CC BY
251
36
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ РЕВМАТОЛОГИИ
И.А. Гусева1, Н.В. Демидова1, Н.Е. Сорока2, А.А. Новиков1, Е.Л. Лучихина1, Е.Н. Александрова1, Г.В. Лукина1, Е.В. Федоренко1, Е.С. Аронова1, Е.Ю. Самаркина1, М.Н. Болдырева3, Д.Ю. Трофимов2,
Д.Е. Каратеев1, Е.Л. Насонов1
1 Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва, Российская Федерация 2 Научно-производственная фирма «ДНК-Технология», Москва, Российская Федерация 3 Институт иммунологии ФМБА, Москва, Российская Федерация
Иммуногенетические аспекты раннего ревматоидного артрита
Изучено распределение аллелей гена HLA-DRB1 у больных ранним ревматоидным артритом и здоровых лиц контрольной группы российской популяции и оценена их значимость в качестве молекулярно-генетических маркеров предрасположенности и протекции ревматоидного артрита. Определена сила ассоциативной связи аллелей гена HLA-DRB1 с продукцией антител к циклическим цитруллинированным пептидам и ревматоидному фактору класса М. В исследовании проведено сравнение методов высоко- и низкоразрешающего генотипирования аллелей HLA-DRB1. У больных ранним ревматоидным артритом обнаружены аллели гена HLA-DRB1, являющиеся маркерами риска и протекции ревматоидного артрита, детерминирующие продукцию антител к циклическим цитруллинированным пептидам, но не ассоциированные с антителами класса M к ревматоидному фактору. Полученные данные могут свидетельствовать о различных аутоиммунных механизмах патогенеза ревматоидного артрита.
Ключевые слова: ревматоидный артрит, HLA-DRB1, shared epitope, антитела к циклическим цитруллинированным пептидам, ревматоидный фактор.
(Вестник РАМН. 2013; 4:36-43)
Введение
Ревматоидный артрит (РА) — хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани, характеризующееся деструктивным поражением суставов, в патогенезе которого значительную роль играют аутоиммунные механизмы [1]. РА является мультифакториальным заболеванием, при котором взаимодействие генетической составляющей и факторов внешней среды обусловливает не только развитие болезни, но и его выраженный клинический полиморфизм.
В недавнем 5-летнем проспективном исследовании на материале 570 пациентов с недифференцированным артритом и 676 пациентов с ранним артритом с длитель-
ностью болезни не более 2 лет на момент включения в исследование было показано, что такие лабораторные маркеры, как антитела к циклическим цитруллинированным пептидам (АЦЦП), антитела к модифицированному ци-труллинированному виментину, ревматоидный фактор — антитела класса IgM (IgM РФ) — в большей степени и C-реактивный белок и аллели HLA-DRB1 (SE+) — в меньшей степени, являются не только предикторами развития РА, но и прогностическими маркерами деструктивного поражения суставов [2].
Среди иммунологических показателей АЦЦП являются на сегодня наилучшим, апробированным на практике лабораторным маркером для диагностики и прогнозирования заболевания [3—6]. АЦЦП обладают аналогичной
#
I.A. Guseva1, N.V. Demidova1, N.E. Soroka2, A.A. Novikov1, E.L. Lutchihina1, E.N. Alexandrova1, G.V. Lukina1, E.V. Fedorenko1, E.S. Aronova1, E.Y. Samarkina1, M.N. Boldyreva3, D.Y. Trofimov2, D.E. Karateev1,
E.L. Nasonov1
1 Research Institute of Rheumatology RAMS, Moscow, Russian Federation
2 Joint Stock Company «DNA-Technology», Moscow, Russian Federation
3 National Research Centre Institute of Immunology FMBA, Moscow, Russian Federation
Immunogenetic Aspects Qf Early Rheumatoid Arthritis
The study is aimed to investigate the distribution of alleles of HLA-DRB1 gene in patients with early rheumatoid arthritis and healthy individuals in Russian population, and evaluate their significance as molecular genetic markers of rheumatoid arthritis predisposition and protection. The association between alleles of HLA-DRB1 genes, antibodies to cyclic citrullinated peptides and IgM rheumatoid factor was also studied. Low and high resolution HLA-DRB1 genotyping were compared. In the cohort of patients with early rheumatoid arthritis, the alleles of HLA-DRB1 gene were found to be markers of rheumatoid arthritis protection/risk, especially in the homozygous state. They determined production of antibodies to cyclic citrullinated peptides but were not associated with rheumatoid factor IgM levels. These findings support different autoimmune mechanisms of rheumatoid arthritis pathogenesis.
Key words: rheumatoid arthritis, HLA-DRB1, shared epitope, antibodies to cyclic citrullinated peptides, rheumatoid factor.
(Vestnik Rossiiskoi Akademii Meditsinskikh Nauk — Annals of the Russian Academy of Medical Sciences. 2013. 4: 36-43)
#
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ РЕВМАТОЛОГИИ
чувствительностью и более высокой специфичностью по сравнению с IgM РФ. АЦЦП наряду с РФ включены в новые классификационные критерии РА с градацией уровней этих серологических маркеров в баллах: < принятой для лаборатории нормы — 0 баллов, <3 норм (низкопозитивный) — 2 балла, >3 норм (высокопозитивный) — 3 балла [7].
В шведском исследовании АЦЦП были обнаружены в ряде сывороток больных РА, коллекционированных за несколько лет до клинической манифестации заболевания [8, 9]. Такая ранняя продукция АЦЦП может свидетельствовать о нераспознанном измененном (ауто)им-мунитете, детерминированном сочетанием генетических и внешнесредовых факторов.
Среди всех установленных к настоящему времени генетических маркеров, ассоциированных или сцепленных с РА, наибольший вклад принадлежит гену HLA-DRB1, картированному на коротком плече хромосомы 6 (6q21.3) (30—40% по сравнению с 5% для совокупности всех других маркеров) [10].
Были предложены различные гипотезы и классификации для объяснения выраженной положительной и отрицательной взаимосвязи антигенов/генов локуса HLA-DRB1 и РА [11—15], суть которых была изложена нами ранее [16]. В целом авторы различных подходов к классификации, несмотря на некоторые расхождения, подразделяют аллели HLA-DRB1 на аллели риска (Р) и протекции (П). Ряд аллелей был отнесен к нейтральным (Х).
Наиболее часто в научной литературе используют классификацию аллелей DRB1 по PK. Gregersen и со-авт. [11]. Согласно их гипотезе, чувствительность к РА ассоциирована с аллелями DRB1, кодирующими высококонсервативную аминокислотную последовательность в позиции 70—74 (QKRAA/QRRAA/RRRAA) в 3-м гипервариабельном регионе молекулы DRp1, которая получила название SE (Shared Epitope — общий, схожий эпитоп). К аллелям SE относят *0101, *0102, *0401, *0404, *0405, *0408, *10. Еще ряд аллелей, относящихся к SE по аминокислотной последовательности в позиции 70—74, либо чрезвычайно редко, либо практически не встречаются у лиц белой расы.
Цель исследования: изучить распределение аллелей гена HLA-DRB1 у больных ранним ревматоидным артритом (РРА) и в контрольной группе здоровых лиц российской популяции и оценить их значимость в качестве молекулярно-генетических маркеров предрасположенности и протекции РА, а также определить силу ассоциативной связи изученных аллелей с продукцией АЦЦП и IgM РФ.
Пациенты и методы Участники исследования
Исследование проведено в рамках программы «Ранний артрит: диагностика, исход, критерии, активное лечение (РАДИКАЛ)». В проспективное наблюдение были включены пациенты с достоверным диагнозом «Ревматоидный артрит» согласно критериям Американской коллегии ревматологов (АКР) 1987 г., с длительностью заболевания не более 2 лет. К моменту включения в исследование больные не лечились базисными противовоспалительными препаратами и глюкокортикоидами.
Обследовано 123 пациента (21 мужчина, 102 женщины). Возраст больных варьировал от 18 до 72 лет и в среднем составил 48,9+13,4 лет. Средняя продолжительность заболевания на момент включения в ис-
следование была равна 7,5+6,1 мес (от 1,5 до 24 мес), причем 73 (59%) пациента были взяты под наблюдение в первые 6 мес после появления признаков заболевания. Эрозии кистей и стоп выявлены у 18,7% больных. АЦЦП и IgM РФ идентифицированы у 61,0 и 67,5% пациентов, соответственно.
Методы исследования
Определение IgM РФ проводили методом иммунонефелометрии на автоматическом анализаторе «BN-100» (Dade Behring, Германия); верхняя граница нормы (cut-off) — 15 МЕ/л.
Концентрацию АЦЦП измеряли при помощи иммуноферментного метода с использованием коммерческого набора фирмы «Axis-Shield Diagnostic Ltd» (Великобритания) согласно инструкции фирмы-производителя; cut-off — 5 Ед/мл.
Геномная ДНК была выделена методом солевой экстракции с использованием хлорида натрия. Для базового низкоразрешающего генотипирования локуса HLA-DRB1 на уровне групп аллелей использовали метод на основе классической методики сиквенс-специфических праймеров (Sequence Specific Primers, SSP), модифицированной для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Разработанная тест-система представляла собой 13 комплектов реагентов, предназначенных для выявления в образце следующих групп аллелей локуса HLA-DRB1: *01, *15(*02), *16(*02), *03, *04, *11(*05), *12(*05), *13(*06), *14(*06), *07, *08, *09, *10.
Накопление продуктов амплификации регистрировали с помощью флуоресцентно-меченого зонда типа Taq-man, расположенного на участке экзона 2 локуса HLA DRB1, общего для всех групп аллелей.
ПЦР, детекцию продуктов амплификации в режиме реального времени и интерпретацию полученных результатов осуществляли с помощью детектирующего ам-плификатора «ДТ-96» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) и программного обеспечения к нему.
Высокоразрешающее генотипирование аллелей DRB1, позволяющее установить последовательность нуклеотидов и точно определить аллель до 4—8 знаков после значка «*» (например, DRB1*040101, *0404, *010101, *150101, *130101, *110101 и т.д.), было выполнено на секвенаторе «3130I Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, США). Эк-зон 2 гена DRB1 был амплифицирован с использованием групп-специфических праймеров с последующим секве-нированием ампликонов.
Низкоразрешающее генотипирование было проведено у всех 123 больных, высокоразрешающее — у 118. В соответствии с новой номенклатурой системы HLA 2010 г. при обозначении аллелей группы цифр разделяются двоеточием (например, HLA-DRB1*04:01). Возможно более детальное обозначение аллелей (HLA-DRB1*04:01:02) или даже DRB1*04:01:02:01. Однако в нашем тексте мы будем использовать обозначение аллелей HLA-DR локуса, рекомендованное номенклатурным комитетом 1987 г., принятое в подавляющем большинстве цитируемых нами исследований.
В качестве группы контроля выступали 300 здоровых доноров крови без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним, сопоставимых по полу и возрасту с группой больных. У всех доноров было проведено базовое низкоразрешающее генотипирование на уровне групп аллелей гена HLA-DRB1. Первым 135 донорам было выполнено высокоразрешающее олиготипи-рование аллелей гена DRB1*04 методом мультиплексной ПЦР с использованием сиквенс-специфических прайме-
#
37
38
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 4
ров [17]. АЦЦП и IgM РФ в контрольной группе не определяли, но применяли усредненные значения позитивности по этим маркерам, исходя из данных метаанализа [18].
Статистическая обработка данных
Анализ результатов проводили с использованием версии 10.0 статистической программы «SPSS». Различия в распределении частот аллелей и генотипов, а также иммунологических параметров как бинарных переменных (положительное или отрицательное значение теста) между группами оценивали по величине критерия независимости х2. Для оценки меры риска развития болезни вычисляли показатель OR (odds ratio) с подсчетом 95% доверительных интервалов (ДИ). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.
Результаты
Частоты аллелей HLA-DRB1 у больных ранним ревматоидным артритом и в контрольной группе
Анализ распределения аллелей гена HLA-DRB1 проведен в группе 118 больных РРА, прошедших тестирование высокоразрешающим методом.
Носительство (фенотип) хотя бы одного группоспецифического аллеля *01 выявлено у 29,7% больных РРА (35/118) и у 18,8% лиц контрольной группы (56/300; р =0,02). Носительство хотя бы одного группоспецифи-
ческого аллеля *04 обнаружено у 39,0% больных (46/118) и 19,3% лиц контрольной группы (58/300; р =0,0004). Носительство группоспецифического аллеля *10 статистически значимо не различалось в группе РРА (5,1%) и контрольной группе (2,7%; р >0,05).
Сравнительная характеристика генотипических частот аллелей DRB1 среди больных РРА и в контрольной выборке здоровых лиц представлена в табл. 1. Подсчет частот аллелей проводился относительно числа аллелей на двух хромосомах (2x118=236 аллелей в группе больных, 2x300=600 аллелей в контрольной группе).
Как видно из представленных данных, распределение аллелей в исследуемой и контрольной группе в целом статистически значимо различалось (%2 =38,2 при 9 степенях свободы; р <0,00001). Различия касались группоспецифических аллелей *01, *02, *04, *06 и *07.
Аллели *01 и *04 повышали риск развития РА в 2 раза (OR =2,0; 95% ДИ 1,3-3,2; р =0,002 и OR =2,0; 95% ДИ 1,2—3,3; р =0,005, соответственно).
Аллели *02, *06 и *07, напротив, снижали предрасположенность к развитию РА, т.е. оказывали протективный эффект (OR =0,5; 95% ДИ 0,3—0,8; р =0,003, OR =0,6; 95% ДИ 0,4—0,9; р =0,02, OR =0,6; 95% ДИ 0,3—0,9; р =0,03, соответственно).
Среди аллелей гена *04 в группе больных РРА и в контрольной группе выявлены как SE-позитивные аллели *0401, *0404, *0405, *0408 (суммарно 18,6 и 8,8%, соответственно; OR =2,4; 95% ДИ 1,3—4,1; p =0,002), так и SE-негативные *0402, *0403, *0407 (суммарно 3,9 и 3,8%, соответственно; р >0,05). У больных РРА доля
Таблица 1. Частоты аллелей HLA среди больных ранним ревматоидным артритом (n =118) и в контрольной группе (n =300)
HLA-DRB1 РРА (2n =236), абс. (%) Контроль (2n =600), абс. (%) OR [95% ДИ] p
*01 41 (17,3) 57 (9,5) 2,0 [1,3—3,2] 0,002
*0101 34
*0102 6
*0103 0
*02 26 (11,0) 119 (19,8) 0,5 [0,3—0,8] 0,003
*15 20 (8,5) 79 (13,2) 0,6 [0,4—1,1] 0,07
*16 6 (2,5) 40 (6,7) 0,4 [0,1—0,9] 0,02
*03 23 (9,7) 45 (7,5) 1,3 [0,8—2,3] 0,4
*04 53 (22,5) 34 (12,6)# 2,0 [1,2—3,3] 0,005
*04(SE+) 44 (18,6) 24 (8,8)# 2,4 [1,3—4,1] 0,002
*0401 30 (12,7) 11 (4,1) 3,4 [1,6—7,5] 0,001
*0404 5 (2,1) 9(3,3)
*0405 4 (1,7) 0
*0408 5 (2,1) 4 (1,5)
*04 (SE-) 9 (3,9) 10 (3,8)
*0402 2 (0,8) 4 (1,5)
*0403 6 (2,5) 2 (0,7)
*0407 1 (0,4) 4 (1,5)
*05 34 (14,4) 101 (16,8) 0,8 [0,5—1,3] 0,5
*11 29 (10,6) 85 (14,2) 0,9 [0,5—1,4] 0,5
*12 5 (2,1) 16 (2,6) 0,8 [0,3—2,3] 0,8
*06 24 (10,2) 99 (16,5) 0,6 [0,4—0,9] 0,02
*13 23 (9,7) 85 (14,2) 0,7 [0,4—1,1] 0,1
*1301 12 (5,1)
*1302 5 (2,1)
*1303 6 (2,5)
*14 1 (0,4) 14 (2,3) 0,2 [0,0—1,3] 0,08
*07 20 (8,5) 86 (14,3) 0,6 [0,3—0,9] 0,03
*08 6 (2,5) 11 (1,8) 1,4 [0,5—4,1] 0,6
*09 3 (1,3) 4 (0,7) 1,9 [0,3—10,2] 0,4
*10 6 (2,5) 8 (1,3) 1,9 [0,6—6,2] 0,2
Примечание. 2n — число хромосом у больных и лиц контрольной группы. # — расчеты проведены в группе 135 доноров (2n =270). К аллелям SE+ отнесены *0101, *0102, *0401, *0404, *0405, *0408, *10 [11]. РРА — ранний ревматоидный артрит, OR — отношение рисков, ДИ — доверительный интервал.
#
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ РЕВМАТОЛОГИИ
Таблица 2. Частоты встречаемости антител к циклическим цитруллинированным пептидам и антител класса M к ревматоидному фактору и генотипов HLA-DRB1 (SE) в группе больных ранним ревматоидным артритом
Лабораторные маркеры РРА (n =123) Контроль (n =300) OR [95% ДИ]
АЦЦП 75 (61,0%) 15 (5,0%) 29,7 [15,2-59,0]
IgM РФ 83 (67,5%) 45 (15,0%) 11,8 [7,0-19,9]
SElow Хотя бы 1 SE+ 76 (61,8%) 108 (36,0%) 2,9 [1,8—4,5]
SE+/SE+ 25 (20,3%) 20 (6,6%) 5,1 [2,5-10,5]
SE+/SE- 51 (41,5%) 88 (29,4%) 2,4 [1,4—3,9]
SE-/SE- 47 (38,2%) 192 (64,0%) 1,0
SEMgh n=118 n=135
Хотя бы 1 SE+ 69 (58,5%) 45 (33,3%) 2,8 [1,6-4,9]
SE+/SE+ 22 (18,6%) 7 (5,2%) 5,7 [2,1-16,1]
SE+/SE- 47 (39,8%) 38 (28,1%) 2,3 [1,3—4,1]
SE-/SE- 49 (41,5%) 90 (66,7%) 1,0
Примечание. АЦЦП — антитела к циклическим цитруллинированным пептидам, IgM РФ — антитела класса M к ревматоидному фактору, РРА — ранний ревматоидный артрит, SElow — при низкоразрешающем генотипировании 123 пациентов и 300 лиц контрольной группы к SE условно отнесены аллели *01, *04, *10, SEhigh — при высокоразрешающем генотипировании 118 пациентов и 135 лиц контрольной группы к SE отнесены аллели *0101, *0102, *0401, *0404, *0405, *0408, *10, SE — shared epitope. АЦЦП и IgM РФ в группе контроля не определяли, но использовали усредненные величины позитивности по этим маркерам у здоровых лиц в различных популяциях, исходя из данных метаанализа K. Nishimura и соавт. [18]. OR для SE+/SE+ и SE+/SE- считали относительно SE-/SE-.
аллелей, относящихся к *04(SE+) составила 87%, у лиц контрольной группы — 70%. Аллель *0401 являлся наиболее значимым маркером риска развития РРА (OR =3,4; 95% ДИ 1,6—7,5; p =0,001).
Среди аллелей гена *01 в группе больных обнаружено только 2 аллеля (*0101 и *0102), имеющих отношение к SE. По литературным данным, аллель *0103, отнесенный в различных классификационных системах к аллелям протекции, в европейских популяциях встречается чрезвычайно редко (1,0—0,5%).
По данным зарубежных авторов, среди аллелей гена *06 в контроле подавляющее большинство представлено вариантами *1301 и *1302, которые, по разным классификациям, относят к аллелям протекции. Аллель *1303, который согласно классификации S. Tezenas и TS. du Mont-cel [15] относится к SE, а по другим схемам — к аллелям протекции, в здоровой популяции встречается с частотой 0,4—1,0%. В подавляющем большинстве зарубежных исследований ген DRB1*06 относят к маркерам протекции.
Среди аллелей гена *02, обладающего протектив-ным эффектом, вариант *16 статистически значимо реже встречался у больных РРА по сравнению с контролем (OR =0,4; 95% ДИ 0,1—0,9; p =0,02), а для варианта *15 выявлена выраженная тенденция к статистически значимым различиям в группе больных и контроле (р =0,07).
Генотипы риска и протекции раннего ревматоидного артрита и их взаимосвязь с антителами к циклическим цитруллинированным пептидам и ревматоидному фактору класса M
В табл. 2 представлены частоты генотипов SE гена HLA-DRB1, величины АЦЦП, IgM РФ у больных РРА и в контрольной группе, а также дана оценка величины риска развития РА при выявлении этих маркеров. Частоты SE в группе больных и контроле представлены в зависимости от метода генотипирования. При низкоразрешающем генотипировании частоты SE (SElow) определены у 123 пациентов РРА и 300 лиц контрольной группы; при высокоразрешающем SEhigh — у 118 пациентов и 135 лиц контрольной группы. Как видно из таблицы, наибольший риск развития РА связан с позитивностью по АЦЦП и далее по убывающей —
с IgM РФ и SE. Предрасположенность к РА, связанная с носительством аллелей SE, носила дозозависимый характер: наличие двойного набора SE повышало чувствительность к заболеванию в 5 раз, при наличии в генотипе одного аллеля SE риск снижался до 2,5 раза. В целом у носителей хотя бы одного аллеля SE вероятность заболеть РА была повышена в 3 раза по сравнению с лицами, у которых не были обнаружены аллели SE.
Среди истинных гомозигот по SE у больных РРА наиболее часто (5/118; 4,2%) встречался генотип *01/*01, а также в 3 (2,5%) случаях был обнаружен генотип *0401/*0401. В контрольной выборке генотип *01/*01 определялся в 0,7% (1/135) случаев, генотип *0401/*0401 — в 1,5% (2/135). Все различия не носили статистически значимого характера.
Среди генотипов-компаундов по SE (в генотипе присутствуют 2 неидентичных патологических аллеля SE) у больных РРА статистически значимо чаще, чем в контрольной группе, обнаруживали генотип *01/*0401 (10/118; 8,4% и 1/135; 0,7%, соответственно; OR =12,4; 95% ДИ 1,6-263,0; р <0,005). Кроме того, у 2 пациентов был выявлен генотип *01/*10, и по 1 случаю — генотипы *0401/*0405 и *0401/*0408. В контрольной группе в 1 случае идентифицирован компаунд-вариант *01/*0408.
Также был проведен анализ ассоциативной связи иммунологических показателей АЦЦП и IgM РФ как бинарных переменных (позитивное и негативное значение) c аллелями и генотипами гена HLA-DRB1 с учетом их подразделения в различных классификационных системах на аллели и генотипы риска и протекции (табл. 3).
Носительство хотя бы одного аллеля SEhigh повышало риск развития АЦЦП-позитивного РА в 5,7 раза (OR =5,7; 95% ДИ 2,6-12,7; p <1х10-5), причем наиболее значимый риск был связан с двойным набором аллелей SEhigh (OR =6,0; 95% ДИ 1,6-24,8), в то время как 1 аллель SE в генотипе только в 2,6 раза увеличивал риск АЦЦП-позитивного РА.
При низкоразрешающем генотипировании по сравнению с высокоразрешающим установленная взаимосвязь наличия АЦЦП с аллелями SElow была менее выраженной. При наличии хотя бы 1 аллеля SElow величина риска
#
39
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 4
Таблица 3. Сравнение величины взаимосвязи (OR) генотипов HLA-DRB1 с позитивностью по АЦЦП и IgM РФ в группе пациентов РРА в зависимости от метода генотипирования
Аллели DRB1 Число пациентов АЦЦП+ (n =70) IgM РФ+ (n =77)
с РРА (n =118) Число пациентов OR [95% ДИ] Число пациентов OR [95% ДИ]
Высокоразрешающее SEhigh 22 18 6,0 [1,6-24,8] 16 1,7 [0,5—5,9]
генотипирование +/+ 47 31 2,6 [1,0-6,3] 31 1,2 [0,5—3,1]
+/- -/- 49 21 1,0 30 1,0
Низкоразрешающее SElow 26 20 4,0 [1,2-13,8] 19 1,4 [0,4-4,7]
генотипирование +/+ 48 30 2,0 [0,8—5,0] 29 0,8 [0,3—2,0]
+/- -/- 44 20 1,0 29 1,0
Высокоразрешающее DERAA# 16 5 0,3 [0,1-0,9] 8 2,1 [0,6—6,8]
генотипирование +/+ и +/--/- 99 63 1,0 67 1,0
Высокоразрешающее d70+## 47 27 3,2 [1,2—8,5] 15 1,1 [0,4-2,8]
генотипирование +/+ и +/- 44 13 1,0 1,0
-/-
Примечание. # — n =115 (из анализа исключены 3 пациента с генотипом DERAA/SE+), ## — n =91 (из анализа исключены 27 пациентов с генотипом D70+/SE+). РРА — ранний ревматоидный артрит, АЦЦП — антитела к циклическим цитруллинированным пептидам, IgM РФ — антитела класса M к ревматоидному фактору, SEhigh — при высокоразрешающем генотипировании к SE относят аллели *0101, *0102, *0401, *0405, *0408, *1001 согласно P.K. Gregersen [11], SElow — при низкоразрешающем генотипировании к SE условно можно отнести аллели *01, *04, *10. Величину OR c 95% ДИ у больных с SE+/SE+ и SE+/SE- рассчитывали относительно больных с отсутствием SE(-/-). DERAA — аллели протекции *0103, *0402, *11, *1301, *1302согласно классификации I.E. van der Horst-Bruinsma и соавт. [12]. D70+ — аллели протекции *0103, *16, *0402, *11, *12, *13, *07, *08согласно классификации D.L. Mattey и соавт. [13].
40
Таблица 4. Распределение генотипов HLA-DRB1 у пациентов с отрицательными, низкоположительными и высокоположительными значениями антител к циклическим цитруллинированным пептидам
Генотипы Количественное содержание АЦЦП, ЕД/мл
Gregersen [11] du Montcel <5,0 5,1-15,0 >15,0
[15] n =48 n =8 n =62
SE+/SE+ P/P 8,3% 12,5% 32,3%
SE+/SE- P/X 18,8 % 37,5% 21,0%
P/П 18,8% 12,5% 19,4%
SE-/SE- П/П 27,1% 25,0% 3,2%
П/Х 25,0% 12,5% 17,7%
Х/Х 12,5% 0% 6,4%
Примечание. АЦЦП — антитела к циклическим цитруллинированным пептидам, SE+ — аллели риска, SE- — все другие аллели согласно P.K. Gregercen и соавт. [11]. Р — все аллели риска (SE+ и *1303), П — все аллели протекции (*0103, *0402, *11, *12, *13кроме *1303, *14), X — нейтральные аллели (*03, *0403, *0407, *0411, *07, *08, *09) гагласно T.S. du Montcel и соавт. [15].
развития АЦЦП+РА составила 2,5 (95% ДИ 1,1—5,8), при двойном наборе SElow — 4,0 (95% ДИ 1,2—13,8), при наличии 1 аллеля SElow ассоциативная связь отсутствовала.
Ассоциативная взаимосвязь аллелей DRB1 c позитивностью по IgM РФ установлена не была (см. табл. 3).
Между наличием хотя бы одного протективного аллеля, кодирующего аминокислотную последовательность DERAA [12], и негативностью по АЦЦП была выявлена положительная ассоциативная взаимосвязь (OR =3,9; 95%, ДИ 1,1—14,0; р =0,03). Необходимо отметить, что из анализа были исключены 3 пациента с генотипом DERAA+/SE+ (у двух больных АЦЦП=100,0 ЕД/мл, у одного — отрицательное значение АЦЦП).
Протективные аллели, согласно D.L Mattey с соавт. [15], выявлены в 51,6% случаев и ассоциированы с позитивностью по АЦЦП. Из исследования было исключено 27 пациентов с сочетанием в генотипе аллелей риска SE и протективных аллелей D70+. Позитивность по АЦЦП в этой группе больных составила 66,7%.
Далее мы разделили пациентов на 3 категории в зависимости от 3 градаций уровня АЦЦП в классификационных критериях АКР/EULAR (2010) и проанализировали зависимость титров АЦЦП как категориальных переменных от генотипов DRB1 (табл. 4). Генотипы были
представлены согласно классификации P Gregersen [11] и TS. du Montcel [15]. Среди пациентов с отрицательными значениями АЦЦП преобладали носители генотипа SE-/SE- (64,6%) и редко встречались носители двух аллелей риска SE+/SE+ (8,3%). Среди носителей генотипа SE-/SE- превалировали пациенты хотя бы с 1 аллелем протекции в генотипе (52,1%). Низкоположительные значения АЦЦП обнаружены только у 8 пациентов, и среди них наиболее часто выявлялись у пациентов с генотипами SE+/SE- (50,0%) и SE-/SE- (37,5%), причем чаще у больных с генотипами Р/X (37,5%) и П/П (25,0%) и реже (12,5%) у носителей генотипов Р/Р, Р/П и П/Х. Высокоположительный показатель АЦЦП часто встречался у носителей гомозиготного генотипа SE+/SE+ (32,3%) и гетерозиготного генотипа SE+/SE- (40,4%). У носителей генотипа SE-/SE- высокие значения АЦЦП редко имели место у пациентов с генотипами П/П (3,2%) и Х/Х (6,4%) и относительно часто (17,7%) — у носителей генотипа П/Х.
В нашей выборке пациентов с РРА не было обнаружено взаимосвязи каких-либо конкретных аллелей DRB1 с титром АЦЦП, кроме аллелей, принадлежащих группоспецифическому гену *06. Аллели *1301 и *1302 были выявлены у 15 (12,7%) человек. У этих пациентов уровень
#
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ РЕВМАТОЛОГИИ
АЦЦП при включении в исследование был статистически ниже, чем у всех других больных (р =0,023). Наличие 1 из 2 аллелей в генотипе предсказывало развитие АЦЦП-негативного РА (OR =0,29; 95% ДИ 0,09—0,9; р =0,035). Когда мы исключили из анализа 3 человек, имеющих в своем генотипе аллель SE+, помимо аллелей *1301 или *1302, взаимосвязь сохранялась (OR =0,19; 95% ДИ 0,04-0,86; p =0,01).
Обсуждение
В исследование по изучению ассоциативной связи аллелей гена HLA-DRB1 с предрасположенностью к развитию РА и продукцией серологических маркеров АЦЦП и IgM РФ были включены больные с достоверным диагнозом РА по критериям АКР (1987). Длительность РА на момент включения в исследование не превышала 2 лет.
В изученной выборке пациентов маркерами предрасположенности к РА были гены *01 и *04, а маркерами-протекторами — гены *02, *06 и *07. В проведенных нами более ранних исследованиях на материале больных с семейным РА [19, 20] и длительно текущим эрозивным РА [21], с преобладающими III и IV рентгенологическими стадиями ген *04 выявляли с гораздо более высокой частотой (61,3 и 61,4%, соответственно), чем у больных РРА (39,0%), у которых при включении в исследование преобладали стадии I, IIA и IIB. Кроме того, у пациентов с тяжелым деструктивным поражением суставов выявляли только те аллели гена *04, которые относятся к SE(*0401, *0404, *0405и *0408). У больных РРА наряду с аллелями *04 (SE+) были обнаружены аллели *04, не относящиеся ни в одной классификационной системе к аллелям SE+ (*0402, *0403, *0407). Наши данные соотносятся с результатами зарубежных исследователей, в которых ряд генов, в т.ч. аллели DRB1, имели различия в частоте распределения в зависимости от выборки пациентов (длительно текущий РА с выраженным деструктивным поражением суставов, РРА, семейный РА).
Риск развития РРА при обнаружении гена *04 и *04 (SE+) низко- и высокоразрешающим способом составил 2,0 и 2,4, соответственно. В то же время при идентификации гена *04 низкоразрешающим методом риск развития РА с семейной отягощенностью по заболеванию и длительно текущего эрозивного РА составил в обоих случаях 6,6, а при выявлении аллелей гена *04 (SE+) высокоразрешающим способом — 12,7. Полученные данные свидетельствуют о том, что аллели гена HLA-DRB1 в большей степени детерминируют степень тяжести заболевания, чем чувствительность к нему. Кроме того, высокоразрешающее генотипирование позволяет дифференцировать аллели гена DRB1*04 на маркеры риска/прогноза течения РА, протективные и нейтральные аллели.
В настоящее время РА подразделяют на 2 субтипа болезни на основании наличия или отсутствия АЦЦП, что подтверждено результатами генетических исследований [22, 23]. Полученные данные о прогностической роли АЦЦП в развитии РА [8, 9], о неблагоприятном прогнозе течения болезни с более выраженным деструктивным поражением суставов и воспалительным компонентом у АЦЦП-позитивных (по сравнению с АЦЦП-негативными пациентами) [2, 24-27] дают основание полагать, что и патогенетические механизмы развития этих подтипов заболевания различаются. Действительно, выявление ассоциативной взаимосвязи аллелей DRB1 (SE+) с развитием РА в подгруппе АЦЦП-позитивных, но не АЦЦП-негативных пациентов, дало основание
голландским ученым высказать предположение о том, что аллели SE+ детерминируют развитие АЦЦП-позитивного (но не АЦЦП-негативного) РА [28], что было подтверждено в шведском исследовании [29].
Мы провели подробный анализ взаимосвязи продукции аутоантител с генотипами DRB1, используя результаты низко- и высокоразрешающего генотипирования. В нашей выборке больных с РРА установлена существенная связь продукции и уровня продукции АЦЦП не только с генотипами риска, но и с генотипами протекции, что подтверждает концепцию о вовлечении гена HLA-DRB1 наряду с другими генными локусами в развитие патологического иммунного процесса, в частности в продукцию аутоантител [30].
Высокоразрешающее генотипирование предоставило нам дополнительную информацию о взаимосвязи аллелей DRB1 и содержания АЦЦП. Взаимосвязь позитивности по АЦЦП и их концентрации с аллелями DRB1 носила дозозависимый характер: самый высокий титр антител был зафиксирован у носителей двойной дозы DRB1 (SE+), более низкий — у носителей 1 аллеля SE, самый низкий — у носителей протективных аллелей. Для группы РРА более адекватной явилась классификация аллелей по аминокислотной последовательности DERAA [12]. Среди конкретных аллелей протекции аллели *1301 и *1302 были ассоциированы с АЦЦП-негативным РА, что частично согласуется с результатом недавно проведенного метаанализа [31].
Вместе с тем необходимо отметить, что вопрос об отсутствии генетической детерминации АЦЦП-негативного РА аллелями DRB1 (SE+) окончательно не решен, поскольку совсем недавно было опубликовано исследование английских ученых об обнаружении положительной ассоциативной взаимосвязи аллелей DRB1 (SE+) как c АЦЦП-позитивным, так и с АЦЦП-негативным РА [32]. В исследование было включено значительное число АЦЦП-позитивных (n =4068) и АЦЦП-негативных (n =2040) пациентов РА, а также 13 000 здоровых лиц контрольной группы. Развитие РА в группе АЦЦП-негативных больных было статистически значимо ассоциировано с аллелями DRB1 (SE+), хотя сила этой ассоциации была в 3 раза меньшей, чем в группе АЦЦП-позитивных пациентов. Возможно, эти данные свидетельствуют о независимой предсказательной ценности аллелей DRB1 (SE+) в развитии РА у АЦЦП-негативных пациентов.
В нашей выборке пациентов с РРА не было обнаружено взаимосвязи аллелей DRB1 c продукцией IgM РФ — значимого маркера РА, что согласуется с рядом исследований, в которых высказывают предположение о том, что наличие корреляции между присутствием DRB1 (SE+) и продукцией IgM РФ в ряде исследований носит опосредованный характер ввиду тесной взаимосвязи АЦЦП и РФ [28, 33]. Полученные нами данные о различиях в генетической детерминации значимых серологических маркеров РА — АЦЦП и РФ — могут свидетельствовать о различных патогенетических механизмах развития РА.
Заключение
Таким образом, впервые на материале российских больных РА с длительностью заболевания не более двух лет исследована значимость иммуногенетических (аллели локуса DRB1 системы HLA) и иммунологических (АЦЦП и IgM РФ) маркеров в формировании чувствительности
#
41
ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 4
к развитию заболевания. Сравнение методов высоко-и низкоразрешающего генотипирования показало преимущество высокоразрешающего типирования аллелей DRB1, позволяющее уточнить взаимосвязь генетического маркера с продукцией диагностически значимых имму-
нологических маркеров РА. Показано, что аллели риска и протекции гена DRB1 детерминируют уровень синтеза АЦЦП, но не ассоциированы с продукцией IgM РФ, что может свидетельствовать о различных аутоиммунных механизмах патогенеза РА.
Ф
42
ЛИТЕРАТУРА
1. Насонов Е.Л., Каратеев Д.Е., Балабанова Р.М. Ревматоидный артрит. В кн.: Ревматология. Национальное руководство. Под редакцией Е.Л. Насонова, В.А. Насоновой. М.: ГЭОТАР-Медиа. 2008. С. 290-331.
2. de Rooy D.P C., van der Linden M.P M., Knevel R., de Rooy D.P, van der Linden M.P, Knevel R., Huizinga T.W., van der Helm-van Mil A.H. Predicting arthritis outcomes — what can be learned from the Leiden Early Arthritis Clinic? Rheumatology (Oxford). 2010; 51 (1): 93-100.
3. Новиков А.А., Александрова Е.Н., Насонов Е.Л. Клиническое значение антител к циклическому цитруллинированному пептиду: новые данные. Клин. медицина. 2007; 85 (8): 4-9.
4. Niewold T. B., Harrison M.J., Paget S.A. Anti-CCP antibody testing as a diagnostic and prognostic tool in rheumatoid arthritis. QJM. 2007; 100 (4): 193-201.
5. van Venrooij WJ., Zendman A.J. Anti-CCP2 antibodies: an overview and perspective of the diagnostic abilities of this serological marker for early rheumatoid arthritis. Clin. Rev. Allergy. Immunol. 2008; 34 (1): 36-39.
6. Aggarwal R., Liao K., Nair R. Anti-citrullinated peptide antibody assays and their role in the diagnosis of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2009; 61 (11): 1472-1483.
7. Aletaha D., Neogi .T, Silman A.J., Funovits J., Felson D.T., Bingham C.O., 3rd, Birnbaum N.S., Burmester G.R., Bykerk V.P., Cohen M.D., Combe B., Costenbader K.H., Dougados M., Emery P, Ferraccioli G., Hazes J.M., Hobbs K., Huizinga T.W., Kavanaugh A., Kay J., Kvien T.K., Laing T., Mease P, Menard H.A., Moreland L.W., Naden R.L., Pincus T., Smolen J.S., Stanislawska-Biernat E., Symmons D., Tak P.P., Upchurch K.S., Vencovsky J., Wolfe F., Hawker G. The 2010 American College of Rheumatology / European League Against Rheumatism Classification Criteria for Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum. 2010; 62 (9): 2569-2581.
8. Rantapaa-Dahlqvist S., de Jong B.A., Berglin E., Hallmans G., Wadell G., Stenlund H., Sundin U., van Venrooij W. J. Antibodies against cyclic citrullinated peptide and IgA rheumatoid factor predict the development of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 2003; 48 (10): 2741-2749.
9. Kokkonen H., Mullazehi M., Berglin E., Hallmans G., Wadell G., Ronnelid J., Rantapaa-Dahlqvist S. Antibodies of IgG, IgA and IgM isotypes against cyclic citrullinated peptide precede the development of rheumatoid arthritis. Arthr. Res. Ther. 2011; 13 (1): 13.
10. McAllister K.M., Eyre S., Orozco G. Genetics of rheumatoid arthritis: GWAS and beyond. Review. Open Access Rheumatology: Research and Reviews. 2011; 3: 31-46.
11. Gregersen P.K., Silver J., 'Winchester R.J. The shared epitope hypothesis: an approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1987; 30 (11): 1205-1213.
12. van der Horst-Bruinsma I.E., Visser H., Hazes J.M., Breedveld F.C., Verduyn W., Schreuder G.M., de Vries R.R., Zanelli E. HLA-DQ-associated predisposition to and dominant HLA-DR-associated protection against rheumatoid arthritis. Hum. Immunol. 1999; 60 (2): 152-158.
13. Mattey D.L., Dawes P.T., Gonzalez-Gay M.A., Garcia-Porrua C., Thomson W, Hajeer A.H., Ollier W.E. HLA-DRB1 alleles encoding an aspartic acid at position 70 protect against development of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 2001; 28 (2): 232-239.
14. de Vries N., Tijssen H., van Riel P.L., van de Putte L.B. Reshaping the shared epitope hypothesis: HLA-associated risk for rheumatoid
arthritis is encoded by amino acid substitutions at positions 67-74 of the HLA-DRB1 molecule. Arthritis Rheum. 2002; 46 (4): 921-928.
15. du Montcel S.T., Michou L., Petit-Teixeira E., Osorio J., Lemaire I., Lasbleiz S., Pierlot C., Quillet P, Bardin T., Prum B., Cornelis F., Clerget-Darpoux F. New classification of HLA-DRB1 alleles supports the shared epitope hypothesis of rheumatoid arthritis susceptibility. Arthritis Rheum. 2005; 52 (4): 1063-1068.
16. Гусева И.А., Насонов Е.Л. Современные иммуногенетические и иммунологические аспекты ревматоидного артрита. Вестник РАМН. 2008; 6: 7-13.
17. Болдырева М.Н., Грудакова Е.Г, Букина А.М. и др. Распределение HLA-DRB1*04 в семи этнических группах России. Мат-лы II(IV) Росс. съезда медицинских генетиков. Курск. 17-19 мая 2000. С. 156-157.
18. Nishimura K., Sugiyama D., Kogata Y., Tsuji G., Nakazawa T., Kawano S., Saigo K., Morinobu A., Koshiba M., Kuntz K.M., Kamae I., Kumagai S. Meta-analysis: diagnostic accuracy of anticyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor for rheumatoid arthritis. Ann. Intern. Med. 2007; 146 (11): 797-808.
19. Гусева И.А., Мякоткин В.А., Шарапова Е.П., Самаркина Е.Ю. Аллельный полиморфизм гена HLA-DRB1*04 и семейный ревматоидный артрит. Науч.-практ.ревматол. 2001; 3: 32.
20. Мякоткин В.А., Мошнина М.А., Крылов М.Ю., Гусева И.А. Поиск генов предрасположенности к ревматоидному артриту. Вестник РАМН. 2003; 7: 27-30.
21. Таукумова Л.А., Гусева И.А. Аллели HLA-DRB1 у пациентов с ревматоидным артритом. Науч.-практ. ревматол. 2004; 4: 29-34.
22. van der Helm-van Mil A.H., Huizinga T.W Advances in the genetics of rheumatoid arthritis point to subclassification into distinct disease subsets. Arthritis Res. Ther. 2008; 10 (2): 205.
23. Padyukov L., Seielstad M., Ong R.T., Ding B., Ronnelid J., Sed-dighzadeh M., Alfredsson L., Klareskog L.A. genome-wide association study suggests contrasting associations in ACPA-positive versus ACPA-negative rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 2011; 70 (2): 259-265.
24. Meyer O., Labarre C., Dougados M., Goupille P, Cantagrel A., Dubois A., Nicaise-Roland P, Sibilia J., Combe B. Anticitrullinated protein / peptide antibody assays in early rheumatoid arthritis for predicting five year radiographic damage. Ann. Rheum. Dis. 2003; 62 (2): 120-126.
25. van Gaalen F.A., Linn-Rasker S.P., van Venrooij WJ., de Jong B.A., Breedveld F.C., Verweij C.L., Toes R.E., Huizinga T.W Autoantibodies to cyclic citrullinated peptides predict progression to rheumatoid arthritis in patients with undifferentiated arthritis: a prospective cohort study. Arthr. Rheum. 2004; 50 (3): 709-715.
26. Kastbom A., Strandberg G., Lindroos A., Skogh T. Anti-CCP antibody test predicts the disease course during 3 years in early rheumatoid arthritis (the Swedish TIRA project). Ann. Rheum. Dis. 2004; 63 (9): 1085-1089.
27. Quinn M.A., Gough A.K., Green M.J., Devlin J., Hensor E.M., Greenstein A., Fraser A., Emery P. Anti-CCP antibodies measured at disease onset help identify seronegative rheumatoid arthritis and predict radiological and functional outcome. Rheumatology (UK). 2006; 45 (4): 478-480.
28. van der Helm-van Mil A.H., Verpoort K.N., Breedveld F.C., Huizinga T.W, Toes R.E., de Vries R.R. The HLA-DRB1 shared epitope alleles are primarily a risk factor for anti-cyclic citrul-
#
#
АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ РЕВМАТОЛОГИИ
linated peptide antibodies and are not an independent risk factor for development of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2007; 54 (4): 1117-1121.
29. Ding B., Padyukov L., Lundstrom E., Seielstad M., Plenge R.M., Oksenberg J.R., Gregersen P.K., Alfredsson L., Klareskog L. Different patterns of associations with anti-citrullinated protein antibody-positive and anti-citrullinated protein antibody-negative rheumatoid arthritis in the extended major histocompatibility complex region. Arthritis Rheum. 2009; 60 (1): 30-38.
30. Hill J.A., Southwood S., Sette A., Jevnikar A.M., Bell D.A., Cairns E. Cutting Edge: The conversion of arginine to citrulline allows for a high-affinity peptide interaction with the rheumatoid arthritis-associated HLA-DRB1*0401 MHC Class II molecule. J. Immunol. 2003; 171 (2): 538-541.
31. van der Woude D., Lie B.A., Lundstrom E., Balsa A., Feitsma A.L., Houwing-Duistermaat J.J., Verduijn W, Nordang G.B., Alfredsson L., Klareskog L., Pascual-Salcedo D., Gonzalez-Gay M.A., Lopez-Nevot M.A., Valero F., Roep B.O., Huizinga T.W., Kvien T.K.,
Martin J., Padyukov L., de Vries R.R., Toes R.E. Protection against anti-citrullinated protein antibody-positive rheumatoid arthritis is predominantly associated with HLA-DRB1*1301: a meta-analysis of HLA-DRB1 associations with anti-citrullinated protein antibodypositive and anti-citrullinated protein antibody-negative rheumatoid arthritis in four European populations. Arthritis Rheum. 2010; 62 (2): 1236-1245.
32. Viatte S., Plant D., Bowes J., Lunt M., Eyre S., Barton A., Worthington J. Genetic markers of rheumatoid arthritis susceptibility in anti-citrullinated peptide antibody negative patients. Ann. Rheum. Dis. 2012; 71 (12): 1984-1990.
33. Huizinga T.W., Amos C.I., van der Helm-van Mil A.H., Chen W., van Gaalen F.A., Jawaheer D., Schreuder G.M., Wener M., Breed-veld F.C., Ahmad N., Lum R.F., de Vries R.R., Gregersen P.K., Toes R.E., Criswell L.A. Refining the complex rheumatoid arthritis phenotype based on specificity of the HLA-DRB1 shared epitope for antibodies to citrullinated proteins. Arthritis Rheum. 2005; 52 (11): 3433-3438.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Гусева Ирина Анатольевна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний ФГБУ «Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 615-93-07, e-mail: [email protected]
Демидова Наталья Викторовна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник отдела ранних артритов ФГБУ
«Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 614-42-79, e-mail: [email protected]
Сорока Наталья Евгеньевна, научный сотрудник научно-производственного отдела ЗАО «Научно-производственная
фирма ДНК-Технология»
Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 2, к. 2, тел.: (495) 980-45-55, e-mail: [email protected] Новиков Александр Александрович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний ФГБУ «Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 614-09-33, e-mail: [email protected]
Лучихина Елена Львовна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела ранних артритов ФГБУ
«Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 614-42-79, e-mail: [email protected] Александрова Елена Николаевна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией клинической иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний ФГБУ «Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 614-09-33, e-mail: [email protected]
Лукина Галина Викторовна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией клинической фармакологии ФГБУ
«Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 618-92-38, e-mail: [email protected]
Федоренко Евгения Владимировна, кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник лаборатории клинической фармакологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 618-92-38, e-mail: [email protected]
Аронова Евгения Сергеевна, кандидат медицинских наук, младший научный сотрудник лаборатории клинической
фармакологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 618-92-38, e-mail: [email protected]
Самаркина Елена Юрьевна, младший научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии и молекулярной
биологии ревматических заболеваний ФГБУ «Научно-исследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 615-93-07, e-mail: [email protected]
Болдырева Маргарита Николаевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела иммуногенетики
ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России
Адрес: 115478, Каширское шоссе, д. 24, к. 2, тел.: (499) 617-78-22, e-mail: [email protected]
Трофимов Дмитрий Юрьевич, доктор биологических наук, генеральный директор ЗАО «Научно-производственная
фирма ДНК-Технология»
Адрес: 115478, Каширское шоссе, д. 24, к. 2, тел.: (495) 980-45-55, e-mail: [email protected]
Каратеев Дмитрий Евгеньевич, доктор медицинских наук, заведующий отделом ранних артритов ФГБУ «Научноисследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 614-31-73, e-mail: [email protected]
Насонов Евгений Львович, доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, директор ФГБУ «Научноисследовательский институт ревматологии» РАМН
Адрес: 115522, Москва, Каширское шоссе, д. 34А, тел.: (499) 614-44-90, e-mail: [email protected]
43
#
#
