CC BY
0
© Коллектив авторов, 2024
Первойкина К.А.1, Щербинин Д.Н.1, Вахтинский В.М.1, Авдонина Е.Д.1, Верховская Л.В.1, Шмаров М.М.1' 2, Логунов Д.Ю.1, Гинцбург А.Л.1' 2
Иммуногенность протективного антигена Bacillus anthracis в составе иммуномодулирующих конструкций
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Аденовирусные векторы способны индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ на целевые антигены, однако в ряде случаев актуально дальнейшее улучшение их иммуногенности, что требует разработки новых подходов для создания вакцинных препаратов на основе аденовирусов.
Цель - изучение способности генетических конструкций, выполняющих функции адьювантов, повышать иммуногенность протективного антигена (РА) Bacillus anthracis, экспрессируемого в составе рекомбинантного аденовирусного вектора.
Материал и методы. Аденовирусы, несущие адьювантные конструкции с модельным антигеном (Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA), получены методами молекулярного клонирования и трансфекцией эукариотической клеточной линии. Экспрессия антигена подтверждена с помощью вестерн-блоттинга. Полученными аденовирусами иммунизировали самок мышей линии BALB/c. На 28-й день после аденовирусной иммунизации отбирали образцы сыворотки крови мышей и выявляли специфические антитела к антигену методом иммуноферментного анализа.
Результаты. При однократной внутримышечной иммунизации лабораторных животных в дозе 1 • 107 БОЕ Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA продемонстрировано увеличение имму-ногенности в сравнении с контрольным аденовирусом, несущим только секретируемый 4-й домен PA. Наибольший титр антител был показан для Ad5-Ii-fur-PA [(среднее геометрическое титра (СГТ): 2539,84; 95 % доверительный интервал (ДИ) 1744-3698] в сравнении с Ad5-Ii-PA (СГТ: 1425,44; 95 % ДИ 824-2465) и Ad5-sPA (СГТ: 634,96; 95 % ДИ 436-924). Предположительно, это обусловлено возможностью комплекса Ii-PA секре-тироваться на поверхность клетки и, как следствие, обеспечивать доступ для антиген-презентирующих клеток.
Заключение. Сконструированы аденовирусные векторы Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA, несущие слитые конструкции, содержащие в качестве адьюванта инвариантную цепь и инвариантную цепь с фуриновым сайтом. Полученные рекомбинантные аденовирусы продемонстрировали достоверное повышение иммуногенности в сравнении с аденовирусом, несущим только секретируемый PA. Наибольшей иммуногенностью обладает Ad5-Ii-fur-PA.
Ключевые слова: рекомбинантный аденовирусный вектор; адъюванты; иммуногенность; инвариантная цепь; протективный антиген; Bacillus anthracis
Статья получена 02.08.2024. Принята в печать 15.09.2024.
Для цитирования: Первойкина К.А., Щербинин Д.Н., Вахтинский В.М., Авдонина Е.Д., Верховская Л.В., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л. Иммуногенность протективного антигена Bacillus anthracis в составе иммуномодулирующих конструкций. Иммунология. 2024; 45 (5): 572-581. DOI: https://doi. org/10.33029/1816-2134-2024-45-5-572-581
Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России «Изучение влияния молекулярных адьювантов на уровень экспрессии генов протективных антигенов в составе рекомбинантных аденовирусных векторов для усиления иммуногенности кандидатных вакцин» № 056-00066-23-00/П5. Публикация результатов исследования в открытой печати разрешена.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Первойкина Кристина Алексеевна -младший научный сотрудник лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0780-5998
Вклад авторов. Идея исследования - Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л.; дизайн и конструирование рекомбинантных аденовирусов - Первойкина К.А., Щербинин Д.Н.; очистка и титрование рекомбинантных аденовирусов - Вахтинский В.М.; анализ экспрессии рекомбинантных белков - Авдонина Е.Д., Верховская Л.В.; иммунизация лабораторных животных и отбор образцов - Первойкина К. А.; детектирование антител - Авдонина Е.Д., Верховская Л.В.; сбор и статистическая обработка материала - Первойкина К.А.; написание и редактирование текста - Первойкина К.А.; утверждение итогового варианта статьи - Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л.
Pervoykina K.A.1, Shcherbinin D.N.1, Vakhtinskii V.M.1, Avdonina E.D.1, Verkhovskaya L.V.1, Shmarov M.M.1' 2, Logunov D.Yu.1, Gintsburg A.L.1' 2
The immunogenicity of the protective antigen of Bacillus anthracis in immunomodulatory constructs
1 Federal Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the Honorary Academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Adenovirus vectors can induce a humoral and cellular immune response to target antigens. However, enhancing their immunogenicity is sometimes essential, requiring new approaches to produce adenovirus-based vaccines.
Aim - to study the ability of genetic constructs that act as adjuvants to increase the immunogenicity of the protective antigen (PA) of Bacillus anthracis expressed in a recombinant adenovirus vector.
Material and methods. Adenoviruses carrying adjuvant constructs with the model antigen (Ad5-Ii-PA and Ad5-Ii-fur-PA) were obtained by molecular cloning and transfection of the eukary-otic cell line. Antigen expression was confirmed by Western blotting. The resulting adenoviruses were used to immunize female BALB/c mice. The mice blood serum was collected on the 28th day after adenovirus immunization. The specific antibodies to the antigen were detected by ELISA.
Results. A single intramuscular immunization of laboratory animals with a 1 • 107 PFU dose of Ad5-Ii-PA and Ad5-Ii-fur-PA demonstrated an increase in immunogenicity compared to the control adenovirus carrying only the secretable form of PA's fourth domain. Ad5-Ii-fur-PA [geometric mean titer (GMT): 2539.84; confidence interval (CI) 95 %: 1744-3698] produced the highest antibody titer compared to Ad5-Ii-PA (GMT: 1425.44; CI 95 %: 824-2465) and Ad5-sPA (GMT: 634.96; 95 % CI 436-924). This is presumably due to the ability of the Ii-PA complex to be secreted onto the cell surface, providing access for antigen-presenting cells.
Conclusions. Adenoviral vectors Ad5-Ii-PA and Ad5-Ii-fur-PA, carrying fusion constructs containing the invariant chain and the invariant chain with a furin site as adjuvants, were constructed. The obtained recombinant adenoviruses demonstrated a reliable increase in immunogenicity compared to the adenovirus carrying only secretable PA. Ad5-Ii-fur-PA exhibits the highest immunogenicity.
Keywords: recombinant adenoviral vector; adjuvants; immunogenicity; invariant chain; protective antigen; Bacillus anthracis
Received 02.08.2024. Accepted 15.09.2024.
For citation: Pervoykina K.A., Shcherbinin D.N., Vakhtinskii V.M., Avdonina E.D., Verkhovskaya L.V, Shmarov M.M., Logunov D.Yu., Gintsburg A.L. The immunogenicity of the protective antigen of Bacillus anthracis in immunomodulatory constructs. Immynologiya. 2024; 45 (5): 572-81. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-5-572-581 (in Russian)
Funding. The work was carried out within the framework of the state assignment of the National Research Center for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya «The study of the effect of molecular adjuvants on the expression level of protective antigen genes in recombinant adenovirus vectors to enhance the immunogenicity of candidate vaccines» № 056-00066-23-00/ro. Open publication of the study results is allowed.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Authors' contribution. Idea of the study - Shcherbinin D.N., Shmarov M.M., Logunov D.Yu., Gintsburg A.L.; recombinant adenoviruses design and construction - Pervoykina K.A., Shcherbinin D.N.; recombinant adenoviruses purification and titration - Vakhtinskii V.M.; recombinant protein expression analysis - Avdonina E.D., Verkhovskaya L.V; laboratory animals immunization and sample collection - Pervoykina K.A.; antibodies detection -Avdonina E.D., Verkhovskaya L.V.; data collection and statistical processing - Pervoykina K.A.; text writing and editing - Pervoykina K.A.; approval of the final version of the article - Shmarov M.M., Logunov D.Yu., Gintsburg A.L.
For correspondence
Kristina A. Pervoykina -Junior Researcher of the Molecular Biotechnology Lab. of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0780-5998
Введение
Рекомбинантные аденовирусные векторы - эффективная и перспективная платформа как для создания новых вакцинных препаратов, так и для актуализации уже существующих вакцин, которые затруднительно производить экономически или технически. Рекомбинантные аденовирусы (гАф достаточно хорошо изучены, безопасны, так как используются в репли-кативно-дефектной форме, а также обладают высокой иммуногенностью и способны индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы. На сегодняшний день уже существует несколько вакцинных препаратов на основе гAd и, согласно данным СИт-calTrails.gov, более 200 вакцин против различных патогенов находятся на той или иной стадии клинических испытаний.
Считается, что гAd не нуждаются в адъювантах, поскольку компоненты аденовируса распознаются различными типами паттерн-распознающих рецепторов (РКЯ), включая То11-подобные рецепторы ТЬЯ9 [1, 2]. Однако на эффективность кандидатных вакцин оказывает влияние природа трансгена: вирусные антигены в составе гAd являются высокоиммуногенными, вместе с тем бактериальные и вирусные антигены, не являющиеся поверхностными, зачастую обладают низкой иммуногенностью и, следовательно, требуют ее повышения [3, 4].
В настоящее время для усиления иммуногенности исследователями широко применяются очищенные или синтетические агонисты ТЬЯ^, однако результаты таких работ противоречивы: в одном случае такие агонисты усиливали иммунный ответ, в другом - напротив, инги-бировали его [5-8].
Исходя из вышесказанного, можно предположить, что перспективное направление исследований - изучение способов повышения эффективности векторных вакцин за счет введения различных генетических конструкций в качестве молекулярных адъювантов в состав аденовирусного вектора для усиления иммуногенности, опосредованного Т-хелперными клетками и праймиро-ванием В-клеток против трансгена для улучшения гуморального ответа. В качестве таких адъювантов можно использовать генетические конструкции, кодирующие агонисты РКЯ - белки, позволяющие мультимеризовать секретируемые антигены, а также способные улучшать презентацию антигенов в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС), и другие молекулы [9].
Одним из таких подходов является создание слитых конструкций адъювантного элемента непосредственно с антигеном. В настоящее время в рамках этого подхода зачастую используется инвариантная цепь (И).
И представляет собой мембранный белок второго типа, часть которого (СЫР-пептид) связывается с МНС-11 и обеспечивает ее направленный транспорт от эндоплазматического ретикулума до эндосомально-лизосомальной системы, где происходят процессинг и связывание антигенного пептида с МНС-11. В резуль-
тате соединения антигена с Ii получившийся тримерный комплекс П-[антиген] увеличивает презентацию MHC-II как прямым путем (прямой транспорт в эндосомы, где антиген переносится на MHC-II), так и непрямым: комплекс П-[антиген] транспортируется на поверхность антиген-презентирующих клеток (АПК), обеспечивая прямую презентацию антигена, а также обратный захват в эндосомы благодаря домену сигнала эндосо-мальной сортировки (ESS).
На сегодняшний день известно большое количество кандидатных вакцин против большого спектра инфекций с Ii в качестве адъюванта. Ii соединяют с целевым антигеном и кодируют в ряде конструкций, включая аденовирусные векторы [10]. В частности, S. Capone и соавт. разработали вакцину на основе аденовируса шимпанзе ChAd3 и рекомбинантного MVA, несущих слитые конструкции Ii с неструктурными белками вируса гепатита C (HCV) в качестве антигенов, которые продемонстрировали резкое увеличение Т-клеточных ответов на антиген на мышах и приматах [11].
Однако, несмотря на вышеуказанные преимущества, нативная Ii вызывает слабый гуморальный ответ, в связи с чем нами было решено дополнительно использовать модифицированный вариант адъюванта.
Фурин - эндопротеаза, активная в комплексе Голь -джи, в котором происходит узнавание сайта Arg-X-Lys/ Arg-Arg и его разрезание. Благодаря этому тримери-зующий домен в комплексе с антигеном отделяется от Ii и секретируется во внеклеточный компартмент, что позволяет увеличить его доступность для В-клеток, при этом увеличение презентации антигена в комплексе с молекулами MHC-II сохраняется.
В 2019 г. C. Fougeroux и соавт. добавили между CLIP и тримеризующим доменом инвариантной цепи сайт разрезания фуриновой протеазой для обеспечения секреции тримеризованного антигена Plasmodium falciparum, что привело к увеличению секреции антител на целевой антиген [9].
В качестве модельного антигена для проверки иммуногенности выбранных адъювантов было решено взять четвертый домен протективного антигена (PA) B. anthracis.
B. anthracis - это возбудитель сибирской язвы, смертельного зоонозного заболевания. Согласно данным Россельхознадзора, в 2023 г. эпизоотическая ситуация по сибирской язве обострилась: случаи возникновения заболевания зарегистрированы в нескольких субъектах Российской Федерации (в Центральном федеральном округе - Чувашской Республике, Тамбовской, Рязанской, Воронежской областях, а также в Республике Тыва).
По сведениям CDC.gov, уровень смертности даже при лечении колеблется от < 2 % при кожной сибирской язве до 45 % при ингаляционной сибирской язве и 92 % при сибиреязвенном менингите [12]. Инфекцией страдают сельскохозяйственные травоядные животные, их гибель приводит к экономическим потерям. Люди чаще всего заражаются через больных животных, продукты их переработки, а также во время клинической и сельскохозяйственной практики.
После попадания споры в организм B. anthracis вырабатывает токсины: протективный антиген (PA) и отечный фактор (EF) в сочетании образуют отечный токсин (ET), а PA и летальный фактор (LF) в сочетании образуют летальный токсин (LT). После связывания с поверхностными рецепторами часть комплексов PA облегчает перемещение токсинов в цитозоль, способствуя транслокации ферментативно активных белков LF и EF [13].
На сегодняшний день в Российской Федерации для профилактики сибирской язвы применяются живая аттенуированная вакцина СТИ-1 на основе штамма B. anthracis и вакцина сибиреязвенная комбинированная сухая для подкожного применения. Производство вышеуказанных препаратов имеет риски загрязнения оборудования и помещений устойчивыми к воздействиям окружающей среды спорами в связи с использованием спорообразующего аттенуированного штамма B. anthracis. Кроме того, применение таких вакцин проблематично для экстренной профилактики при анти-биотикотерапии [14]. Учитывая вышесказанное, для медицинской и ветеринарной практики необходимо совершенствовать вакцины против сибирской язвы.
Материал и методы
Бактериальные штаммы. Для получения плаз-мид использовали компетентные клетки штамма DH5a E. coli.
Клеточные культуры. Для получения и наработки rAd была использована адгезионная клеточная культура HEK293 (линия клеток эмбриональной почки человека). Клеточная культура предоставлена Всероссийской коллекцией клеточных культур ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.
Лабораторные животные. В работе использованы самки мышей BALB/c (18-20 г), полученные в НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН (Пущино, Россия). Эксперименты проводились согласно Европейской конвенции об охране позвоночных животных, используемых для экспериментов и в других научных целях [15]. Животные содержались в виварии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России в соответствии с принятыми правилами (ГОСТ 33216-2014), имели свободный доступ к воде и пище. Перед началом эксперимента мыши содержались в карантине 7 дней.
Получение рекомбинантных аденовирусов человека серотипа 5. Нуклеотидная последовательность 4-го домена PA B. anthracis получена методом поли-меразной цепной реакции (ПЦР) плазмиды pShuttle-CMV-sPA, полученной ранее [16], ген инвариантной цепи мыши был получен в составе коммерческой плаз-миды pcDNA3-Ii-OVA.I+II (Addgene, США). Вышеперечисленные гены были субклонированы по рестрик-ционным сайтам в челночную плазмиду pShuttle-CMV AdEasy Adenoviral vector system (Stratagene, США) с получением плазмиды pShuttle-CMV-Ii-PA. Ad5-Ii-PA был получен в соответствии с инструкцией к набору.
Последовательность фуринового сайта была добавлена методом кольцевой ПЦР плазмиды pShuttle-CMV-Ii-PA со следующими праймерами: Ii-PA-fur-R: CTTCACAGGCCCAAGGAGC Ii-PA-fur-F: AGAAAGAGGAGAAAGTACGGCAACAIGACCC
Последовательность сайта для разрезания фурино-вой протеазы подчеркнута. Таким образом была получена плазмида pShuttle-CMV-Ii-fur-PA. Ad5-Ii-fur-PA был получен вышеописанным методом.
В качестве контролей в работе использовали вирус Ad-sPA с секретируемым 4-м доменом PA B. anthracis, а также rAd5 с пустой CMV-экспрессионной кассетой Ad-null, полученные ранее с помощью набора AdEasy Adenoviral vector system (Stratagene, США).
Трансфекцию проводили в 24-луночном планшете с использованием реактива Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США). Для анализа полученных аденовирусов после трансфекции клетки HEK293 собирали, замораживали и оттаивали. Полученными лизатами заражали клетки HEK293 с конфлюентностью 70 %, посеянные на 3 см чашки Петри. Через 14 дней наблюдали цитопатическое действие (ЦПД), вызванное rAd.
Для детекции аденовирусов из этих клеток была выделена ДНК и поставлена ПЦР. Методом электрофореза в агарозном геле детектировали наличие ДНК rAd, несущих слитые конструкции, а также отсутствие репликативных вариантов, включающих Е1-область Ad5 человека. Титры rAd определяли с помощью набора QuickTiter™ Adenovirus Titer Immunoassay Kit (Cell Biolabs, США), в соответствии с рекомендациями производителя.
Оценка экспрессии рекомбинантных белков. Для определения экспрессии белков клетки линии HEK293 высевали на чашки Петри диаметром 3 см, инкубировали ночь для достижения 70 % конфлюентности и транс-дуцировали их rAd в количестве 100 бляшкообразую-щих единиц (БОЕ) на клетку. В качестве контрольного вируса использовали Ad-null, а также лизат нетрансду-цированных клеток. Экспрессия Ad5-sPA была проанализирована ранее [16]. В качестве положительного контроля взят препарат рекомбинантного PA (кат. номер 176908-100uG, C^bio^m, США).
Наличие 4-го домена PA анализировали в суперна-тантах зараженных клеток через 48 ч после трансдук-ции с помощью вестерн-блоттинга. Фракционирование белков проводили с помощью электрофореза в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях, в буферной системе Лэммли. Образцы вносили в лунки геля и выполняли электрофорез при постоянной силе тока 20 мА/гель в электродном буфере следующего состава: 25 мМ Tris-HCl; 0,25 М глицин; 0,1 % SDS, рН 8,3. После переноса на мембрану использовали овальбумин 1 % в фосфатном буфере с 0,1 % Tween 20; антитела поликлональные от иммунизированного верблюда в разведении 1 : 1000; вторичные антитела к IgG верблюда, меченные пероксидазой (HRP), в разведении 1 : 8000.
Ad 1 CMV 1 ESS ТМ CLIP Trim. dom. | PA | | SV40 | Ad
Ii
Ad CMV T! ESS ТМ CLIP | Fur | Trim. dom. | PA 1 | SV40 | Ad
Рис. 1. Схемы строения Ad5-Ii-PA (A) и Ad5-Ii-fur-PA (B), несущих адъювантные конструкции, с добавлением последовательности протективного антигена B. anthracis
Ad - геном рекомбинантного аденовируса человека серотипа 5 с делетированной El-областью, на место которой встроена экспресс-ионная кассета; CMV- цитомегаловирусный промотор; ESS - сигнал эндосомальной сортировки; TM- трансмембранный домен; CLIP - пептид, ассоциированный с MHC-II; Trim. dom. - тримеризующий домен; PA - протективный антиген; Ii - инвариантная цепь; SV40 - сигнал полиаденилирования.
Иммунизация и отбор образцов сывороток крови.
Мышей линии BALB/c случайным образом распределяли по группам (5 групп по 6 мышей) и проводили однократное внутримышечное введение rAd, несущих адъювантные конструкции, в дозе 1 • 107 БОЕ/мышь в объеме 100 мкл. Сбор образцов сывороток проводили на 28-й день путем отрезания кончика хвоста, титр антител анализировали с помощью иммунофермент-ного анализа (ИФА).
Детектирование антител методом иммунофер-ментного анализа. Определение уровня специфических IgG-антител к PA в сыворотке крови проводили методом непрямого твердофазного ИФА. В качестве антигена был взят Antrax PA (176908, Calbiochem, Германия) в концентрации 4 мкг/мл. Блокировку свободных сайтов инертным белком проводили с помощью 1 % раствора овальбумина в рабочем фосфатном буфере (PBS c 0,1 % Tween 20). Титрование сывороток проводили 2-кратными разведениями, детекцию - с помощью антивидовых антител к верблюжьим IgG, конъюгиро-ванных с пероксидазой хрена (HRP), и раствора тетра-метилбензидина. Оптическую плотность окрашенного продукта измеряли на планшетном фотометре iEMS Rider MF (Thermo Labsystem, США) при длине волны 450 нм.
Статистический анализ. Для сравнения иммунных ответов, индуцированных адъювантными конструкциями, использовали непараметрический ^-критерий Манна-Уитни. Статистический анализ проводили с использованием GraphPad Prism 9.0.0, минимальный уровень значимости составляет 5 % (p < 0,05).
Результаты
Дизайн конструкций, выполняющих функции адъювантов, и получение рекомбинантных аденовирусов
В качестве адъюванта для изучения влияния на иммуногенность rAd была выбрана инвариантная цепь, которая является хорошо зарекомендовавшим себя адъювантом благодаря увеличению презента-
ции MHC-II после применения аденовирусной вакцины. Для дополнительного усиления гуморального иммунного ответа была получена модифицированная конструкция: методом кольцевой ПЦР между CLIP-пептидом и тримеризующим доменом, соединенным с антигеном, добавлен фуриновый сайт, имеющий аминокислотную последовательность Arg-Lis-Arg-Arg. В качестве модельного антигена был выбран основной иммуноген В. anthracis - PA. Он является рецептор-связывающим компонентом для двух других факторов (ET и LT) и транспортирует их каталитические компоненты в цитозоль. В данном исследовании использован 4-й домен PA, отвечающий за связывание с рецептором на клетке-мишени [17].
В работе получены 2 аденовируса: несущий слитую конструкцию инвариантной цепи с протективным антигеном В. anthracis Ad5-Ii-PA (рис. 1А) и несущий слитую конструкцию Ii-PA с добавлением фуринового сайта Ad5-Ii-fur-PA (рис. 1Б).
Аденовирусы Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA были получены трансфекцией эукариотической линии клеток HEK293. Затем лизатами этих клеток заражали клетки HEK293. Через 14 дней наблюдали ЦПД. Для детекции Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA из этих клеток была выделена ДНК и поставлена ПЦР. Методом электрофореза в ага-розном геле детектировано присутствие ДНК Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA, а также отсутствие репликативно-компетентных вариантов, имеющих Е1-область аденовируса (рис. 2).
Таким образом были получены два rAd - Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA. Присутствие нуклеотидных последовательностей полученных слитых конструкций в составе rAd подтверждено методом секвенирования по Сэнгеру («Евроген», Россия).
Анализ секреции протективного антигена в полученных рекомбинантных аденовирусах
Экспрессию модельного антигена оценивали с помощью вестерн-блоттинга.
В образцах было обнаружено присутствие комплекса Ii-PA молекулярной массой 41 кДа, а также моно-
lOOO
7SO
SOO
ПЦР с праймерами на Е1-область аденовируса
1 - отрицательный контроль реакции
2 - положительный контроль реакции -
1028 п.о.
3 - Аёв-И-РА
4 - Аёв-Н-Аиг-РА
5 - Лёв-вРЛ
ПЦР с праймерами на гексон аденовируса ПЦР с праймерами на РА
6 - отрицательный контроль реакции
7 - положительный контроль реакции -
580 п.о.
8 - Ads-Ii-PA
9 - Ads-Ii-fur-PA 10 - Ad5-sPA
11 - отрицательный контроль реакции
12 - положительный контроль реакции -
386 п.о.
13 - Ads-Ii-PA
14 - Ads-Ii-fur-PA
15 - Ad5-sPA
Рис. 2. Электрофореграмма анализа Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
М - маркер молекулярной массы (здесь и на рис. 3)
Схема постановки вестерн-блоттинга
№ трека Образец Объем образца, мкл Теоретическая молекулярная масса, кДа
1 PA (положительный контроль) 2,3 63
2 Лизат клеток, трансдуцированных Ad5-Ii-PA 3 41
3 Лизат клеток, трансдуцированных Ad5-Ii-fur-PA 3 40
4 Лизат клеток, трансдуцированных Ad-null 3 -
3 Лизат клеток HEK293 (отрицательный контроль) 3 -
М Маркер (кат. номер 26619, Thermo Scientific, США) 6
мера Ii-fur-PA молекулярной массой 40 кДа, что совпадает с ожидаемыми молекулярными массами белков (см. таблицу и рис. 3).
Индукция гуморального иммунного ответа рекомби-нантными аденовирусами, экспрессирующими иммуно-модулирующие конструкции
Для оценки уровня антител самок мышей линии BALB/c иммунизировали Ad5-Ii-PA, Ad5-Ii-fur-PA и Ad5-sPA в дозе 1 • 107 БОЕ. Контрольной группе мышей вводили PBS (рН 7,4). На 28-й день после иммунизации rAd отбирали сыворотки крови мышей и выявляли специфические антитела к PA методом ИФА (рис. 4).
Контрольный Ad5-sPA индуцирует выработку специфических к PA антител [СГТ: 634,96; 95 % доверительный интервал (ДИ) 436-924], однако обе адъювантные конструкции показали более высокие титры в сравнении с ним. Группа мышей, иммунизированная Ad5-Ii-fur-PA, показала наибольший титр IgG (СГТ: 2539,84; 95 % ДИ 1744-3698), пусть и незначительно превышая титр в ответ на иммунизацию Ad5-Ii-PA (СГТ: 1425,44; 95 % ДИ 824-2465). Согласно полученным данным, инвариантная цепь и инвариантная цепь с фуриновым сайтом, слитые с протективным антигеном В. anthracis, достоверно усиливают иммуногенность препаратов аденовирусных векторов.
1 2 3 4 5 M
Рис. 3. Идентификация протективного антигена (РЛ) методом вестерн-блоттинга с образцами после лизиса клеток линии НЕК293, зараженных Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA
Обсуждение
Использование репликативно-дефектных rAd в качестве вакцинных векторов обладает рядом преимуществ перед другими технологиями. В частности, к ним относятся хорошая изученность, возможность быстрого производства вакцинных препаратов в условиях пандемии, безопасность [18, 19]. Также аденовекторные вакцины экономически выгодны в производстве [20]. Помимо этого, в геном аденовируса можно закодировать более одного антигена [21].
4000 -,
3000 -
2539,84
О
ад 2000 -\
1000 -
Ad5-Ii-fUr-PA Ad5-Ii-PA Ad5-sPA СГТ + 95 % ДИ
K-
Рис. 4. Результаты выявления специфических антител к про-тективному антигену (РА) в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, методом ИФА
Отрицательный контроль (К-) - PBS. Столбцы обозначают медиану каждой из группы (n = 5). Показано среднее геометрическое титра (СГТ) и 95 % доверительный интервал (ДИ) для групп (n = 5). Звездочками обозначены статистически значимые различия титров антител между экспериментальными группами (* -p < 0,05; ** - p < 0,001).
Рекомбинантные аденовирусы индуцируют ответ СБ8+-Т-клеток [22] и вызывают гуморальный иммунный ответ [23], однако сегодня активно развиваются различные стратегии по улучшению иммуногенности векторных вакцин. В литературе было показано, что в качестве адъюванта при использовании рекомбинант-ных аденовирусов может выступать инвариантная цепь [11] - ее использование усиливает ответы СБ4+-Т-кле-ток. Для доступности целевого антигена к В-клеткам было решено добавить последовательность фуринового сайта к С-концу тримеризующего домена Ii, соединенного с антигеном, для обеспечения секреции тример-ного комплекса П-[антиген].
Антиген B. anthracis был выбран в качестве модельного в связи с рядом проблем у лицензированных в РФ вакцинных препаратов против сибирской язвы. Среди них - трудоемкий процесс получения препарата; опасность загрязнения производственных помещений и, как следствие, заражение персонала; наличие нежелательных явлений после вакцинации и другие ограничения, обусловленные использованием живого штамма, что создает потребность в улучшении вакцин.
В большинстве исследований для создания вакцин, проходящих различные этапы клинических испытаний, использовали полноразмерный PA B. anthracis, однако в некоторых из них уровни нейтрализующих антител
против сибирской язвы были низкими, а защита оказывалась кратковременной. Кроме того, полноразмерный PA, используемый в комбинированных вакцинах, термолабилен, что обусловлено его агрегацией. Данная проблема значительно усложняет производство, хранение и транспортировку вакцинного препарата на основе полноразмерного PA [24, 25].
В настоящее время перспективным направлением видится получение конструкций рекомбинантного PA с применением адъювантов в составе rAd, что позволит избежать работы непосредственно с патогеном при производстве вакцинного препарата, повысит стабильность и иммуногенность вакцины. Нами было принято решение использовать 4-й домен PA B. anthracis, так как именно он содержит доминирующие защитные эпи-топы и сайт связывания с клеточным рецептором [26].
В работе мы подтвердили экспрессию белков Ii-PA и Ii-fur-PA ожидаемых молекулярных масс, а также продемонстрировали, что адъювантная конструкция Ii-PA индуцировала усиленный иммунный ответ у мышей после однократной иммунизации rAd, по-видимому, благодаря усилению гуморального ответа. При этом модификация в виде добавления фуринового сайта вызывает еще более сильный ответ, что говорит о положительном влиянии секреции тримеризованного комплекса Ii-PA на иммуногенность антигена в составе аденовирусного вектора.
Широкий спектр адьювантных свойств нативной инвариантной цепи и ее модификации с фуриновым сайтом можно использовать для усиления иммуногенности генно-инженерных вакцин на основе вирусных векторов.
Заключение
Были получены 2 аденовирусных вектора, несущие слитые конструкции, содержащие в качестве адъюванта инвариантную цепь (Ad5 -Ii-PA) и инвариантную цепь с фуриновым сайтом (Ad5-Ii-fur-PA). РА B. anthracis взят в качестве модельного антигена. Экспрессия адь-ювантных конструкций была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга.
Проведены сравнительные исследования индукции специфических антител на лабораторных животных, в результате которых при внутримышечном введении Ad5-Ii-PA и Ad5-Ii-fur-PA в дозе 1 • 107 БОЕ/мышь для обоих rAd продемонстрировано увеличение экспрессии антител в сравнении с аденовирусом, несущим только секретируемый PA. Кроме того, Ad5-Ii-fur-PA показал более высокий титр антител в сравнении с Ad5-Ii-PA, а следовательно, он является наиболее иммуногенным.
*
0
■ Литература
1. Yamaguchi T., Kawabata K., Koizumi N., Sakurai F., Nakashima K., Sakurai H., Sasaki T., Okada N., Yamanishi K., Mizuguchi H. Role of MyD88 and TLR9 in the innate immune response elicited by serotype 5 adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 2007; 18 (8): 753-62. DOI: https:// doi.org/10.1089/hum.2007.016
2. Atasheva S., Yao J., Shayakhmetov D.M. Innate immunity to adenovirus: lessons from mice. FEBS Lett. 2019; 593 (24): 3461-83. DOI: https://doi.org/10.1002/1873-3468.13696
3. Hollingdale M.R., Sedegah M., Limbach K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev. Vaccines. 2017; 16 (3): 261-71. DOI: https://doi.org/10.1080/14760584.2016.1228454
4. Afkhami S., Yao Y., Xing Z. Methods and clinical development of ade-novirus-vectored vaccines against mucosal pathogens. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2016; 3: 16030. DOI: https://doi.org/10.1038/mtm.2016.30
5. Седова Е.С., Первойкина К.А., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М. Генетические конструкции, выполняющие функции адъювантов,
в составе вакцин на основе аденовирусных векторов. Иммунология. 2022; 43 (1): 5-17. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-5-17
6. Li L., Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev. Vaccines. 2016; 15 (3): 313-29. DOI: https://doi.org/10.1586/14760584.2016.1124762
7. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B., Ataullakhanov R. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x
8. Milicic A., Rollier C.S., Tang C.K., Longley R., Hill A.V.S., Reyes-Sandoval A. Adjuvanting a viral vectored vaccine against pre-erythrocytic malaria. Scientific reports. 2017; 7 (1): 7284. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41598-017-07246-0
9. Fougeroux C., Turner L., Bojesen A.M., Lavstsen T. et al. Modified MHC class II-associated invariant chain induces increased antibody responses against plasmodium falciparum antigens after adenoviral vaccination. J. Immunol. 2019; 202 (8): 2320-31. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.1801210
10. Holst P.J., Sorensen M.R., Mandrup Jensen C.M., Orskov C., Thomsen A.R., Christensen J.P. MHC class II-associated invariant chain linkage of antigen dramatically improves cell-mediated immunity induced by adenovirus vaccines. J. Immunol. 2008; 180 (5): 3339-46. DOI: https:// doi.org/10.4049/jimmunol.180.5.3339
11. Capone S., Naddeo M., D'Alise A.M., Abbate A., Grazioli F., Del Gaudio A., Del Sorbo M., Esposito M.L., Ammendola V., Perretta G., Taglioni A., Colloca S., Nicosia A., Cortese R., Folgori A. Fusion of HCV nonstructural antigen to MHC class II-associated invariant chain enhances T-cell responses induced by vectored vaccines in nonhuman primates. Mol. Ther. 2014; 22 (5): 1039-47. DOI: https://doi.org/10.1038/mt.2014.15
12. Katharios-Lanwermeyer S., Holty J.E., Person M., Sejvar J., Haberling D., Tubbs H., Meaney-Delman D., Pillai S.K., Hupert N., Bower W.A., Hendricks K. Identifying meningitis during an anthrax mass casualty incident: systematic review of systemic anthrax since 1880. Clin. Infect. Dis. 2016; 62 (12): 1537-45. DOI: https://doi.org/10.1093/cid/ciw184
13. Collier R.J. Membrane translocation by anthrax toxin. Mol. Aspects Med. 2009; 30 (6): 413-22. DOI: https://doi.org/10.1016/ j.mam.2009.06.003
14. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Семакова А.П., Кутырев В.В. Лицензированные сибиреязвенные вакцины и экспериментальные препараты на стадии клинических исследований. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 94 (4): 112-26. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-4
15. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986. P. 11.
16. Щербинин Д.Н., Есмагамбетов И.Б., Носков А.Н., Селя-нинов Ю.О., Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Наро-дицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Индукция иммунного ответа к Bacillus anthracis при интраназальном введении рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего протективный антиген, слитый с Fc-фрагмен-том антитела IgG2a. Acta Naturae. 2014; 6 (1): 76-84. PMID: 24772330
■ Reference
1. Yamaguchi T., Kawabata K., Koizumi N., Sakurai F., Nakashima K., Sakurai H., Sasaki T., Okada N., Yamanishi K., Mizuguchi H. Role of MyD88 and TLR9 in the innate immune response elicited by serotype 5 adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 2007; 18 (8): 753-62. DOI: https:// doi.org/10.1089/hum.2007.016
2. Atasheva S., Yao J., Shayakhmetov D.M. Innate immunity to adenovirus: lessons from mice. FEBS Lett. 2019; 593 (24): 3461-83. DOI: https://doi.org/10.1002/1873-3468.13696
3. Hollingdale M.R., Sedegah M., Limbach K. Development of replication-deficient adenovirus malaria vaccines. Expert Rev Vaccines. 2017; 16 (3): 261-71. DOI: https://doi.org/10.1080/14760584.2016. 1228454
4. Afkhami S., Yao Y., Xing Z. Methods and clinical development of ade-novirus-vectored vaccines against mucosal pathogens. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016; 3: 16030. DOI: https://doi.org/10.1038/mtm.2016.30
5. Sedova E.S., Pervoykina K.A., Shcherbinin D.N., Shmarov M.M. Genetic constructs as adjuvants in vaccines based on adenoviral vectors.
17. Shen Y., Guo Q., Zhukovskaya N.L., Drum C.L., Bohm A., Tang W.J. Structure of anthrax edema factor-calmodulin-adenosine 5'-(a,p-methylene)-triphosphate complex reveals an alternative mode of ATP binding to the catalytic site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 317 (2): 309-14. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2004.03.046
18. Folegatti P.M., Ewer K.J., Aley P.K., Angus B., Becker S, Belij-Rammerstorfer S., Bellamy D., Bibi S., Bittaye M., Clutterbuck E.A., Dold C., Faust S.N., Finn A., Flaxman A.L., Hallis B., Heath P., Jenkin D., Lazarus R., Makinson R., Minassian A.M., Pollock K.M., Ramasamy M., Robinson H., Snape M., Tarrant R., Voysey M., Green C., Douglas A.D., Hill A.V.S., Lambe T., Gilbert S.C., Pollard A.J.; Oxford COVID Vaccine Trial Group. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, singleblind, randomised controlled trial. Lancet. 2020; 396 (10249): 467-78. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31604-4
19. Antrobus R.D., Coughlan L., Berthoud T.K., Dicks M.D., Hill A.V., Lambe T., Gilbert S.C. Clinical assessment of a novel recombinant simian adenovirus ChAdOx1 as a vectored vaccine expressing conserved Influenza A antigens. Mol. Ther. 2014; 22 (3): 668-74. DOI: https://doi. org/10.1038/mt.2013.284
20. Coughlan L., Kremer E.J., Shayakhmetov D.M. Adenovirus-based vaccines-a platform for pandemic preparedness against emerging viral pathogens. Mol. Ther. 2022; 30 (5): 1822-49. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ymthe.2022.01.034
21. McMahon M., Asthagiri Arunkumar G., Liu W.C., Stadlbauer D., Albrecht R.A., Pavot V., Aramouni M., Lambe T., Gilbert S.C., Krammer F. Vaccination with viral vectors expressing chimeric hemagglutinin, np and m1 antigens protects ferrets against influenza virus challenge. Front. Immunol. 2019; 10: 2005. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02005
22. Bassett J.D., Swift S.L., Bramson J.L. Optimizing vaccine-induced CD8(+) T-cell immunity: focus on recombinant adenovirus vectors. Expert Rev Vaccines. 2011; 10 (9): 1307-19. DOI: https://doi.org/10.1586/erv.11.88
23. Barouch D.H., Alter G., Broge T., Linde C., Ackerman M.E., Brown E.P., Borducchi E.N., Smith K.M., Nkolola J.P., Liu J., Shields J., Parenteau L., Whitney J.B., Abbink P., Ng'ang'a D.M., Seaman M.S., Lavine C.L., Perry J.R., Li W., Colantonio A.D., Lewis M.G., Chen B., Wenschuh H., Reimer U., Piatak M., Lifson J.D., Handley S.A., Virgin H.W., Koutsoukos M., Lorin C., Voss G., Weijtens M., Pau M.G., Schuitemaker H. Protective efficacy of adenovirus/protein vaccines against SIV challenges in rhesus monkeys. Science. 2015; 349 (6245): 320-4. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aab3886
24. Radha C., Salotra P., Bhat R., Bhatnagar R. Thermostabilization of protective antigen--the binding component of anthrax lethal toxin. J. Biotechnol. 1996; 50 (2-3): 235-42. DOI: https://doi.org/10.1016/0168-1656(96)01569-6
25. Singh S., Singh A., Aziz M.A., Waheed S.M., Bhat R., Bhat-nagar R. Thermal inactivation of protective antigen of Bacillus anthracis and its prevention by polyol osmolytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 322 (3): 1029-37. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2004.08.020
26. Flick-Smith H.C., Walker N.J., Gibson P., Bullifent H., Hay-ward S., Miller J., Titball R.W., Williamson E.D. A recombinant carboxy-terminal domain of the protective antigen of Bacillus anthracis protects mice against anthrax infection. Infect. Immun. 2002; 70 (3): 1653-6. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.70.3.1653-1656.2002
Immynologiya. 2022; 43 (1): 5-17. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-5-17 (in Russian)
6. Li L., Petrovsky N. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity. Expert Rev Vaccines. 2016; 15 (3): 313-29. DOI: https://doi.org/10.1586/14760584.2016.1124762
7. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B., Ataullakhanov R. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x
8. Milicic A., Rollier C.S., Tang C.K., Longley R., Hill A.V.S., Reyes-Sandoval A. Adjuvanting a viral vectored vaccine against pre-erythrocytic malaria. Scientific reports. 2017; 7 (1): 7284. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41598-017-07246-0
9. Fougeroux C., Turner L., Bojesen A.M., Lavstsen T., et al. Modified MHC class II-associated invariant chain induces increased antibody
responses against plasmodium falciparum antigens after adenoviral vaccination. J Immunol. 2019; 202 (8): 2320-31. DOI: https://doi.org/10.4049/ jimmunol.1801210
10. Holst P.J., Sorensen M.R., Mandrup Jensen C.M., Orskov C., Thomsen A.R., Christensen J.P. MHC class II-associated invariant chain linkage of antigen dramatically improves cell-mediated immunity induced by adenovirus vaccines. J Immunol. 2008; 180 (5): 3339-46. DOI: https:// doi.org/10.4049/jimmunol.180.5.3339
11. Capone S., Naddeo M., D'Alise A.M., Abbate A., Grazioli F., Del Gaudio A., Del Sorbo M., Esposito M.L., Ammendola V., Perretta G., Taglioni A., Colloca S., Nicosia A., Cortese R., Folgori A. Fusion of HCV nonstructural antigen to MHC class II-associated invariant chain enhances T-cell responses induced by vectored vaccines in nonhuman primates. Mol Ther. 2014; 22 (5): 1039-47. DOI: https://doi.org/10.1038/mt.2014.15
12. Katharios-Lanwermeyer S., Holty J.E., Person M., Sejvar J., Haberling D., Tubbs H., Meaney-Delman D., Pillai S.K., Hupert N., Bower W.A., Hendricks K. Identifying meningitis during an anthrax mass casualty incident: systematic review of systemic anthrax since 1880. Clin Infect Dis. 2016; 62 (12): 1537-45. DOI: https://doi.org/10.1093/cid/ciw184
13. Collier R.J. Membrane translocation by anthrax toxin. Mol Aspects Med. 2009; 30 (6): 413-22. DOI: https://doi.org/10.1016/j.mam.2009.06.003
14. Mikshis N.I., Popova P.Y., Semakova A.P., Kutyrev V.V. Licensed anthrax vaccines and experimental preparations at the stage of clinical trials. J. Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. 2017; 94 (4): 112-26. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-4 (in Russian)
15. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986. P. 11.
16. Shcherbinin D.N., Esmagambetov I.B., Noskov A.N., Selyani-nov Yu.O., Tutykhina I.L., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Narodits-kiy B.S., Gintsburg A.L. Protective immune response against Bacillus anthracis induced by intranasal introduction of a recombinant adenovirus expressing the protective antigen fused to the Fc-fragment of IgG2a. Acta Naturae. 2014; 6 (1): 76-84. PMID: 24772330 (in Russian)
17. Shen Y., Guo Q., Zhukovskaya N.L., Drum C.L., Bohm A., Tang W.J. Structure of anthrax edema factor-calmodulin-adenosine 5'-(a,p-methylene)-triphosphate complex reveals an alternative mode of ATP binding to the catalytic site. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 317 (2): 309-14. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2004.03.046
18. Folegatti P.M., Ewer K.J., Aley P.K., Angus B., Becker S, Belij-Rammerstorfer S., Bellamy D., Bibi S., Bittaye M., Clutterbuck E.A., Dold C., Faust S.N., Finn A., Flaxman A.L., Hallis B., Heath P., Jenkin D., Lazarus R., Makinson R., Minassian A.M., Pollock K.M., Ramasamy M., Robinson H., Snape M., Tarrant R., Voysey M., Green C., Douglas A.D.,
Сведения об авторах
Первойкина Кристина Алексеевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0780-5998
Щербинин Дмитрий Николаевич - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8518-1669
Вахтинский Владимир Михайлович - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0002-9074-9981
Hill A.V.S., Lambe T., Gilbert S.C., Pollard A.J.; Oxford COVID Vaccine Trial Group. Safety and immunogenicity of the ChAdOxl nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, singleblind, randomised controlled trial. Lancet. 2020; 396 (10249): 467-78. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31604-4
19. Antrobus R.D., Coughlan L., Berthoud T.K., Dicks M.D., Hill A.V., Lambe T., Gilbert S.C. Clinical assessment of a novel recombinant simian adenovirus ChAdOx1 as a vectored vaccine expressing conserved Influenza A antigens. Mol Ther. 2014; 22 (3): 668-74. DOI: https:// doi.org/10.1038/mt.2013.284
20. Coughlan L., Kremer E.J., Shayakhmetov D.M. Adenovirus-based vaccines-a platform for pandemic preparedness against emerging viral pathogens. Mol Ther. 2022; 30 (5): 1822-49. DOI: https://doi. org/10.1016/j.ymthe.2022.01.034
21. McMahon M., Asthagiri Arunkumar G., Liu W.C., Stadlbauer D., Albrecht R.A., Pavot V., Aramouni M., Lambe T., Gilbert S.C., Krammer F. Vaccination with viral vectors expressing chimeric hemagglutinin, np and m1 antigens protects ferrets against influenza virus challenge. Front Immunol. 2019; 10: 2005. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02005
22. Bassett J.D., Swift S.L., Bramson J.L. Optimizing vaccine-induced CD8(+) T-cell immunity: focus on recombinant adenovirus vectors. Expert Rev Vaccines. 2011; 10 (9): 1307-19. DOI: https://doi.org/10.1586/erv.11.88
23. Barouch D.H., Alter G., Broge T., Linde C., Ackerman M.E., Brown E.P., Borducchi E.N., Smith K.M., Nkolola J.P., Liu J., Shields J., Parenteau L., Whitney J.B., Abbink P., Ng'ang'a D.M., Seaman M.S., Lavine C.L., Perry J.R., Li W., Colantonio A.D., Lewis M.G., Chen B., Wenschuh H., Reimer U., Piatak M., Lifson J.D., Handley S.A., Virgin H.W., Koutsoukos M., Lorin C., Voss G., Weijtens M., Pau M.G., Schuitemaker H. Protective efficacy of adenovirus/protein vaccines against SIV challenges in rhesus monkeys. Science. 2015; 349 (6245): 320-4. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aab3886
24. Radha C., Salotra P., Bhat R., Bhatnagar R. Thermostabiliza-tion of protective antigen--the binding component of anthrax lethal toxin. J Biotechnol. 1996; 50 (2-3): 235-42. DOI: https://doi.org/10.1016/0168-1656(96)01569-6
25. Singh S., Singh A., Aziz M.A., Waheed S.M., Bhat R., Bhatnagar R. Thermal inactivation of protective antigen of Bacillus anthracis and its prevention by polyol osmolytes. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 322 (3): 1029-37. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.bbrc.2004.08.020
26. Flick-Smith H.C., Walker N.J., Gibson P., Bullifent H., Hay-ward S., Miller J., Titball R.W., Williamson E.D. A recombinant carboxy-terminal domain of the protective antigen of Bacillus anthracis protects mice against anthrax infection. Infect Immun. 2002; 70 (3): 1653-6. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.70.3.1653-1656.2002
Authors' information
Kristina A. Pervoykina - Junior Researcher of the Molecular Biotechnology Lab. of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-0780-5998
Dmitrii N. Shcherbinin - PhD, Senior Researcher of Molecular Biotechnology Lab. of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-8518-1669
Vladimir M. Vakhtinskii - Junior Researcher of the Molecular Biotechnology Lab. of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0009-0002-9074-9981
Авдонина Елена Дмитриевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8059-9743
Верховская Людмила Викторовна - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии, ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4731-1629
Шмаров Максим Михайлович - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; доцент каф. инфектологии и вирусологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5268-1296
Логунов Денис Юрьевич - академик РАН, д-р биол. наук, зам. директора по научной работе ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4035-6581
Гинцбург Александр Леонидович - академик РАН, д-р биол. наук, проф., директор ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; зав. кафедрой инфектологии и вирусологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1769-5059
Elena D. Avdonina - Junior Researcher of the Molecular Biotechnology Lab. of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0001-8059-9743
Ludmila V. Verkhovskaya - PhD, Leader Researcher of Molecular Biotechnology Lab. of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-4731-1629
Maksim M. Shmarov - Dr. Sci., Head of the Molecular Biotechnology Lab. of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia; Assistant Prof. of the Infectology and Virology Chair of the I.M. Sechenov First MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5268-1296
Denis Yu. Logunov - Academician of RAS, Dr.Sci., Deputy Director for Science of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-4035-6581
Alexandr L. Gintsburg - Academician of RAS, Dr.Sci., Prof., Director of the N.F. Gamaleya FRCEM of the MOH of Russia; Head of the Infectology and Virology Chair of the I.M. Sechenov First MSMU of the MOH of Russia (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-1769-5059
