CC BY
44
еч
о
еч
СМ
Иммунофенотипическая характеристика острого лимфобластного лейкоза у детей первого года жизни
А.М. Попов1, 2, Г.А. Цаур1, 2, Т.Ю. Вержбицкая1, 2, О.В. Стренева1, 2, Е.В. Шориков1, 2, Л.И. Савельев1, 2, 3, Л.Г. Фечина1, 2
'ГБУЗ СО «Областная детская клиническая больница № 1», Екатеринбург; 2ГБУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий», Екатеринбург; 3ГБОУВПО «Уральская государственная медицинская академия», Екатеринбург
Контакты: Александр Михайлович Попов [email protected]
Цель исследования — описание иммунофенотипа острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей первого года жизни. В исследование было включено 64 пациента (29 мальчиков и 35 девочек) с острым лейкозом (ОЛ) в возрасте от 0 до 11 месяцев включительно. Частота выявления ОЛЛ составила 67,19 % от всех ОЛу детей первого года жизни, что было несколько реже, чем у детей более старшего возраста (87,69 %). В исследуемой группе преобладал BI-ОЛЛ(60,46 %), на долю же наиболее частого в других возрастных группах BII-ОЛЛприходилось лишь 30,23 %. Отсутствие экспрессии CD10 и CD20, а также высокая экспрессия CD45, CD15, CD65 и NG2 характеризовали иммунофенотип опухолевых клеток при наличии перестроек гена MLL. Диагностическая эффективность выявления экспрессии NG2 для прогнозирования наличия перестроек гена MLL оказалась наиболее высокой. Экспрессия CD34 и CD65 была более характерна для пациентов с наличием MLL-AF4(+). Таким образом, иммунофенотип ОЛЛ из В-линейных предшественников у детей младше 1 года существенно различается в зависимости от наличия или отсутствия перестроек гена MLL. Экспрессия NG2, CD45, CD133, CD15, а также отсутствие экспрессии CD10, CD20 позволяют прогнозировать наличие какой-либо перестройки гена MLL при ОЛЛ у детей первого года жизни, при этом наибольшей диагностической эффективностью обладает наличие экспрессии NG2.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, дети первого года жизни, проточная цитометрия
Immunophenotypic investigation of infant acute lymphoblastic leukemia
A.M. Popov1,2, G.A. Tsaur1,2, T.Yu. Verzhbitskaya1,2, O.V. Streneva1,2, E.V. Shorikov1,2, L.I. Saveliev1,23, L.G. Fechina1,2
1Pediatric Oncology and Hematology Centre, Regional Children's Hospital, Yekaterinburg;
Research Institute of Medical Cell Technologies, Yekaterinburg;
3Ural State Medical Academy, Yekaterinburg
Aim of the study — immunophenotype description of infant acute lymphoblastic leukemia (ALL). 64 patients (29 boys and 35 girls) with acute leukemia (AL) aged from 0 to 11 months were included in the current study. ALL was found less frequently in infants than in older children (67.19 % and 87.69 %, respectively). BI-ALL was the most common immunological ALL type (60.46 %) in infant ALL, while BII-ALL was notably less frequent compared with other age groups (30.23 %). Significant immunophenotypic differences were observed in patients with and without MLL gene rearrangements. Number of cases in those tumor cells expressed CD10, CD20, CD45, CD133, CD15, NG2 varied between MLL-positive and MLL-negative groups. CD10- and CD20-negativity, high CD45, CD15, CD65and NG2 expression were immunophenotypic signatures of MLL-rearranged infant ALL, although NG2 had the highest diagnostic efficacy. High CD34 and CD65 expression was frequently associated with presence of MLL-AF4 fusion gene. Thus infants' B-cell precursor ALL immunophenotype differs significantly due to the presence of MLL gene rearrangements. Diagnostic immunophenotyping of infants' ALL allows predicting presence of MLL rearrangements and NG2 is the most applicable single marker.
Key words: acute lymphoblastic leukemia, infants, flow cytometry
Результаты терапии острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей заметно улучшились в течение последних 10-летий [1—6]. В то же время в некоторых группах пациентов выживаемость по-прежнему остается невысокой [3, 7]. Одной из таких групп являются дети первого года жизни [7—12]. ОЛЛ у детей первого года жизни характеризуется особенным, отличающимся от детей более старшего возраста, профилем экспрессии генов [13—16], высокой частотой выявления перестроек гена ЫЬЬ [17—19] и крайне неблагоприятным прогнозом [7—12]. Наиболее часто упоминаемыми факторами риска ОЛЛ у па-
циентов данной возрастной группы являются наличие перестроек гена MLL [9, 11, 12, 20—29], возраст младше 6 месяцев [11, 20, 23, 25—27, 29—33], инициальный гиперлейкоцитоз [11, 25, 27, 30, 32], инициальное поражение центральной нервной системы [25], иммунофенотип с отсутствием экспрессии CD10 [24—27, 30, 32, 34—36], экспрессия лимфобластами миелоидных антигенов [20, 34, 36], плохой ответ на монотерапию кортикостероидами [11, 25], длительное сохранение минимальной остаточной болезни [37, 38].
В работе S. Armstrong et al. было впервые показано, что опухолевые клетки при острых лейкозах
(ОЛ), ассоциированных с перестройками гена MLL, по профилю экспрессии генов отличаются от блас-тов при стандартных ОЛЛ и остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) [13]. В дальнейшем было установлено, что по профилю экспрессии генов ОЛЛ и ОМЛ, ассоциированные с перестройками гена MLL, ближе друг к другу по сравнению с ОЛЛ и ОМЛ без данных перестроек соответственно [14—16]. Таким образом, наличие перестроек гена MLL обуславливает развитие биологически совершенно особенной опухоли, сложно поддающейся терапии. В то же время ОЛЛ у детей первого года жизни без перестроек гена MLL характеризуются лучшим прогнозом по сравнению с МАЦ+)-пациентами [9, 11, 12, 20—29], однако и в группе MLL(-) далеко не всегда удается достичь результатов лечения, сопоставимых с результатами терапии у детей более старшего возраста [11, 20—28]. В работе R. Stam et al. было показано, что профиль экспрессии генов у детей первого года жизни при ОЛЛ без перестроек гена MLL отличается от такового у детей старше 1 года и близок к ОЛЛ у детей младше 1 года с наличием перестроек гена MLL [15].
Опухолевые клетки с наличием перестроек гена MLL имеют специфический иммунофенотип, характеризующийся частым отсутствием экспрессии CD10 [19, 36, 39—43], коэкспрессией миелоидных антигенов [36, 39—43], экспрессией нейтрального маркера NG2 [39—46]. В то же время комплексное описание иммунофенотипа ОЛЛ у детей первого года жизни как с наличием перестроек гена MLL, так и с их отсутствием в литературе встречается крайне редко [36, 39].
Цель исследования — описание иммунофенотипа ОЛЛ у детей первого года жизни.
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось в Лаборатории имму-нофенотипирования гемобластозов Отдела детской онкологии и гематологии ОДКБ № 1 г. Екатеринбурга с октября 2005 г. по июль 2011 г. Из 332 детей, у которых было проведено исследование первичного иммунофенотипа, 64 ребенка (29 мальчиков и 35 девочек) были в возрасте до 11 месяцев включительно. Эти пациенты составили исследуемую группу.
Иммунофенотипирование опухолевых клеток в костном мозге производилось методом 4-6-цветной проточной цитометрии на приборах "FACS Canto" и "FACS Canto II" (Becton & Dickinson (BD), США). Настройка проточных цитометров производилась с использованием калибровочной системы "7-color Setup Beads" (BD). Мониторинг стабильности работы приборов осуществлялся при помощи калибровочных систем "Cytometer Setup and Tracking" (BD) и "DAKO Fluorospheres" (Dako, Дания). Использовались моно-клональные антитела (МКАТ), меченные флюоресце-инизотиоцианатом (FITC), R-фикоэритрином (PE), перидинин-хлорофилл протеином (PerCP), аллофико-
цианином (АРС), а также тандемными конъюгатами PE с цианином 7 (Cy7), PerCP с цианином 5.5 (Cy5.5) и APC с Су7. Для иммунофенотипирования применялись МКАТ, представленные в табл. 1. Окрашивание первичномеченными МКАТ производилось согласно инструкции производителя.
Таблица 1. МКАТ, применявшиеся для первичного иммунофенотипирования ОЛ
ej
о
ej
N
Флюорохром МКАТ
FITC CD58, CD45, CD99, CD7, CD65*, CD15, CD33, CD10, CD19, CD4, CD3, MPO, CD64, CD66b, CD61, CD5, CD71, IgM, Kappa
PE CD10, CD7, CD34, NG2*, CDla, CD45, CD22, CD133**, CD13, CD8, CD58, CD20, CD79a, TdT, CD38, CDlla, CDllb, CDllc, CD2, CD235, CD99, Lambda
PerCP CD19, CD20, CD8, CD45, CD34
PerCP-Cy5.5 CD20, CD33, CD38, CD19, CD79a, CD5
PE-Cy7 CD34, CD13, CD3, CD56, CD10, CD38
APC CD19, CD117, CD3, CD133**, CD56, CD2, CD79a, CD10, CD38, TdT, IgM
APC-Cy7 CD45, CD20, CD14, CD3, CD4
Примечание: * — антитела производства Beckman Coulter (США); ** — антитела производства Miltenyi Biotec (Германия); остальные антитела произведены Becton & Dickinson (США). ^ш
Для определения экспрессии NG2 использовали антитело 7.1-PE (Beckman Coulter, США). Для сравнения данных флюоресценции, полученных на разных приборах, среднюю интенсивность флюоресценции (MFI) пересчитывали в количество молекул эквивалентного растворимого флюорохрома (MESF) при помощи калибровочных частиц "Quanti Brite" (BD), содержащих известное количество молекул PE.
Результаты иммунофенотипирования оценивали при помощи программного обеспечения FACS Diva 4.0-6.1 (BD). Анализировали не менее 10 000 ядросо-держащих клеток. Опухолевые клетки выделяли на точечных графиках по экспрессии CD45, значениям параметра бокового светорассеяния и экспрессии линейно-ассоциированных маркеров (CD19, CD7, CD33). Дальнейший анализ проводили при помощи гистограмм. Согласно критериям группы EGIL [47] популяцию считали позитивной, если 20 % и более клеток экспрессировали исследуемый антиген. В качестве негативного контроля использовали сохранившиеся в образце нормальные клетки. Определение иммунологических вариантов производили также согласно критериям EGIL [47].
Для цитогенетического анализа использовали клетки костного мозга и периферической крови, которые брали до начала терапии и культивировали в течение 24 ч. Препараты окрашивали G-ме-тодом с предварительной обработкой трипсином.
еч
о
еч
СМ
Анализировали не менее 20 метафазных пластинок. Кариотипирование проводили в соответствии с международной номенклатурой хромосом человека [48]. В 26 случаях дополнительно проводили исследование методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с локус-специфичным зондом LSI MLL Dual Color Break Apart Rearrangement Probe (Abbott, США) согласно инструкции производителя, а у 1 пациента также с зондами LSI MYC Dual Color, Dual Fusion Break Apart Rearrangement Probe и LSI IGH Dual Color Break Apart Probe (оба Abbott, США).
У всех пациентов исследовались следующие химерные транскрипты: MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-MLLT3, MLL-MLLT4, MLL-MLLT10, MLL-ELL. Пациентам, у которых не были обнаружены вышеуказанные химерные транскрипты, дополнительно определяли экспрессию MLL-SEPT9, MLL-MLLT11, MLL-EPS15. Выявление химерных транскриптов проводили методом гнездной обратно-транскрип-тазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) по ранее описанному протоколу [49—51].
У 37 пациентов проведено исследование геномной ДНК, выделенной из ядросодержащих клеток костного мозга, при помощи длинной инвертированной ПЦР с целью определения точки разрыва в гене MLL и гене-партнере [52].
Для статистической обработки результатов применяли программу Statistica 6.0. Статистическая значимость различий определялась при помощи непараметрических критериев х2 и Манна—Уитни. Достоверными считались различия прир < 0,05. Для оценки возможного прогнозирования наличия перестроек гена MLL для каждого иммунологического маркера рассчитывали диагностическую чувствительность, специфичность, прогностическую ценность положительного и отрицательного результа-
тов, а также общую диагностическую эффективность теста [53].
Результаты исследования
Распределение вариантов ОЛ, по данным им-мунофенотипирования, у пациентов первого года жизни (п = 64) и более старших детей (п = 268) показано на рис. 1. У детей первого года жизни ОЛЛ выявлялся достоверно реже (р = 0,0001), а ОМЛ и острый билинейный лейкоз (ОБлЛ) — достоверно чаще (р = 0,0076 и р = 0,0047 соответственно), чем у пациентов старше 1 года. Для острого бифеноти-пического лейкоза (ОБфЛ) и острого недифференцированного лейкоза (ОНдЛ) значимых различий обнаружено не было (р = 0,3568 и р = 0,4354 соответственно). У 1 пациента исследуемой группы блас-ты имели иммунофенотип ОМЛ, в то время как при цитоморфологическом исследовании был определен ОЛЛ.
Распределение иммунологических вариантов ОЛЛ у пациентов первого года жизни (п = 43) и более старших детей (п = 235) показано на рис. 2.
Среди ОЛЛ у детей первого года жизни преобладали ОЛЛ из В-линейных предшественников. На долю же В1У-ОЛЛ и Т-линейных ОЛЛ суммарно приходилось менее 5 % случаев. Среди иммунологических вариантов ОЛЛ в исследуемой группе доминировал В1, который выявлялся статистически значимо чаще, чем у пациентов старше 1 года (р < 0,0001), в то время как В11-ОЛЛ у детей первого года жизни встречался значительно реже (р < 0,0001). Для В111-ОЛЛ, В1У-ОЛЛ и Т-линейных ОЛЛ значимых различий обнаружено не было (р = 0,2197, р = 0,9668 и р = 0,0932 соответственно).
В 32 (78,5 %) из 41 случая ОЛЛ из В-линейных предшественников у детей первого года жизни были
б
Рис. 1. Распределение вариантов ОЛ, по данным иммунофенотипирования: а — у пациентов первого года жизни (n = 64),
б — у более старших детей (n = 268)
а
Рис. 2. Распределение иммунологических вариантов ОЛЛ: а — у пациентов первого года жизни (п = 43), б — у детей старше года (п =235)
выявлены различные перестройки гена МЬЬ. Девятнадцать пациентов (59,4 %) имели МЬЬ-ЛЕ4, 5 (15,6 %) — МЬЬ-МЬЬТ1 (ранее обозначаемый как МЬЬ-ЕЫЬ), по 3 (9,4 %) - МЬЬ-ЕР815 (МЬЬ-ЛЕ1р) и МЬЬ-МЬЬТЗ (МП-ЛЕЯ), по 1 (3,1 %) - МЬЬ-МЬЬТ10 (МП-ЛЕЩ и МЬЬ-ЛЕЕ3 (МЬЬ-ЬЛЕ4).
Иммунофенотип опухолевых клеток пациентов с ОЛЛ, ассоциированным с перестройками гена МЬЬ (МЬЬ(+)), существенно отличался от фенотипа бластов пациентов, у которых эти перестройки обнаружены не были (МЬЬ(-)). Так, все МЬЬ(-)-пациенты имели В11-ОЛЛ, в то время как в группе МЬЬ(+) у 25 (78,1 %) пациентов был выявлен В1-ОЛЛ, у 5 (15,6 %) - В11-ОЛЛ и у 2 (6,3 %) - В111-ОЛЛ. Экспрессия антигенов опухолевыми клетками пациентов с МЬЬ(+) и МЬЬ(-) ОЛЛ из В-линейных предшественников приведена в табл. 2.
Наши данные позволяют утверждать, что экспрессия N02, СБ45, СБ133 и СБ15, а также отсутствие экспрессии СБ10 и СБ20 могут прогнозировать наличие перестройки гена МЬЬ. При этом СБ10(+) ОЛЛ из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ) в группе МЬЬ(+)- и МЬЬ(-) существенно различались по распределению экспрессии СБ10. Если в группе МЬЬ(-) только у 1 пациента из 9 опухолевая популяция была гетерогенна по экспрессии данного маркера, то среди МЬЬ(+)-пациентов, наоборот, гомогенная экспрессия СБ10 была выявлена лишь у 1 больного из 7 (р = 0,0133). Кроме того, у пациентов с МЬЬ(+) ОЛЛ доля СБ10-позитивных бластов была статистически значимо ниже, чем у МЬЬ(-)-пациентов: медиана 46,3 % с диапазоном 25,5-86,7 % и медиана 97,9 % с диапазоном 66,1-99,9 % соответственно; р = 0,0004. Качественное определение экспрессии СБ22 не позволило разграничить МЬЬ(+)- и МЬЬ(-)-пациентов, но процентное содержание СБ22-позитивных бластов
Таблица 2. Экспрессия антигенов опухолевыми клетками пациентов с МЬЬ(+) и МЬЬ(-) ВП-ОЛЛ
И11(+) И1Ц-) Р
CD10 7/32 9/9 0,0001
CD20 3/29 7/9 0,0003
CD22 22/23 6/6 0,4615
CD45 32/32 5/9 0,0009
CD34 21/32 8/9 0,3470
CD133 22/30 1/8 0,0065
CD99 13/18 2/6 0,2236
CD33 2/32 0/8 0,8561
CD13 3/31 1/8 0,6753
CD15 22/30 1/6 0,0298
CD65 8/19 0/5 0,2135
CD117 2/23 0/7 0,9540
NG2 26/27 0/6 < 0,0001
cyt IgM 2/32 0/9 0,9149
Примечание. Данные представлены в формате «число позитивных пациентов / общее число пациентов, которым проводилось определение экспрессии антигена».
между этими группами различалось (медиана 89,9 %, диапазон 25,2-99,7 % и медиана 99,9 %, диапазон 96,0-99,9 % соответственно; р = 0,0026). Для СБ34 подобных закономерностей выявлено не было (медиана 85,6 %, диапазон 26,4-99,9 % и медиана 69,6 %, диапазон 39,1-99,9 % соответственно; р = 0,6495). Типичные примеры экспрессии антигенов представлены на рис. 3. Характеристики параметров диагностической информативности определения экспрессии СБ10, СБ20, СБ45, СБ133, СБ15 и N02 для прогнозирования наличия перестроек гена МЬЬ представлены в табл. 3.
еч
о
еч
СМ
Рис. 3. Типичные примеры экспрессии антигенов при ВП-ОЛЛс наличием перестроек гена ИЬЬ (ЫЬЦ+)) и без них (ИЬЦ-))
у детей первого года жизни
Таблица 3. Характеристики параметров диагностической информативности определения экспрессии антигенов для прогнозирования наличия перестроек гена ИЬЬ
ДЧ (%) Сп (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ДЭТ(%)
Отсутствие экспрессии С010 78,1 100 100 56,2 82,9
Отсутствие экспрессии С020 89,7 77,8 92,9 70,0 86,8
Экспрессия С045 100 44,4 86,5 100 87,8
Экспрессия С0133 73,3 87,5 95,7 46,7 76,3
Экспрессия С015 60,8 83,3 95,7 38,5 75,0
Экспрессия N02 96,3 100 100 85,7 96,7
Примечание. ДЧ — диагностическая чувствительность, Сп — специфичность, ПЦПР — прогностическая ценность положительного результата, ПЦОР — прогностическая ценность отрицательного результата.
В литературе описаны некоторые различия им-мунофенотипа опухолевых клеток при наличии химерного гена ЫЬЬ-ЛВ4 и наличии других перестроек гена ЫЬЬ [41, 46]. В нашем исследовании было установлено, что экспрессия СБ34 и СБ65 коррелирует с наличием химерного гена ЫЬЬ-ЛВ4 (р = 0,0216
и р = 0,0331 соответственно). Однако характеристики параметров диагностической информативности для прогнозирования наличия химерного гена ЫЬЬ-ЛВ4 оказались относительно невысоки (диагностическая эффективность теста (ДЭТ) — 75,0 % и 78,9 % соответственно). Подсчет МБББ N02, как и
качественное определение экспрессии этого маркера, также не позволил четко разграничить пациентов с наличием химерного гена MLL-AF4(+) и пациентов с другими перестройками гена MLL (медиана MESF 2156, диапазон 382-19187 и медиана MESF 1413, диапазон 34-9141 соответственно; р = 0,2720).
Иммунофенотип опухолевых клеток был также связан с возрастом больных — одним из важнейших прогностических факторов ОЛЛ у детей первого года жизни. Так, CD10(+) ОЛЛ из В-линейных предшественников достоверно чаще встречался у пациентов старше 6 месяцев, в то время как CD10(-)-ва-рианты — у детей младше полугода (57,89 % и 77,27 % соответственно; р = 0,0476)
Среди детей младше 1 года с ОЛЛ были также диагностированы 1 пациент с BIV-ОЛЛ и 1 — с TIV-ОЛЛ.
Иммунофенотип пациента с BIV-ОЛЛ имел большее сходство с ОЛЛ из В-линейных предшественников, нежели чем с лимфомой Беркитта. В частности, была обнаружена высокая экспрессия CD58 — антигена, как правило, не встречающегося при лимфомах [54], относительно низкая экспрессия CD45, а также отсутствие субтотального количества CD20-позитивных клеток. Была выявлена экспрессия Х-цепи иммуноглобулинов на мембране и в цитоплазме 89,5 % опухолевых клеток. Также на опухолевых клетках не было обнаружено миелоид-ных антигенов и NG2. Молекулярно-генетические методы (ОТ-ПЦР, FISH и длинная инвертированная ПЦР) не выявили у данного пациента каких-либо перестроек гена MLL. Также не были обнаружены перестройки генов MYC и IgH при исследовании методом FISH.
Опухолевые клетки пациентки с TIV-ОЛЛ экс-прессировали CD7, CD5, CD45, CD99, CD3, cytCD3, CD8, CD34 и Т-клеточный рецептор у5-типа. Экспрессия CD2, CD4, CD1a, NG2, TdT, CD133, а также миелоидных и В-линейных маркеров выявлена не была. При исследованиях с использованием ОТ-ПЦР, длинной инвертированной ПЦР и FISH перестройки гена MLL не были обнаружены, однако был выявлен химерный ген SCL-TAL1 (SIL-TAL1), наличие которого характерно для Т-линейных ОЛЛ старшего возраста.
Обсуждение полученных результатов
ОЛЛ у детей первого года жизни характеризуется особенной биологией, тяжелым клиническим течением и неблагоприятным прогнозом [7—12]. Эти особенности обусловлены наличием перестроек гена MLL, наиболее часто встречающихся именно у пациентов данной возрастной группы.
На протяжении длительного времени ведутся работы по поиску иммунологических маркеров, позволяющих с достаточно высокой вероятностью прогнозировать наличие молекулярно-генетических
аберраций с вовлечением региона 1Ц23. В ранних и некоторых современных работах указывалось на достаточно высокую диагностическую эффективность отсутствия экспрессии СБ10 [34, 35, 43], хотя В1-вариант ОЛЛ встречается и среди МЬЬ-негатив-ных пациентов [39], а у части МЬЬ-позитивных пациентов опухолевые клетки СБ10-положительны [39, 43]. Экспрессия миелоидных антигенов СБ15 и СБ65 также часто выявляется при наличии перестроек гена МЬЬ, однако данные маркеры очень специфичными не считаются [39, 41]. После того как в 1996 г. Е ВеИш й а1. описали экспрессию антигена N02, распознаваемого антителом 7.1, МЬЬ-позитив-ных ОЛ [44], внимание исследователей переключилось на этот маркер. Неоднократно было показано, что N02 является очень специфичным МЬЬ-ассоци-ированным антигеном [36, 39-42, 44-46].
В настоящее время типичный иммунофено-тип опухолевых клеток при ОЛЛ, ассоциированном с перестройками гена МЬЬ, описан достаточно четко [36, 39-46]. В то же время опубликовано относительно немного работ, посвященных иммунофенотипи-рованию различных вариантов ОЛЛ у детей первого года жизни, как имеющих МЬЬ-перестройки, так и без них [36, 39]. Обычно описывается иммунофенотип только МЬЬ-позитивных пациентов, вне зависимости от возраста [40-46]. Известно, что иммуно-фенотип ОЛЛ в данной возрастной группе является важным прогностическим фактором [24-27, 30, 32, 34-36]. Поэтому основной задачей нашей работы было описание распределения иммунологических вариантов ОЛЛ у всех детей младше 1 года и выявления связи экспрессии антигенов у этих пациентов с наличием и типом перестройки гена МЬЬ.
В проведенном нами исследовании частота выявления ОЛЛ составила 67,19 % от всех ОЛ у детей первого года жизни, в то время как среди ОЛ у детей более старшего возраста ОЛЛ встречался чаще (87,69 %). Распределение иммунологических вариантов ОЛЛ у пациентов младше 1 года отличалось от детей старшего возраста. В исследуемой группе преобладал В1-ОЛЛ (60,46 %), на долю же наиболее частого в других возрастных группах В11-ОЛЛ приходилось лишь 30,23 %. В целом, среди пациентов первого года жизни, как и в более старшей возрастной группе, преобладали ОЛЛ из В-линейных предшественников. Иммунофенотипы ОЛЛ из В-линей-ных предшественников существенно отличались и внутри исследуемой группы, в зависимости от наличия перестроек гена МЬЬ. Так, все МЬЬ(-)-паци-енты имели В11-ОЛЛ, в то время как в группе МЬЬ(+) преобладал В1-вариант. Кроме того, при В11-ОЛЛ у МЬЬ(+)-пациентов опухолевая популяция чаще всего была гетерогенна по экспрессии СБ10, в то время как у МЬЬ(-)-пациентов данный антиген экс-прессировался преимущественно гомогенно. Были выявлены также различия в количестве МЬЬ(+)-
ej
о
сч
N
ej
о
ej
СМ
и ЫЬЬ(-)-пациентов, опухолевые клетки которых экспрессировали СБ10, СБ20, СБ45, СБ133, СБ15, N02. Кроме того, доля СБ22-позитивных клеток была выше у детей с ЫЬЬ. Отсутствие экспрессии СБ10 и СБ20, а также высокая экспрессия СБ45, СБ15, СБ65 и N02 характеризовали иммунофено-тип опухолевых клеток при наличии перестроек гена ЫЬЬ. Диагностическая эффективность выявления экспрессии N02 для прогнозирования наличия перестроек гена ЫЬЬ оказалась наиболее высокой, в то время как для остальных маркеров ДЭТ была значительно ниже. Диагностическая эффективность СБ10, предлагаемого некоторыми авторами для разграничения ЫЬЬ(+) и ЫЬЬ(-)-пациентов [43], оказалась ниже, чем у N02, СБ45 и СБ20.
Так как наличие любых перестроек гена ЫЬЬ является неблагоприятным прогностическим фактором, их поиск крайне необходим для правильного подбора терапии. Описано большое количество вариантов генетических нарушений с участием региона 1Ц23 [55]. Однако в рутинной лабораторной практике методом ОТ-ПЦР чаще всего проводится определение только химерного гена ЫЬЬ-ЛЕ4 [50, 51]. При этом среди всех вариантов перестроек гена ЫЬЬ, встречающихся у детей первого года жизни, на долю ЫЬЬ-ЛЕ4 приходится около половины [9, 11, 19, 28, 39, 56] (в нашем исследовании — 59,4 %).
Таким образом, при проведении обычного рутинного определения наиболее частых молекулярно-генетических нарушений у пациентов младше 1 года с ОЛЛ у существенного количества ЫЬЬ(+)-больных перестройки данного гена выявлены не будут. В то
же время эффективность прогнозирования наличия любых перестроек гена MLL с помощью определения экспрессии NG2 в нашем исследовании составила 96,7 %, поэтому использование данного антигена при первичном иммунофенотипировании ОЛЛ у детей первого года жизни представляется крайне необходимым. При обнаружении экспрессии опухолевыми клетками NG2 следует проводить более углубленный поиск перестроек гена MLL при помощи мультиплексной ОТ-ПЦР, длинной инвертированной ПЦР и FISH, а не ограничиваться стандартным определением химерного гена MLL-AF4. Это особенно важно именно в данной возрастной группе, где MLL-пере-стройки выявляются у большинства пациентов [17— 19], а их наличие является важнейшим прогностическим фактором [9, 11, 12, 20—29].
Кроме того, в работах различных исследовательских групп было показано, что существуют иммуно-фенотипические различия и внутри группы MLL(+), в зависимости от типа химерного гена [41, 46]. В нашем исследовании экспрессия CD34 и CD65 была более характерна для пациентов с MLL-AF4(+). В то же время различия в количественной экспрессии NG2, выраженной в единицах MESF, не достигли статистической достоверности, что не согласуется с результатами некоторых других исследований [41, 46]. Причиной подобных расхождений может быть различный подход к формированию исследуемой группы. В отличие от большинства исследований/ исследователей мы целенаправленно обследовали всех без исключения детей первого года жизни с ОЛ, а не только ^^^^пациентов.
Литература
1. Stanula M., Schrappe M. Treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia. Semin Hematol 2009;46:52-63.
2. Schrappe M., Camitta B., Pui C.-H. Long-term results of large prospective trials in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2000;14:2193-4.
3. Pui C.H. Toward a total cure for acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 2009;27:5121-3.
4. Румянцева Ю.В., Карачунский А.И., Румянцев А.Г. Оптимизация терапии острого лимфобластного лейкоза у детей в России. Педиатрия 2009;4:19-27.
5. Mörike A., Zimmermann M., Reiter A.
et al. Long-term results of five consecutive trials in childhood acute lymphoblastic leukemia performed by the ALL-BFM study group from 1981 to 2000. Leukemia 2010;24:265-84.
6. Pui C.H., Pei D., Sandlund D.T. et al. Long-term results of St. Jude Total therapy studies 11, 12, 13A, 13B and 14 for childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2010;24:371-82.
7. Bhojwani D., Howard S.C., Pui C.-H. High-risk childhood acute lymphoblastic
leukemia. Clin Lymphoma Myeloma 2009;9(Suppl. 3):222-30.
8. Шориков Е.В. Результаты программного лечения острого лимфобластного лейкоза у детей первого годажизни. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2005. 39 с.
9. Hilden J.M., Dinndorf PA., Meerbaum S.O. et al. Analysis of prognostic factors of acute lymphoblastic leukemia in infants: report on CCG 1953 from the Children's Oncology Group. Blood 2006;108(2):441-51.
10. Biondi A., Rizzari C., Valsecchi M.G. et al. Role of treatment intensification in infants with acute lymphoblastic leukemia: results of two consecutive AIEOP studies. Haematologica 2006;91:534-7.
11. Pieters R., Schrappe M., De Lorenzo P. et al. A treatment protocol for infants younger than 1 year with acute lymphoblastic leukemia (Interfant-99): an observational study and
a multicentre randomized trial. Lancet 2007;370:240-50.
12. Tomizawa D., Koh K., Sato T. et al. Outcome of risk-based therapy for infant acute lymphoblastic leukemia with or without an MLL gene rearrangement, with emphasis on
late effects: a final report of two consecutive studies, MLL96 and MLL98, of the Japan Infant Leukemia Study Group. Leukemia 2007;21:2258-63.
13. Armstrong S.A., Staunton J.E., Silverman L.B. et al. MLL translocations specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique leukemia. Nat Genetics 2002;30:41-7.
14. Zangrando A., Dell'Orto M.C.,
te Kronnie G., Basso G. MLL rearrangements in pediatric acute lymphoblastic and myeloblastic leukemias: MLL specific and lineage-specific signatures. BMC Med Genom 2009;23:2-36.
15. Stam R.W., Schneider P., Hagelstein JA.P. et al. Gene expression profiling-based dissection of MLL translocated and MLL germline acute lymphoblastic leukemia in infants. Blood 2010;115:2835-44.
16. Qazi S., Uckun F.M. Gene expression profiles of infant acute lymphoblastic leukemia and its prognostically distinct subsets.
Br J Hematol 2010;149:865-73.
17. Chen C-S., Sorensen P., Domer P. et al. Molecular rearrangements on chromosome
11q23 predominate in infant acute lymphoblastic leukemia and are associated with specific biologic variables and poor outcome. Blood 1993;81:2386-93.
18. Szczepanski T., Harrison C.J.,
van Dongen J.J.M. Genetic aberrations in paediatric acute leukaemias and implication for management of patients. Lancet Oncol 2010;11:880-9.
19. Цаур Г.А., Попов А.М., Алейникова О.В. и др. Характеристика перестроек 11q23 (MLL) у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом. Онкогематол 2011;3:57-64.
20. Pui C.H., Behm F.G., Downing J.R. et al. 11q23/MLL rearrangement confers a poor prognosis in infants with acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 1994;12:909-15.
21. Rubnitz J.E., Link M.P., Shuster J.J.
et al. Frequency and prognostic significance of HRX rearrangements in infant acute lymphoblastic leukemia: a Pediatric Oncology Group study. Blood 1994;84:570-3.
22. Cimino G., Rapanotti M.C., Rivolta A. et al. Prognostic relevance of ALL-1 gene rearrangement in infant acute leukemias. Leukemia 1995;9:391-5.
23. Pui C.H., Ribeiro R.C., Campana D.
et al. Prognostic factors in the acute lymphoid and myeloid leukemias of infants. Leukemia 1996;10:952-6.
24. Taki T., Ida K., Bessho F. et al. Frequency and clinical significance of the MLL gene rearrangements in infant acute leukemia. Leukemia 1996;10:1303-7.
25. Dordelmann M., Reiter A., Borkhardt A. et al. Prednisone response is the strongest predictor of treatment outcome in infant acute lymphoblastic leukemia. Blood 1999;94: 1209-17.
26. Heerema NA., Sather H.N., Ge J. et al. Cytogenetic studies of infant acute lymphoblastic leukemia: poor prognosis of infants with t(4;11) - a report of the Children's Cancer Group. Leukemia 1999;13:679-86.
27. Reaman G.H., Sposto R., Sensel M.G. et al. Treatment outcome and prognostic factors for infants with acute lymphoblastic leukemia treated on two consecutive trials of the Children's Cancer Group. J Clin Oncol 1999;17:445-55.
28. Isoyama K., Eguchi M., Hibi S. et al. Risk-directed treatment of infant acute lymphoblastic leukaemia based on early assessment of MLL gene status: results of the Japan Infant Leukaemia Study (MLL96). Br J Haematol 2002;118:999-1010.
29. Fechina L., Shorikov E., Tsaur G.
et al. Contribution of all-trans retinoic acid to improved early relapse-free outcome in infant acute lymphoblastic leukemia comparing to the chemotherapy alone. Blood 2007;110(11):832А; abstr. 2828.
30. Chessells J.M., Eden O.B., Bailey C.C. et al. Acute lymphoblastic leukaemia in infancy: experience in MRC UKALL trials. Report from the Medical Research Council Working Party on Childhood Leukaemia. Leukemia 1994;8:1275-9.
31. Frankel L.S., Ochs J., Shuster J.J. et al. Therapeutic trial for infant acute lymphoblastic leukemia: the Pediatric Oncology Group experience (POG 8493). J Pediatr Hematol/Oncol 1997;19:35-42.
32. Silverman L.B., McLean T.W, Gelber R.D. et al. Intensified therapy for infants with acute lymphoblastic leukemia: results from the Dana-Farber Cancer Institute Consortium. Cancer 1997;80:2285-95.
33. Kosaka Y., Koh K., Kinukawa N.
et al. Infant acute lymphoblastic leukemia with MLL gene rearrangements: outcome following intensive chemotherapy and hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2004;104:3527-34.
34. Basso G., Putti M.C., Cantü-Rajnoldi A. et al. The immunophenotype in infant acute lymphoblastic leukaemia: correlation with clinical outcome. An Italian multicentre study (AIEOP). Br J Haematol 1992;81:184-91.
35. Ferster A., Bertrand Y., Benoit Y. et al. Improved survival for acute lymphoblastic leukaemia in infancy: the experience of EORTC-Childhood Leukaemia Cooperative Group. Br J Haematol 1994;86:284-90.
36. Szczepanski T., Sedek L., de Lorenzo P.
et al. Prognostic value of immunophenotype in infant ALL - results of the INTERFANT'99 study. Blood 2010;110(11):832А; abstr. 2700.
37. Van der Velden V.H.J., Corral L., Valsecchi M.G. et al. Prognostic significance of minimal residual disease in infants with acute lymphoblastic leukemia treated within the Interfant-99 protocol. Leukemia 2009;23(6):1073-9.
38. Цаур Г.А., Наседкина Т.В., Попов А.М. и др. Время достижения молекулярной ремиссии как фактор прогноза у детей первого года жизни острым лимфобластным лейкозом. Онкогематол 2010;2:46-54.
39. Borkhardt A., Vuchter C., Viehmann S. et al. Infant acute lymphoblastic leukemia -combined cytogenetic, immunophenotypical and molecular analysis of 77 cases. Leukemia 2002;16:1685-90.
40. Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias. Leukemia 2002;16:1233-58.
41. De Zen L., Bicciato S., te Kronnie G., Basso G. Computational analysis of flow cytometry antigen expression profiles in childhood acute lymphoblastic leukemia: an MLL/AF4 identification. Leukemia 2003;17:1557-65.
42. Schwartz S., Reider H., Schlager B. et al. Expression of the human homologue of rat NG2 in adult acute lymphoblastic leukemia: close association with MLL rearrangements and a CD10-/CD24-/CD65s+/CD15+ B-cell immunophenotype. Leukemia 2003;17:1589-95.
43. Attarbaschi A., Mann G., Konig M.
et al. Mixed Lineage Leukemia - rearranged childhood pro-B and CD10-negative pre-B acute lymphoblastic leukemia constitute a distinct clinical entity. Clin Cancer Res 2006;15(10):2988-94.
44. Behm F.G., Smith F.O, Raimondi S.C.
et al. Human homologue of the rat chondroitin sulfate proteoglycan, NG2, detected by monoclonal antibody 7.1, identifies childhood acute lymphoblastic leukemias with t(4;11)(q21; q23) or t(11;19) (q23; p13) and MLL gene rearrangements. Blood 1996;87(3):1134-9.
45. Wuchter C., Harbott J., Schoch C. et al. Detection of acute leukemia cells with mixed lineage leukemia (MLL) gene rearrangements by flow cytometry using monoclonal antibody 7.1. Leukemia 2000;14:1232-8.
46. Zangrando A., Intini F., te Kronie G., Basso G. Validation of NG2 in identifying BP-ALL patients with MLL-rearrangements using qualitative and quantitative flow cytometry:
a prospective study. Leukemia 2008;22:858-61.
47. Bene M., Castoldi G., Knapp W et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group
for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995;9(10):1783-6.
48. ISCN: An International System Human Cytogenetic Nomenclature (2005). Eds: Shaffer L.G., Tommerup N. Karger, Basel, Switzerland, 2005.
49. Palisgaard N., Hokland P., Riishoj D. et al. Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction for simultaneous screening of 29 translocations and chromosomal aberrations in acute leukemia. Blood 1998;92:574-88.
50. Van Dongen J., Macintyre E., Gabert J.
et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia 1999;13:1901-18.
51. Gabert J., Beillard E., van der Velden V. et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction
of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - A Europe Against Cancer Program. Leukemia 2003;17(12):2318-57.
52. Meyer C., Schneider B., Reichel M. et al. Diagnostic tool for the identification of MLL rearrangements including unknown partner genes. PNAS 2005;102(2):449-54.
53. Weinstein S., Obuchowski NA., Lieber M.L. Clinical evaluation of diagnostic tests. Am J Roentgenol 2005;184:14-9.
54. Veltroni M., De Zen L., Sanzari M.C. et al. Expression of CD58 in normal, regenerating and leukemic bone marrow B cells: implications for the detection of minimal residual disease in acute lymphocytic leukemia. Haematologica 2003;88(11): 1245-52.
55. Meyer C., Kowartz E., Hoffmann J. et al. New insights to the MLL recombinome of acute leukemias. Leukemia 2009;23:1490-9.
56. Chessells J., Harrison C., Kempski H. et al. Clinical features, cytogenetics and outcome in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia of infancy: report from the MRC Childhood Leukaemia working party. Leukemia 2002;16:776-84.
PJ
о
PJ
N
