нескольких часов, его исполь зование не предполагает наличие специального лабораторного оборудования или подготовленных специалистов и выполняется непосредственно эндо скопистом, экономичен при массовом и индивиду альном применении. В настоящее время разработано большое количество промышленно изготовленных уреазных тестов. К недостаткам теста относится его инвазивность, получение ложноотрицательных (при малом количестве микробных тел) или ложнополо- жительных результатов (контаминирование матери ала другими
уреазопродуцентами, формами, име ющими близкое сродство с НР — (H.heilmanii), или при появлении кокковых форм НР, не проявляющих ферментативной уреазной активности), а также не возможность оценить состояние слизистой оболочки желудка. Предложение ряда исследователей [15, 18, 30] определять уреазную активность в желудочном соке не нашло применения в клинической практике. Уреазный тест в микроампулах предложен В.Е. Ми- лейко, Т.М. Григорян. В качестве тест-системы для инвазивной биохимической диагностики хеликобак- териоза предлагается герметически запаянная ампу ла, которая содержит 0,05-0,5 мл реакционного р-ра:
-0,05-0,4 мг/л индикатора с цветовым перехо дом в области значений рН от 6,0 до 9,0 - феноловый красный или бромтимоловый синий, нейтральный красный, бромкрезоловый синий;
-дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия (суммарно от 1,5 до 3,0 г/л);
-хлорид аммония, хлорид натрия (калия) от 0,01 до 0,05 г/л суммарно;
-дополнительно можно для увеличения срока хранения - гидроокись серебра.
Для проведения анализа в ампулу помещают биоптат и фиксируют время появления малиновой окраски. Контрольное время составляет 15 мин, 3 ч и 24 ч. Отсутствие изменений цвета более чем за 24 часа свидетельствует об отсутствии НР.
Фазово-контрастная микроскопия - весьма удобный метод обнаружения НР при условии до статочно высокой степени обсемененности: нет не обходимости проводить фиксацию материала и его окраску, результат может быть получен через 1-2 мин. При проведении исследования биоптат поме щается на предметное стекло, измельчается и прово дится микроскопия с помощью фазово-контрастного микроскопа с увеличением в 100 раз с использовани ем иммерсионного масла. В препарате - типичные изогнутые бактерии в хаотичном движении.
Иммуногистохимический метод. Биопсийный материал, фиксированный в формалине и залитый в парафин, обрабатывается моноклональными антите лами против НР. Готовые к применению коммерче ские наборы с моноклональными антителами рабо тают при разведении 1:200000 и избирательно окра шивают только НР. Этот метод диагностики зареко мендовал себя при низкой степени обсемененности и выявления морфологически измененных кокковых форм микроорганизма.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР (от носится к молекулярно-биологическим методам) представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Ме тод ПЦР в средах позволяет идентифицировать НР без выделения чистой культуры по присутствующим в исследуемом материале фрагментам его генома. Метод предназначен для качественного обнаружения ДНК НР в биологических образцах (биоптаты слизи стой оболочки желудка и двенадцатиперстной киш ки, десен, мазки из зубодесневого кармана, слюна). Позволяет оценить генотипические и фенотипиче- ские характеристики возбудителя. Почти у каждого пациента имеется уникальный штамм НР. Выявле но, что вирулентность НР во многом обусловливает клинические проявления инфекции. Существует ряд генов, продукты которых - белки Cag A, Vac A, Ice A, Bab A - считают факторами патогенности. В за висимости от их наличия выделяют два типа штам мов НР. Экспрессирующие Cag A-, Vac A-токсин относят к первому типу, штаммы второго типа не экспрессируют указанные гены и считают менее па тогенными. Различают электрофоретические методы детекции ПЦР-амплифицированной ДНК и методы ДНК-гибридизации. Электрофоретический метод детекции продуктов амплификации самый простой в исполнении, но является в настоящее время уста ревшим ввиду невозможности автоматизации и труд ности количественной оценки [11]. Среди большого разнообразия гибридизационных методов анализа ДНК метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике. Регистра ция гибридизации осуществляется микропланшет ным флуориметром, а оценка результата проводится автоматически специальной компьютерной програм мой. В настоящее время эта методика широко ис пользуется в практическом здравоохранении, службе госсанэпиднадзора и для научных исследований. На учно-производственной фирмой «Литех» при НИИ физико-химической медицины МЗ РФ выпускаются наборы реагентов для определения ДНК НР в биоп- сийном материале: «Хеликопол», «ПлаТАн» и др.
Неинвазивные методики
Дыхательные тесты
1) Уреазный дыхательный тест. На уреазной активности НР основаны радионуклидные методы диагностики инфекции (неинвазивные и косвенные) - это уреазные дыхательные тесты с мочевиной, ме ченной изотопами 13С и 14С [23]. В 1987 г. D. Graham и соавт. [27] опубликовали данные о первом методе с использованием меченной 13С мочевиной для опре деления Campylobacter pylori в СОЖ. Меченая мо чевина дается пациенту в составе пробного завтра ка. Уреаза НР разлагает мочевину до углекислого газа, сохраняющего меченый углерод. Углекислый газ с кровотоком доставляется в легкие и выводит ся с выдыхаемым воздухом. Пациент делает выдох в специальную пробирку-контейнер, и пробу воз духа
14
направляют на анализ. С-радиоактивный изо топ, который является источником низкоэнергети ческих бета-частиц. Его использование имеет ряд ограничений и подчиняется строгому контролю, поэтому данный вариант менее распространен. Для регистрации приращения 14СО2 в выдыхаемом воз духе используют сцинтилляционный счетчик. Изо топ 13С нерадиоактивен, может быть количественно определен с помощью газового масс-спектрометра или инфракрасного либо лазерного оборудования. Масс-спектрометры
применяются наиболее широко. Поскольку для дыхательного теста не требуется про ведения эзофагогастроскопии, этот метод применим у пациентов, которым она противопоказана. Дыха тельный тест с изотопом 13C может быть использован для обследования детей, при эпидемиологических исследованиях больших контингентов населения. Этот тест дает представление обо всей СОЖ, а не об отдельном ее фрагменте. Его чувствительность до стигает 99%, а специфичность - 98% [10, 16, 29]. В начале исследования берутся 2 фоновые пробы вы дыхаемого воздуха. Далее пациент съедает легкий завтрак и тестовый субстрат (водный р-р мочевины, меченой 13С) в течение 1 часа, с интервалами в 15 минут, у него берут 4 пробы выдыхаемого воздуха. Уровень радиоактивного изотопа в выдыхаемом воз духе определяют в течение 10-30 минут. Затем про бирки направляются на масс-спектрометрию. Выра жается как приращение 13СО2 - 513СО2 его экскреция (%о) и считается положительной при значениях выше 5%о [5]. В ряде стран используется определение изо топного отношения концентраций 13СО2/12СО2, что позволяет свести к минимуму влияние на конечный результат методических и инструментальных по грешностей. При использовании дыхательного уре-азного теста ложноположительные результаты счи таются редкими (4-10%). Ротовая полость и глотка могут быть колонизированы уреазапродуцирующи- ми бактериями, что и обусловливает ошибочный от вет теста. Ложноотрицательные результаты возмож ны у пациентов, принимавших перед исследованием антисекреторные и висмутсодержащие препараты, которые ингибируют уреазу бактерий, в связи с чем рекомендуется осуществлять диагностику эрадика- ции уреазными методами не ранее чем через месяц после приема этих препаратов. Противопоказаниями для уреазного дыхательного теста являются кровото чащие язвы, атрофический гастрит, MALT-лимфомы. Метод быстрый, удобный, но ограничен в распро странении из-за необходимости использовать доро гостоящее оборудование и изотопные препараты. По скольку уменьшение стоимости изотопа невозможно, были предложены варианты масс-спектрометров на основе лазерного и инфракрасного излучения, стои мость которых существенно ниже. С другой стороны, использование микрокапсул для упаковки мочевины, меченной радиоактивным изотопом, позволило све сти к минимуму трудности, связанные с хранением, утилизацией и безопасностью данного изотопа. В США продажа микрокапсул с мочевиной, меченной углеродом, разрешена FDA наравне с обычными ле карственными препаратами через аптечную сеть, что является свидетельством полной безопасности данного изотопа для обследуемых и окружающей среды. Появление такой формы меченой мочевины существенно повышает конкурентоспособность этой методики, т. к. стоимость и самого изотопа, и обору дования для его проведения в среднем меньше в 10 раз, чем масс-спектрометра.
2) Аммиачный дыхательный тест. В Санкт- Петербурге разработан неинвазивный метод «Хелик- тест». Образующийся аммиак измеряют линейно-ко лористическим методом в воздушной среде ротовой полости пациента. Набор для проведения теста со стоит из одноразовой трубки и прибора - ирриго- аспиратора. Индикаторная трубка ИТМ-12 - стекло- дрот, заполненный индикаторным составом (на мел кодисперсный силикогель нанесён бромфеноловый синий совместно с серной кислотой), при прохожде нии через него воздуха, содержащего аммиак, цвет индикатора меняется на фиолетовый. Воздух в объ ёме 2 литров в течение 10 мин просасывается через вскрытую трубку, а затем определяется концентрация аммиака в мг/м3 по шкале учёта величины окрашен ного столбика. Пороговой концентрацией аммиака, диагностически значимой для НР-инфицирования, считается 0,4 мг/м3 и прирост после нагрузки карба мидом 500 мг в 10 мл воды - 0,2 и более. Уровень ам миака может зависеть от азотистого обмена у паци ента, функционального состояния печени, активно сти других уреазопродуцентов ЖКТ. По сравнению с зарубежными углеродными тестами, Хелик-тест, обладая столь же высокой чувствительностью, тре бует значительно меньшего времени исследования (20 мин), имеет несравнимо меньшую стоимость, не нуждается в приеме изотопов измененного состава и позволяет получить результат непосредственно в ходе исследования. Хелик-тест может быть использо ван как для первичной диагностики НР и скрининга, так и для динамического наблюдения за больным и оценки эффективности терапии.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Неодно кратные попытки разработки неинвазивного метода диагностики НР на основе метода ПЦР увенчались успехом. На базе научной лаборатории НПФ «ЛИ- ТЕХ» был разработан тест для диагностики хелико- бактерной инфекции в кале. Чувствительность дан ного метода составила 61-93,7%, специфичность - 100% [10]. Преимущество данной методики состоит в неинвазивности, простоте и быстроте выполнения (на постановку 30 исследований необходимо 4,5-5 часов), относительно низкой себестоимости по срав нению с ИФА и возможности использования не толь ко для первичной диагностики, но и для эпидемио логических исследований. Недостатки связаны со снижением чувствительности методики у взрослых в связи с более длительным пассажем каловых масс по кишечнику и разрушением ДНК НР, а также низкой специфичностью теста на ранних этапах после про веденной антихеликобактерной терапии.
ИФА - метод диагностики НР-инфекции, са мый подходящий метод для эпидемиологических исследований и скрининга. Через 3-4 недели после инфицирования хеликобактериями слизистой обо лочки желудка и двенадцатиперстной кишки в крови больных появляются антитела к хеликобактериям. Эти антитела определяются путем иммунофермент- ного анализа. Выявляют антитела IgG, IgA, IgM- классов в крови и секреторные sIgA, sIgM в слюне и желудочном соке. Поскольку инфекция является хро нической, то положительные серологические тесты указывают на наличие текущей инфекции. Несмо тря на то, что уровень антител в процессе успешной эрадикации падает, серологическая реакция остается положительной в течение ряда лет. Это ограничива ет возможности исследования крови для оценки эф фективности лечения или для
диагностики наличия у больного НР. Однако быстрое падение уровня анти тел косвенно может указывать на санацию слизистой оболочки желудка. Имеется несколько модификаций этого теста: ELISA (ферментный иммуносорбент- ный метод), реакции фиксации комплемента, бакте риальной и пассивной гемагглютинации. Классиче ский иммуноферментный анализ с количественным определением в сыворотке или плазме крови боль ных антихеликобактерных антител разных классов характеризуется высокой чувствительностью и спе цифичностью, в пользу чего свидетельствуют срав нительные исследования наборов для проведения та ких анализов, выпускаемых различными производи телями. Преимуществом метода ИФА является мень шая травматичность по сравнению со всеми другими методами, где нужно получение биоптата слизистой оболочки желудка. Кроме того, для анализа требуется несколько микролитров сыворотки, в оборудованной лаборатории можно одновременно выполнить десят ки исследований и получить результаты в короткие сроки (2,5-3 ч). Данный метод идеален для первичной диагностики, так как при высокой чувствительности и специфичности (более 90% по сравнению с инва- зивными методами, включая ПЦР) он на сегодняш ний день самый дешевый. Увеличение чувствитель ности и специфичности метода, вследствие совер шенствования технологии, позволило применить его для диагностики эрадикации через 3 месяца [20], а по результатам некоторых исследований - через 1,5-2 месяца [5]. Использование же высокочувствительных наборов, в основу которых положен непрямой ИФА с применением антигена Н. pylori, меченого биотином (набор для ИФА «HELICONS-AB IgG» (Италия)), позволяет зафиксировать снижение концентрации специфических антител уже через 30-40 дней после окончания успешного лечения [20] и таким образом укладывается в сроки оценки эрадикации, принятые для инвазивных методов и дыхательного теста. Без условной сенсацией 1998 года явилось появление на рынке теста для количественного определения анти гена НР в фекалиях больных с помощью ИФА. Этот высокочувствительный и специфичный тест может применяться как при первичной диагностике хелико- бактерной инфекции, так и для контроля лечения, а также прогнозирования эффективности антихелико- бактерной терапии. Однако применение в клиниче ской практике данного метода ограничено его высо кой стоимостью по сравнению с другими методиками диагностики хеликобактериоза.
Иммуноблотинг существенно уступает другим иммунологическим методам как по стоимости, так и по трудоемкости выполнения анализа, однако только с его помощью можно, имея лишь сыворотку крови больного, получить данные о свойствах штамма НР - продуцирует ли он CagA и VacA.
Сухой уреазный тест, аналог «Хелпил-теста», был предложен В.Е. Милейко и Т.М. Григорян [14]. Тест на твердом пористом носителе выполнен в виде бумаги, разрезанной на тест-билеты, которые содер жат карбамид и индикатор бромтимоловый синий. Для оценки уреазной активности тест-билет смачи вают слюной и в течение 3 минут регистрируют по явление индикационного эффекта - синего пятна на желтом фоне. О степени уреазной активности сви детельствуют скорость появления пятна, диаметр и интенсивность окраски. Окрашивание теста вокруг смоченного участка шириной до 1 мм расценивает ся как 1-я степень, 1-2 мм - 2 степень, более 2 мм - 3 степень уреазной активности. Время проведения теста 3-5 минут. У курящих тест на основе чувстви тельных рН-индикаторов при смачивании слюной окрашивается в результате высокой щелочности слю ны в 95% случаев и не позволяет судить об уреазной активности слюны в требуемом интервале рН. Таким образом, данный тест может ограниченно использо ваться для оценки уреазной активности слюны с це лью диагностики хеликобактерной инфекции.
Заключение
В соответствии с российскими стандартами для диагностики хеликобактериоза необходимо исполь зовать одновременно не менее 2 тестов. Это обуслов лено тем, что практически ни один из применяемых методов не обладает 100% чувствительностью. В научных целях проводятся сравнение 3-4 методов, ос нованных на различных эффектах. Серьезность забо леваний, вызываемых хеликобактериями, ставит на повестку дня необходимость поиска эффективных, рациональных, неинвазивных, экономичных методов выявления инфицирования НР. Само по себе выявле ние Helicobacter pylori в слизистой оболочке не всег да свидетельствует о наличии заболеваний желудка или двенадцатиперстной кишки, ассоциированных с этим инфекционным агентом. Обсеменение сли зистой оболочки может встречаться и у совершенно здоровых людей, генетически невосприимчивых к Helicobacter pylori, у которых бактерия не способна к адгезии на эпителии. Значение имеют случаи со четания инфицирования Helicobacter pylori и харак терных эндоскопических признаков хронического антрального гастрита, пангастрита, хронического активного дуоденита, язвенной болезни желудка и яз венной болезни двенадцатиперстной кишки.
Список литературы
1.Авалуева Е.Б., Ткаченко Е.И. Язвенная болезнь (краткое изложение состояния проблемы на современном этапе) // Terra Medica. 2007. № 4. С. 3-9.
2.Хронический гастрит / Л.И. Аруин [и др.]. Ам стердам, 1993. 362 с.
3.Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфо логическая диагностика болезней желудка и кишечника. М: Триада-Х, 1998. 496 с.
4.Баженов Л.Г., Ходжаева Н.У, Садыков Р.А., Саид- ханов Б.А. // Клиническая лабораторная диагностика. 1993. № 5. С. 19-22.
5.Барышникова Н.В. Актуальные проблемы диа гностики хеликобактериоза // Экспериментальная и клини ческая гастроэнтерология. 2009. № 2. С. 50.
6.Гребенев А.Л., Лапина Т.Л., Склянская С.А. и др. // Клиническая лабораторная диагностика. 1995. № 6. С. 104-105.
7.Ильчишина Т.А. Особенности лабораторной диа гностики Helicobacter pylori и клинического течения хро нического гастрита и язвенной болезни при бациллярно- кокковом дисморфизме бактерии // Дис... канд. мед. наук: 14.00.46, 14.00.47. СПб., 2008. 136 с.
8.Исаков В.А., Домарадский И.В. Хеликобактериоз. М.: ИД Медпрактика-М, 2003. 412 с.
9.Калинин А.В. Хронический гастрит. В кн.: Гасто- энтерология и гепатология: диагностика и лечение / Под ред. А.В. Калинина и А.И. Хазанова. М.: Миклош, 2007. 59-69 с.
10.Кишкун А.А. Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori // Клиническая лабораторная диагности ка. 2002. № 8. С. 41-46.
11.Helicobacter pylori - инфекция: современные аспекты диагностики и терапии. Пособие для врачей / Л.В. Кудрявцева [и др.]. - М., 2004.
12.Леонтьева Н.И. [и др.]. Оценка инвазивных и не- инвазивных методов диагностики хеликобактерной инфек ции // Современные технологии в медицине. 2011. № 2. С. 57-60.
13.Логинов А.С., Аруин Л.И., Ильченко А.А. Язвен ная болезнь и Helicobacter pylori. Новые аспекты патогене тической терапии. М., 1993. 230 с.
14.Методы диагностики хеликобактериоза: учебное пособие / под ред. А.В. Козлова, В.П. Новиковой. СПб.: Из дательство «Диалект», 2008. 88 с.: ил.
15.Москвич Ц.Г., Соколовский В.В., Пак С.Ф. // Кли ническая медицина. 1989. Т. 67. № 1. С. 80-81.
16.Практическое руководство Всемирной организа ции гастроэнтерологов (ВОГ/OMGE) Helicobacter Pylori в развивающихся странах / R.H. Hunt, S.D. Xiao, F. Megraud, R. Leon-Barua, F. Bazzoli, S. van der Merwe and other [Электронный ресурс]. URL: http://www. omge.org /assets/ downloads/ru/pdf/guidelines/gdata15ru.pdf.
17.Рекомендации по диагностике и лечению инфек ции Helicobacter pylori у взрослых при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Российский жур нал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1998. № 1. С. 105-107.
18.Рожавин М.А., Сологуб В.В., Микитюк И.Б. // Журнал микробиологии. 1989. № 1. С. 111-112.
19.Ройтберг Г.Е., Струтынский А.В. Внутренние бо лезни. Система органов пищеварения. М: МЕДпресс-ин- форм, 2007. 560 с.: ил.
20.Сарсенбаева А.С. Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori: Учебное пособие / А.С. Сарсенбаева, Г. Л. Игнатова, С.В. Воротникова. Челябинск, 2005. 50 с.
21.Циммерман Я.С. Клиническая гастроэнтеро логия: избранные разделы. М: ГЭОТАР-Медиа, 2009. 416 с.: ил. 22.Чернин В.В. Болезни пищевода, желудка и две надцатиперстной кишки. М: ООО «Медицинское инфор
мационное агентство», 2010. 528 с.
23.Atherton J.C. // Aliment. Pharmacol. Ther. 1997. Vol. 11. Suppl. I. P. 11-20.
24.Bermejo San Jose F., Boixeda de Miguel D., Gisbert J. et al. Efficacy of four widely used techniques of the diagnosis of Helicobacter pylori infection in gastric ulcer disease // Rev. Clin. Esp. 2000. Vol. 200. P. 475-479.
25.Fallahi G.H., Maleknejad S. Helicobacter pylori culture and antimicrobial resistance in Iran // Indian J. Pediatr. 2007. Vol. 74. № 2. P. 127-130.
26.Glupczynski Y. // Acta Gastroenterol. Belg. 1998. Vol. 61. P. 321-326.
27.Graham D.Y., Klein P.D., Evans D.J. et al. // Lancet. 1987. Vol. 1. № 8543. P. 1174-1177.
28.Hirschi A.M., Makristathis A. Methods to detect Helicobacter pylori: from culture to molecular biology // Helicobacter. 2007. Vol. 12. suppl. 2. P. 6-11.
29.Logan R.P.H. // Helicobacter pylori and Gastro- duodenal Disease / Eds B.J. Rathbone, V.R. Heartley. 2-nd Ed. - Oxford. 1992. P. 88-107.
30.Marshall B.J. // Hosp. Pract. 1987. Vol. 22. № 8. P. 87-96.
31.Pellicano R., Smedille A., Ponzetto A. et al. How accurate is the culture of Helicobacter pylori in a clinical setting? // An appraisal. Panminevra Med. 2005. Vol. 47. № 3. P. 191-194.
Сведения об авторах
Шамсутдинова Рушанья Агзамовна - Киров ская ГМА, кафедра пропедевтики внутренних болез ней и профессиональных болезней, ассистент; раб. тел.: 23-25-47, e-mail: [email protected];
Чепурных Асия Ярулловна - Кировская ГМА, кафедра пропедевтики внутренних болезней и про фессиональных болезней, к.м.н., зав. кафедрой;
Савиных Елена Александровна - Кировская ГМА, кафедра пропедевтики внутренних болезней и профессиональных болезней, к.м.н., доцент;
Коновалова Надежда Валентиновна - Киров ская ГМА, кафедра пропедевтики внутренних болез ней и профессиональных болезней, ассистент; раб. тел.: 23-25-47;
Бикметова Анна Владимировна - Кировская ГМА, кафедра пропедевтики внутренних болезней и профессиональных болезней, ассистент; раб. тел.: 23-25-47.
