CC BY
295
УДК 618.39-021.3, 618.177-089.888.11
ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ БЕСПЛОДИЕ: ПРОБЛЕМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ
Т.В. Узлова, Е.К. Лейхнер, О.В. Маркина ЧелГМА, г. Челябинск
Проблема ранних потерь беременности и ее ненастуиления в течение многих лет остается актуальной. Совместимость супругов более чем по 3 антигенам системы ИЬЛ считается фактором, повышающим риск ранних потерь беременности, в том числе из-за нарушения процесса имплантации эмбриона. Однако до сих пор отсутствуют четкие критерии, позволяющие прогнозировать вероятность положительного исхода беременности либо ЭКО для пары с конкретными антигенами системы ИЬЛ, либо с помощью донорских программ.
Ключевые слова: главный комплекс гистосовместимости, имплантация эмбриона, лимфоцитоиммунотерапия, первичное бесплодие, привычное невынашивание беременности, система человеческих лимфоцитарных антигенов, экстракорпоральное оплодотворение.
Исследования полиморфизма главного комплекса тканевой совместимости человека (HLA) проводятся с середины 60-х годов, когда методами серологического типирования было вышвлено, что в разных популяциях определяются разные наборы вариантов HLA антигенов (АГ).
В 80-х годах исследователи обратили внимание на связь антигенов HLA и репродуктивных проблем. В 90-х годах группа датских исследователей во главе с Christiansen O.B. нашла взаимосвязь антигенов HLA класса II и репродуктивных потерь у женщин [5]. С тех пор продолжается накопление фактов о роли HLA в процессах репродукции.
Однако проблема ранних потерь беременности и ее ненаступления в течение многих лет остается актуальной. Процент выставляемых диагнозов Сйривычное невынашивание□ и «бесплодие»] несмотря на лавинообразное накопление новых научных данных, появление новых методов лечения и развитие вспомогательных репродуктивных технологий на протяжении последних лет, все также не имеет тенденции к снижению. Частота привычного невынашивания беременности составляет 3-5 %, причем риск потери желанной беременности возрастает с увеличением числа неудач и достигает 38 % после двух предшествующих выкидышей [6]. Эффективность же экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) не превышает 30 %.
Большинство привычных выкидышей ранних сроков беременности и неудач имплантации обусловлено иммунологическим отторжением зиготы/плода как аллотрансплантанта, чужеродного для матери вследствие экспрессии отцовских антигенов и нарушения процессов блокирования киллерной активности клеток эндометрия.
Факторами, повышающими риск ранних по-
терь беременности, неудач имплантации при ЭКО и так называемого необъяснимого бесплодия, считаются: совместимость супругов более чем по 3 антигенам системы ИЬЛ, определенные гомозиготные генотипы у женщин и мужчин, наличие аллелей □ маркеров высокого генетического груза [2, 3]. Однако до сих пор отсутствуют четкие критерии, позволяющие прогнозировать вероятность положительного исхода беременности либо ЭКО для пары с конкретными антигенами системы ИЬЛ, либо с помощью донорских программ. Отношение же к лимфоцитоиммунотерапии, позволяющей изменить состояние иммунной системы матери в сторону защиты эмбриона также неоднозначно [1, 4]. Многие аспекты применения ЛИТ остаются неясными □ нет четких критериев отбора пациенток для лечения, критериев применения ЛИТ изолированно или в комбинации с иммунными препаратами либо гормонотерапией, сроки проведения ЛИТ и эффективность различных доз вводимых лимфоцитов находятся в стадии разработки.
Целью нашего исследования было: 1. Изучение особенностей генотипов по ИЬЛ □ антигенам II класса и распределения различных аллелей и гаплотипов у женщин с такими репродуктивными проблемами, как привычное невынашивание и бесплодие. 2. Выявление устойчивых гаплотипов, предрасполагающих к репродуктивным потерям как в процессах естественного оплодотворения, так и при вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ). 3. Определение эффективности лимфоцитоиммунотерапии (ЛИТ) в лечении бесплодия в парах с ИЬЛ-совместимостью. 4. Поиск протективных аллелей и гаплотипов, при наличии которых в генотипе возможно наступление самостоятельной спонтанной беременности на фоне ЛИТ.
Материалы и методы исследования. Фенотип HLA исследовали у 244 женщин в парах с HLA-совместимостью с супругом по двум и более антигенам (группа 1), с диагнозом «Привычное невынашивание □ или «бесплодие □ а также с репродуктивными потерями после ЭКО в анамнезе. Группу контроля составили 44 женщины, имеющие одного или двух здоровых детей от одного и того же партнера, не имеющие совпадений в системе HLA с данным партнером или имеющие 1 совпадение.
На втором этапе исследования мы выделили группу из 69 женщин с диагнозом «первичное бесплодие» состоящих на диспансерном учете с данным диагнозом от 2 до 7 лет (группа 2). Женщины были отобраны на основании следующих критериев включения: нормальное строение полового аппарата, кариотип 46XX, регулярный овулятор-ный менструальный цикл (что позволяет исключить наличие серьезных гормональных изменений), проходимость маточных труб подтверждена методами МСГ/селективной, МСГ/лапароскопиче-ски, отсутствие генитальных инфекций, отсутствие тяжелой экстрагенитальной патологии, являющейся противопоказанием для вынашивания беременности, наличие совпадений с мужем в системе HLA по двум и более антигенам. Всем этим женщинам ранее было рекомендовано прибегнуть к методу ЭКО для лечения бесплодия.
Всем пациенткам было проведено типирование антигенов главного комплекса гистосовместимости I и II класса. Иммунологическое типирование антигенов I класса А, В проводили в стандартном лимфоцитотоксическом тесте с использованием сывороток Санкт-Петербургского НИИ гематологии и переливания крови. Типирование антигенов HLA II класса проводилось методом полимеразной цепной реакции с использованием реактивов фирмы Protrans SSP "low resolution"] Совпадения по двум антигенам обнаружены у 10,2 % женщин из исследуемых пар, по трем АГ □ у 36,2 %, четырем
АГ □ у 26,1 %, пяти АГ □ у 17,5 %, шести и более АГ □ у 10 %.
Всем пациенткам из группы 2 проведена ЛИТ донорскими лимфоцитами по схеме: на 2«5-й день менструального цикла (д.м.ц.), через 0И«6 мес (где 0 □ первая ЛИТ). На фоне проведения ЛИТ мы ожидали наступления спонтанной беременности, так как критерии отбора в группу позволяли предположить, что иммунный фактор бесплодия был доминантным у этих женщин. При отсутствии спонтанной беременности и дальнейшем планировании ЭКО ЛИТ проводили по схеме: на 2-6-й д.м.ц. в месяце, предшествующем началу протокола стимуляции суперовуляции, затем на 2-й д.м.ц. при вступлении в протокол стимуляции суперовуляции. При наступлении беременности ЛИТ проводили по схеме □ 1-я процедура при положительном значении ХГЧ сыворотки крови, затем каждые 4 недели до 12 недель беременности.
Результаты исследования оценивали с помощью статистических параметрических методов для больших и малых величин.
Результаты исследования: Проведенный нами анализ частоты встречаемости антигенов в группе 1 и контроле показал □ в группе 1 частота встречаемости антигенов следующая □ БрЛ1 □ 501 □ 27,25 %, □ 102 □ 18 %, 101 □ 14,8 %, 201 □ 13 %, 103 □ 11 %, Б0В1 □ 501 □ 24,4 %, 301 □ 21,6 %, 201 □ 17,8 %, 602/8 □ 16,2 %, БРВ1 □ 1 □ 14,2 %, 13 □ 13,3 %, 7 □ 12,6 %, 11 □ 12,2 %, 15 □ 11,9 %, 4 □ 9,9 %. В группе контроля ПБрЛ1 □ 301 □27,25 % (по сравнению с 10,8 % в исследуемой группе), 102 □
15.9 %, 201 1-15,9 %, 501 П13,6 %, 101 □ 9,1 %, 103 □ 6,8 %, 401 □ 6,8 % (2 % в исследуемой группе). Б0В1 □ 301 □ 20,45 %, 201 □ 20,45 %, 602/8 □ 13,6 %, 302 □ 13,6 %, 501 □ 6,8 % (против 24,4 в исследуемой группе), 402 □ 6,8 % (против 1,8 %), 303 □ 6,8 (против 3,4 %). БРВ1 □ 4 □ 22,7 %, 7 □
15.9 %, 15 □ 11,36 %, 11,1 ,13, 12 и 8 по 6,8 % соответственно (см. таблицу).
Распределение антигенов в группе 1 и контроле
dqa1 группа1 контроль dqb1 группа1 контроль DRB1
501 27,25% 13,60% 301 21,60% 20,45% 11 12,20% 6,80%
102 18,00% 15,90% 602-8 16,20% 13,60% 15 11,90% 11,36%
502-4 4,50% 2,27% 16 3,80% 2,30%
201 13,30% 15,90% 303 3,38% 6,80% 7 12,60% 15,90%
101 14,85% 9,10% 501 24,40% 6,80% 1 14,20% 6,80%
302 7,43% 13,60% 12 3,15% 6,80%
603-8 6,76% 6,80% 4 9,90% 22,70%
301 10,80% 27,25% 201 17,80% 20,45% 13 13,30% 6,80%
103 11,00% 6,80% 604-605 606 0,67% 3 7,00% 4,50%
401 2,00% 6,80% 305 0,45% 6 3,40% 2,30%
601 0 4,50% 503 1,80% 2,27% 14 2,47% 2,30%
603-8 0,23% 402 1,80% 6,80% 9 0.9% 4,50%
104 1,35% 601 0,90% 2,27% 10 0,67%
103 0,23% 8 2,25% 6,80%
202 0,23% 17 0,90%
403 0,23%
401 0,23%
Проблемы здравоохранения
На основании полученных данных выявлены следующие закономерности: в исследуемой группе достоверное увеличение частоты встречаемости антигенов БрЛ1\501, 101, 103 практически в 2 раза по сравнению с контролем, уменьшение частоты встречаемости антигенов БрЛ 301 и 402 в 2 СЕ,5 раза. Увеличение БрВ1\ 501 в исследуемой группе в 3,5 раза по сравнению с контролем. В исследуемой группе доказано увеличение следующих аллелей БРВ1 □ 1,13,11 в 2 и более раза по сравнению с контролем, снижение встречаемости аллеля 4 и 8 соответственно.
Во группе с бесплодием (69 пациенток) спонтанная беременность наступила у 17 (24,6 %) женщин после проведения двух процедур ЛИТ, т. е. в период от 3 до 6 мес. Остальные 52 женщины при отсутствии у них спонтанной беременности в течение 9П12 мес от начала ЛИТ подверглись стимуляции суперовуляции и процедуре ЭКО. Результативность ЭКО в данной группе составила
61,5 % (32). Общий процент наступивших беременностей равен 71 %.
Всех исследуемых женщин мы разделили на три подгруппы: подгруппа 1 □ женщины со спонтанно наступившей беременностью □ 17, подгруппа 2 □ беременность наступила в результате 1-й попытки ЭКО □ 32, подгруппа 3 □ женщины с неудачными попытками ЭКО □ 20. В этих подгруппах провели анализ частоты встречаемости антигенов и гаплотипов с целью выявления аллелей □ протекторов беременности и аллелей, наличие которых в генотипе может препятствовать наступлению и/или развитию беременности. Анализ антигенного состава аллелей БрЛ1 показал: неуклонное снижение частоты встречаемости аллеля *102
(23,5 % в первой подгруппе, 18,75 % во второй и
12,5 % в третьей), статистически значимое повышение аллеля 103 в 3-й подгруппе (5,9 % в 1-й, 4,7 % во 2-й и 15 % в 3-й), статистически значимое повышение аллеля 501 и уменьшение аллеля 301 во
2-й группе по сравнению с подгруппой 1 (рис. 1).
В аллельной группе БрВ1 обнаружено двухкратное снижение частоты встречаемости аллеля 602/8 во 2-й и 3-й подгруппах женщин по сравнению с первой (20,6 %, 12,5 %, 10,0 % соответственно), снижение частоты встречаемости аллеля 503 (5,9 %, 1,56 % и 0 % соответственно), рост частоты встречаемости аллеля 603/8 (2,9 %, 7,8 % и 12,5 % в 1-й, 2-й и 3-й подгруппах соответственно). Частота встречаемости аллеля БрВ1 *301 возросла в 2 раза во 2-й и 3-й подгруппах по сравнению с 1-й, для аллелей 201,501,302 статистически значимых изменений не выявлено (рис. 2).
При сравнительном анализе аллельной группы БРВ1 статистически достоверных изменений обнаружено не было. При анализе частоты встречаемости гаплотипов в трех подгруппах было обнаружено некоторое уменьшение частоты встречаемости гаплотипа 301/302/4 во 2-й и
3-й подгруппе по сравнению с 1-й, значительное уменьшение частоты распространенности гаплотипов 102/602-8/15 в 3-й подгруппе по сравнению со 2-й и 3-й (20,6 %, 20,3 % и 10 % соответственно), 501/201/3 (11,8 %, 10,9 % и 5 %). В 3-й подгруппе при снижении частоты вышеперечисленных гаплотипов наблюдался статистически значимый рост частоты гаплотипа 103/603-8/13 (2,94 % в 1-й подгруппе, 7,8 % во 2-й и 12,5 % в 3-й соответственно) и гаплотипа 503/301/11 (11,76 % в 1-й группе, 21,9 % во 2-й и 17,5 % в 3-й) (рис. 3).
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
распределение аллелей ООА1 в подгруппах
► Подгруппа 1 -Подгруппа 2 ■Подгруппа 3
501 102 201 101 301 103 401 104
антигены
Рис. 1. Распределение аллей РОЛ1 в подгруппах
Распределение аллелей РОБ1 в подгруппах
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
Подгруппа 1 Подгруппа 2 Подгруппа 3
502-4 603-8 503
301 501 604-605-606 304
антигены
Рис. 2. Распределение РОБ1 в подгруппах
Распределение гаплотипов
25,00%
20,00%
15,00%
10,00%
5,00%
0,00%
102\602-8\15 101\503\14
101 \501\4 501 \301\11
гаплотипы Рис. 3. Распределение гаплотипов
Подгруппа1 Подгруппа 2 Подгруппа 3
Исходя из полученных данных, можно сделать следующие выводы:
1. При сравнительном анализе распространенности антигенов ИЬЛ в изучаемой группе и контрольной получено достоверное повышение частоты встречаемости аллелей групп БрЛ 301 и 103, аллели 501 локуса БрВ1, группы 4 и 8 локуса БКВ1, что может определять их роль в формировании иммунного ответа при зачатии, имплантации и сохранении беременности. Причем существенное значение для сохранения беременности может иметь не только наличие определенного аллеля, но и комбинация аллелей и гаплотипов одного партнера и в паре, что требует дальнейшего изучения.
2. ЛИТ является эффективным методом преодоления бесплодия как в виде монотерапии, так и в сочетании с другими методами лечения (ЭКО и ПЭ) в случае, если совместимость партнеров по системе человеческих лейкоцитарных антигенов является главным фактором ненаступления беременности □ 71 %.
3. Наличие в генотипе женщины таких гаплотипов ИЬЛ II класса, как 102/602-8/15, 501/201/3 повышает шансы супругов на самостоятельное зачатие и/или положительный результат ЭКО. Присутствие гаплотипа 503/301/11 снижает шансы на самостоятельное зачатие, присутствие гаплотипа 103/603-8/13 снижает шансы успеха попыток экстракорпорального оплодотворения. Это может быть связано с различной степенью активации киллерного ответа на уровне маточных труб и/или эндометрия в момент имплантции.
Литература
1. Сиделъникова, В.М. Спорные вопросы диагностики и терапии привычных выкидышей, обусловленных иммунологическими нарушениями /
B.М. Сиделъникова, Н.К. Тетруашвили, Г. Т. Сухих // Материалы II Междунар. конгресса по репродуктивной медицине. —М., 2008. □ С. 126Н27.
2. Шахгюлян, Я.Л. Особенности системы HLA в привычном невынашивании беременности / Я.Л. Шахгюлян, Н.К. Тетруашвили, А.А. Агаджа-нова // Материалы I Междунар. конгресса по репродуктивной медицине. —М., 2006. □ С. 236.
3. Шахгюлян, Я.Л. Ролъ определенных антигенов и гаплотипов системы HLA, предрасполагающих к привычному невынашиванию беременности / Я.Л. Шахгюлян, Н.К. Тетруашвили, А.А. Агаджанова //Материалы I Междунар. конгресса по репродуктивной медицине. —М., 2006. □
C. 236-237.
4. Kallen, C.B. Immune testing in fertility practice: Truth or deception? / C.B. Kallen, A. Arici // Curr Opin Obstet Gynecol. □ 2003. □ V. 15(3). □ Р. 225-231.
5. Placebo-controlled trial of active immunization with third party leukocytes in recurrent miscarriage / O. Christiansen, O. Mathiesen, M. Husth et al. // Act Obstet Gynecol Scand. □ 1994. □ V. 73 □ Р. 261^268.
6. Stephenson, M. Evaluation and management of recurrent early pregnancy loss / M. Stephenson, W. Kutteh // Clin Obstet Gynecol. □ 2007. □ V. 50(1). □ Р. 132H45.
Поступила в редакцию 21 декабря 2010 г.
