CC BY
28
4. Matolinets O. Solovodzinska I., Yastremska S.Condition of endogen intoxication, immune system and processes of free radical oxidation in different age group animals. //Tethes of III International Medical Congress of students and young scientists. - Ternopol. - 1999. - P. 315.
5. Pilipiv I. I. Metabolical reactions of heifer's bodies under the high conditions of cadmium and zinc // Materials of international science-research congress, 8-10 October 2003r. - Chernivtsi, 2003. - P. 54-55.
6. Standards and ration feeding farm of animals: a handbook / [ed. A. V. Kalashnikov, N. I. Kleimenova etc.]. - M .: Agropromizdat, 1985. - 352 p.
Стаття надшшла до редакци 13.03.2015
УДК 636.52/58.087.8:612.1
Ei6eH I.A., к. вет. н., доцент E-mail:[email protected]
Днтропетровський державный аграрно-економ^чнийутверситет, м. Днтропетровськ
1НДИКАЦ1Я ТА 1ДЕНТИФ1КАЦ1Я СПОРОНОСНИХ БАКТЕР1Й 3 ПРОБЮТИЧНОЮ ПОТЕНЦИЮ
3 фекалт здоровых тдсвынюв та oô'eKmie зовмшнього середовыща рутыннымы методамы булы !зольовам 12 культур стних бацыл у чыстому вигляд1 та вивчем ïx основт б1олог1чм властивост1. Пры цъому тыьки dei культуры булы повтстю апатогент, у ных булы eidcymm ферменты namozennocmi - гемол1зыны та лецыт1наза, а пры зараженм, у лабораторных теарын тфекцтна патолог1я не розеыеаласъ.
Культуры бацыл володты тыпоеымы для еыду морфо-тынктор1альнымы, кулътуралънымы та б1ох1м1чнымы еластыеостямы, на nidcmaei чого 3zidno короткого еызначныка бактер1ы Бердж1 булы 1дентыф1коваш як Bacillus subtilis i зареестроват як штамы BI-9 i BI-12. Культуры депоноват i проводиться процедура патентуеання та паспортызацИ'.
Депоноват штамы стных бацыл проявылы выражену антагошстычну актывшстъ щодо широкого кола патогенных i умовно-патогенных м1крооргашзм1в та можутъ буты выкорыстам як основа для створення проб1отычных npenapamie.
Ключовг слова: Bac. subtilis, проб1отычм культуры, антагомстычна актывн1сть, транзыторна мтрофлора, б1олог1чм властывост1, сттюстъ до антыб1отыкорезыстентн1сть
УДК 636.52/58.087.8:612.1
Бибен И. А., к. вет. н., доцент
Днепропетровский государственный аграрно-экономыческыйуныверсытет,
г. Днепропетровск
ИНДИКАЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ СПОРОНОСНЫХ БАКТЕРИЙ С ПРОБИОТИЧЕСКИМИ ПОТЕНЦИЯМИ
Из фекальных масс ы объектов внешней среды рутыннымы методами были изолированы 12 культур сенных бацилл в чистом виде и изучены их основные свойства. При этом только две культуры были полностью апатогенны, а именноу них отсутствовали ферменты патогенности - гемолизины и лецитиназа, и при заражении лабораторных животных не возникала инфекционная патология.
314
Культуры бацилл обладали типичными для вида морфо-тинкториалъными, кулътуралъными и биохимическим свойствами, на основании чего согласно ключа краткого определителя бактерий Берджи были идентифицированы как Bacillus subtilis и зарегистрированы как штаммы BI-9 и BI-12. Культуры депонированы и проводится процедура патентования и паспортизации.
Депонированные штаммы сенных бацилл проявили выраженную антагонистическую активность в отношении широкого круга патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и могут быть использованы как основа для создания пробиотических препаратов.
Ключевые слова: Bac. subtilis, пробиотические культуры, антагонистическую активность, транзиторная микрофлора, биологические свойства, устойчивость к антибиотикам, антибиотикоустойчивость
UDC 636.52/58.087.8:612.1
Biben I.A. Ph.D, Associate Professor, e-mail: [email protected]
Dnepropetrovsk State Agrarian-economics University, Dnepropetrovsk
INDICATION AND IDENTIFICATION OF SPORE-FORMING BACTERIA WITH PROBIOTIC POTENCY
Of fecal and environmental objects routine methods were isolated 12 culture bacillus in pure form and study their basic properties. However, only two crops were completely nonpathogenic, namely they have no enzymes pathogenicity - hemolysin and lecithinase, and infection of laboratory animals emerging infectious pathology.
Culture bacilli had typical type of morpho-tinctorial, cultural and biochemical properties, whereby according to a key determinant of short Burgi bacteria were identified as Bacillus subtilis strains and registered as BI-9 and BI-12. Culture deposited and held patents and certification procedure.
Deposited strains hay bacillus showed pronounced antagonistic activity against a wide range of pathogenic and conditionally pathogenic microorganisms and can be used as a foundation for probiotics.
Key words: Bac. subtilis, probiotic cultures, antagonistic activity, transient microflora, biological properties, resistance to antibiotics
Вступ. Пробютики - це бюиреиарати, виготовлеш з живих антагонютично активных бактерш, представниюв нормально! або резидентно! мшрофлори -лактобактерп, б1фщобактерп, кишкова паличка, аерококи, сапрофит спороносш бактери. За сукупнютю ф1зюлого-бюх!м1чних властивостей i фактор1в бюлопчно! активносп перспективними для створення пробютиюв з нешд1генно! мшрофлори виявилися бацили, що вщносяться до вид1в Bac. subtilis, Bac. cereus, Bac. megaterium. U,i види сапроф1тних бацил-антрако!д1в мають виражеш антагошстичш властивосп вщносно р1зних м1кробюценоз1в, стабшьно видшяються з р1зномаштних бютошв, у тому числ1 з орган1зму i тканин теплокровних тварин, а також комах i рослин [1, 2, 4, 5, 7].
MiKpo6ionori4Hi та б1отехнолог1чн1 досл1дження, щодо використання живих м1кробних сапроф1тних культур з проб1отичними потенц1ями з роду Bacillus для профшактики i лшування шлунково-кишкових захворювань у молодняка сшьськогосподарських тварин, мають важливе науково-практичне значения. Виявлено здатн1сть бацил и1двищувати ¿муштет до ¿нфекц1йних захворювань, так як вони шдукують синтез ендогенного штерферону за иерорального застосування. Продукти бюсинтезу м1кробних культур саироф1тних бацил-антрако!д1в являються
315
нативними стимуляторами росту молодняку, оптим1зують м1кроб1альний склад товстого вщдшу кишечника [1, 3-5, 8, 11].
Важливим для науки i практики ветеринарно! медицини е питания про бюлопчш властивосп сапроф1тних бацил-антрако1дав, що ¿золюють з об'екпв живо! та неживо! природи у зв'язку з вивченням мехашзму ïx впливу на макрооргашзм як пробютичних культур. Це необхщно для створення ефективних лшувально-профшактичних препарата, оскшьки пробютичш бацили проявляють антагошстичш властивосп по вщношенню до р1зних м1крооргашзм1в та гриб1в, при цьому найбшьша бюлопчна активнють вщзначаеться у пробютичних культур Bacillus subtilis [4, 5, 7, 9, 10].
Мета роботи: видшити з об'екпв живо! i неживо! природи сшешш бацили i вивчити ïx морфо-тинктор1альш, культуральш, 6ioxiMÎ4Hi властивосп, антибютикостшюсть i антагошстичну активнють.
Матер1ал i методи. 1ндикащю та щентифшащю культур спороносних бактерш проводили шляхом вис1ву дослщного матер1алу на чашки Петр1 з щшьним поживним середовищем, пос1ви помщали в термостат за 37-38 0С на 18-24 год, переглядали, готували мазки i фарбували ïx за Грамом, видшяли культури спороносних бактерш [6].
В якосп поживних середовищ використовували МПА, МПБ, модифшовану середу гауз № 2, МПА з додаванням 7 % NaCl, 5 % кров'яний МПА для визначення гемол1тичних властивостей, яечний бульйон для тестування лецитшазно1 активносп, казешовий i крохмальний агар для визначення ферментативних властивостей.
EioxiMÎ4Hi властивосп бацил визначали на середовищах Олькеницького з шдикатором бромтимоловим сишм i карбопдратами - глюкозою, ксилозою, маштом, сахарозою, мальтозою, салщином i ескулшом.
Утил1защю цитрату i пропюнату тестували на середовищ! Козера, здатнють вщновлювати штрати - в бульйош з штратами, визначення в середовищ! ацетону (реакщя Фогеса-Проскауера) проводили на середовищ! Кларка. Здатнють продукувати с1рководень вивчали на середовищ! Кл1глера; каталазну активнють виявляли в реакцп з 3 % Н202; здатнють культур виробляти шдол - на поживному бульйош з шдикатором; фермент уреазу - на середовищ! з сечовиною (по Крютенсену).
Антагошстичну активнють тестували методом вщстроченого антагошзму по вщношенню до патогенних i умовно патогенних бактерш.
Статистичну обробку цифрового матер1алу проводили за загальноприйнятими методиками.
Результати дослщження. Експериментальш дослщження з шдикацп та щентифшацп сапроф1тних пробютичних культур Bac. subtilis i3 об'екпв зовшшнього середовища та вщ здорових шдсвинюв, а також вивчення бюлопчних характеристик сшних бацил проводили у НДЦ бюбезпеки та еколопчного контролю pecypciß АПК Дншропетровського ДАЕУ i бактерюлопчному вщдш Дншропетровсько1 ДЛВМ.
Видову належнють ¿зольованих культур бацил-сапрофтв здшснювали зпдно загальноприйнятих методик по ключу короткого визначника бактерш Бердж1 за сукупшстю базисних характеристик.
Культуральш властивосп сшних бацил вивчали при nocißi м1кроб1в на щшьну елективну середу гауз №2 при цьому виявили три вар1анти структурування колонш, а саме: - округл1, велию, з р1вними краями, випукт, куполопод1бш, матов1,
316
зернисп, шорстю колони, а також зернисп колони з виступаючим центром; -амебопод1бно1 форми з хвилястими краями, зморшкуват1, плосю, шорстю колони; -округл1, випукш, куполопод1бш, шорстю колони з хвилястими краями.
Yci три морфолопчних вар1анти колонш були CBirao-ciporo кольору i синтезували тгмент вщ бежевого до рожевого вщтшюв.
За свп-лово! мшроскопи шд ¿мераею у препаратах-мазках забарвлених за Грамом виявили Г+ стрептобацили та поодиною кттини розм1ром 2,8-3,2 х 0,6-0,8 мкм з ендоспорами.
3 ycix ¿зольованих культур бацил-антракощв тшьки дв1 не володши факторами патогенносп (гемол1тичною та лецитшазною актившстю), тому i'x обрали для подальших дослщжень i зареестрували в музе! культур як штами BI-9 i BI-12 Bac. subtilis.
Ф1зюлого-бюх1м1чш властивосп непатогенних культур сшних бацил-антрако1дав були типовими для виду та характеризувалися рухливютю, здатшстю утил1зувати глюкозу, ксилозу, ман1т, сахарозу, мальтозу, пдрол1зувати ескул1н i крохмаль, не утил1зували лактозу i сал1цин, не утворювали газ при розщепленн1 глюкози. Штами мали здатн1сть до росту на середовищах з 7% NaCl i цитрату, в1дновлювали н1трати, яю не продукували ¿ндол, с1рководень i фермент уреазу, не утил1зували прошонат, г1дрол1зований крохмаль та казе!н, а також розрщжували 10 % желатину. У штам1в не виявлено патогенних властивостей, про що св1дчить вщсутшсть гемол1тично! та лецит1назно! активност1.
Антагошстичш потенц1! культур с1нних бацил-антрако1д1в вивчали в досл1дах in vitro за методом вщстроченого антагон1зму в1дносно патогенних та умовно-патогенних м1крооргашзм1в. Встановили, що досл1дн1 культури мали високу антагон1стичну активн1сть щодо широкого спектра бактопатогешв, при цьому величина зони затримки росту (cnoci6 рад1альних штрих1в) становила (M ± m в мм) у штам1:
- BI-9 щодо Staphilococcus aureus 209 - 25 ± 4; Staphilococcus epidermidis 22 ± 3; Staphilococcus saprophiticus - 25 ± 4; Salmonella typhimurium - 13 ± 3; Salmonella enteritidis - 14 ± 4; Salmonella gallinarum-pullorum - 16 ± 4; Shigella sonnei - 12 ± 2; Esherichia coli - 28 ± 3; Proteus vulgaris - 29 ± 4. Proteus mirabilis -19 ± 2; Pasteurella multocida subsp. gallinarum - 18 ± 4; Candida albicans - 26 ± 4;
- BI-12 у вщношенш Staphilococcus aureus 209 - 26 ± 4; Staphilococcus epidermidis - 24 ± 3; Staphilococcus saprophiticus - 26 ± 4; Salmonella typhimurium - 14 ± 3; Salmonella enteritidis - 17 ± 4; Salmonella gallinarum-pullorum - 18 ± 4; Shigella sonnei - 12 ± 2; Esherichia coli - 26 ± 3; Proteus vulgaris - 30 ± 4. Proteus mirabilis - 22 ± 2; Pasteurella multocida subsp. gallinarum - 26 ± 4; Candida albicans - 28 ± 4.
Методом сершних розведень визначили чутливють проб1отичних бацил до найпоширешших антиб1отикам, у робот1 використовували пен1цил1н, стрептом1цин, канам1цин, амп1цил1н, доксициклш.
Добова культура Bac. subtilis штам BI-9 була ст1йка до антибютиюв в наступн1й концентрац11: пен1цил1ну - 1,4 мг; стрептом1цину - 0,9 мг; канам1цину -1,6 мг; ампщилшу - 1,1 мг; доксициклшу - 1,6 мг.
Добова культура Bac. subtilis штам BI-12 була стшка до антибютиюв в наступит концентрацй': пен1цил1ну - 1,5 мг; стрептомщину - 0,8 мг; канамщину -1,5 мг; амп1цил1ну - 1,2 мг; доксициклшу - 15 мг.
Отримаш результата вказують, що культура Bac. subtilis штам BI-12 проявляе виражену антагон1стичну активн1сть до широкого спектру патогенних i умовно-
317
патогенних м1крооргашзм1в, проявляючи при цьому незначну стшюсть до найбшьш поширених антибютиюв.
У 6ionpo6i на бших мишах живою масою 18-20 г (n=6) за шдшюрного та внутршньочеревного заражения добовою бульйонною культурою у доз1 1,0 см3 шяких патолопчних змш уиродовж 14 д1б сиостереження не виявили, що свщчить про бюбезпеку дослщних культур сшних бацил.
Висновки.
1. 1з об'екпв зовшшнього середовища свиноферми та фекалш здорових шдсвинюв були ¿зольоваш 12 культур сапроф1тних бацил-антрако1дав, щентифшованих як Bacillus subtilis, з яких дв1 культури володши пробютичними потенщями та були депоноваш як штами BI-9 i BI-12 шд1генно! транзиторно! резидентно! м1крофлори.
2. Культури Bac. subtilis штами BI-9 i BI-12 мали типов1 для виду базисш характеристики, проявляли виражений протим1кробний антагошзм вщносно представниюв кишкового мшробюценозу та незначну стшюсть до антиб1отик1в, були 61ох1м1чно активними, не волод1ли факторами патогенносп та не викликали ¿нфекц1йно1 патологи в 6ionpo6i на б1лих мишах.
Перспективы подальших досл1джень полягають у використанш культур Bac. subtilis штам1в BI-9 i BI-12 як основи при створенн1 проб1отичних препарат1в, в результат! i'x вираженою антагон1стично! активносп в1дносно патогенних i умовно-патогенних м1кроорган1зм1в.
Л1тература
1. Авдос'ева I.K. Вплив нового в1тчизняного проб1отика «Бюнорм П» на еффективн1сть вакцинацИ проти в1русних хвороб бройлер1в / I.K. Авдос'ева, В.В. Регенчук, О.Б. Басараб та ¿н. [Текст] // Ветеринар1я. - 2011. - № 10(107). - С. 12-14.
2. Апатенко В. Багатор1внева структура параз1тоценоз1в в шфекцшнш патологй' / В. Апатенко [Текст] // Ветеринарна медицина Украши. - 2001. - № 9. -С. 16-17.
3. Бессарабов Е. Опыт применения микродисперсной формы пробиотика «Лактобифадол» курам / Е. Бессарабов [Текст] // VI Международный ветеринарный конгресс по птицеводству, 26-29 апреля 2010 г. - М. - С. 158-163.
4. Осипова И.Г. Споровые пробиотики / И.Г. Осадчая, Н.А. Михайлова, И.Г. Сорокулова и др. [Текст] // Журн. микробиол. - 2003. - № 3. - С. 113-119.
5. Коршунов В.М. Влияние пробиотиков и биотерапевтических препаратов на иммунную систему организма-хозяина / В.М. Коршунов [Текст] // Педиатрия. -2002. № 5. - С. 92-95.
6. Методические рекомендации по изучению биологических свойств бактерий рода Bacillus. - М., 1998.
7. Тришина Н.В. Связь между развитием дисбактериоза кишечника и состоянием антиэндотоксинового иммунитета: Автореф. дис. канд. мед. наук. -Москва, 2003. - 24 с.
8. Bansal S. Probiotics in health and diseasts / S. Bansal [Text] // J. Assoc. physicians. - 2001. - № 7. - P. 734-741.
9. Buchell M.E. A physiological model for of erythromycin production in bath and cyclyc fed bath culture / M.E. Buchell, J. Smith, H.C. Lynch [Text] // Microbiology. -1997. - Vol. 143, № 2. - P. 475-480.
10. Factorial correspondence analysis of fear-related behavior traits in Japanese quail / S. Mignon-Grasteau, O. Roussot, C. Delaby et al. // Behaviour Processes. - 61(1-2). - 2003. - P. 69-75.
318
