CC BY
65
са
а
cv
: Методические основы диагностики и мониторинга f минимальной остаточной болезни при острых лейкозах s у детей первого года жизни
Г.А. Цаур1-3, А.М. Попов4, Л.Г. Фечина1, С.А. Румянцев4, 5
-J 1ГБУЗ СО ОДКБ № 1; Россия, 620149, Екатеринбург, ул. С. Дерябиной, 32;
i_ 2ГАУЗ СО «Институт медицинских клеточных технологий»; Россия, 620026, Екатеринбург, ул. Карла Маркса, 22а;
3ФГАОУ ВПО «УрФУ им. первого Президента России Б.Н. Ельцина»; Россия, 620002, Екатеринбург, ул. Мира, 19; ш 4ФГБУ«ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России; Россия, 117998, Москва, ул. Саморы Машела, 1;
= 5ГБОУВПО «РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России; Россия, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1
2 Контакты: Григорий Анатольевич Цаур [email protected]
г_ В статье представлены методические основы и показана прогностическая ценность определения минимальной остаточной бо-^ лезни (МОБ) у детей первого года жизни с острыми лейкозами, ассоциированными с перестройками 11q23/MLL. На основании о этого сформулирован алгоритм определения МОБ. Показано, что сопоставимость выявления МОБ методами проточной цито-метрии и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени составляет 87,0 %. Конкордантность результатов заметно снижалась на этапе индукции по сравнению с консолидацией/интенсификацией, а также терапией рецидива (78,6; 90,4 и 93,4 % соответственно;p = 0,002). В то же время она не зависела от наличия В-линейных предшественников в образце. Сопоставимость результатов качественного выявления МОБ в костном мозге и периферической крови составила 84,5 %. При этом во всех 22 (15,5 %) дискордантных образцах МОБ была выявлена в костном мозге, но не в периферической крови. Несмотря на высокий уровень сопоставимости результатов, наличие МОБ в периферической крови на различных этапах терапии не показало самостоятельной прогностической значимости. В то же время при проведении многофакторного анализа только сохранение МОБ в точке наблюдения 4 в костном мозге являлось независимым прогностически неблагоприятным фактором при лечении острого лим-фобластного лейкоза у детей первого года жизни по протоколу MLL-Baby (отношение опасности 7,326; 95 % доверительный интервал 2,378—22,565).
Ключевые слова: перестройки 11q23/MLL, острые лейкозы у детей первого года жизни, минимальная остаточная болезнь
DOI: 10.17650/1818-8346-2016-11-1-62-74
Methodological aspects of diagnostics and minimal residual disease monitoring in infant acute leukemias
G.A. Tsaur1-3, А.М. Popov4, L.G. Fechina1, S.A. Rumyantsev45
Regional Children Clinical Hospital No 1; 32 S. Deryabinoy St., Ekaterinburg, 620149, Russia; 2Institute of Medical Cell Technologies; 22a Karla Marksa St., Ekaterinburg, 620026, Russia; 3 Ural Federal University named after the first President of Russia B. N. Yel'tsin; 19 Mira St., Ekaterinburg, 620002, Russia; 4Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitriy Rogachev, Ministry of Health of Russia; 1 Samory Mashela St., Moscow, 117998, Russia; 5N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Ministry of Health of Russia; 1 Ostrovityanova St., Moscow, 117997, Russia
Hereby we present methodological aspects and prognostic significance of minimal residual disease (MRD) monitoring in infant acute leukemias. Based on our own experience we made algorithm for detection of MRD in this group of patients. We conclude that general concordance between MRD detection by flow cytometry and real-time polymerase chain reaction (PCR) for fusion gene transcripts achieved 87.0 %. Concordance was significantly lower during induction in comparison to consolidation/intensification and relapse treatment (78.6; 90.4 and
93.4 %, correspondingly; p = 0.002). It was not dependent on presence of normal B-cell precursors. Concordance between MRD results obtained by qualitative real-time PCR in bone marrow and peripheral blood samples was 84.5 %. Interestingly, all discrepant results (22 samples
15.5 %) were MRD-positive in bone marrow, but negative in peripheral blood. Despite high qualitative concordance rate between MRD detection in bone marrow and peripheral blood samples we could not show prognostic value of MRD monitoring in peripheral blood by fusion gene transcripts. Multivariate analysis revealed that MRD-positivity at time-point 4 in bone marrow was the only significant and independent prognostic factor of unfavorable outcome in the observed group of patients (hazard ratio 7.326; 95 % confidence interval 2.378—22.565).
Key words: 11q23/MLL rearrangements, infant acute leukemias, minimal residual disease
Введение
Острые лейкозы (ОЛ), ассоциированные с перестройками гена MLL (myeloid-lymphoid leukemia, mixed-lineage leukemia), расположенного в хромосомном регионе 11q23 [1—3], наиболее часто встречаются у де-
тей первого года жизни, поэтому в рамках данной работы мы остановимся только на этой возрастной группе.
В настоящее время достигнуты значительные успехи в лечении острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей старше 1 года: неуклонно повышаются общая
и бессобытийная выживаемость (БСВ) пациентов, снижается частота развития рецидивов. В то же время результаты терапии ОЛЛ у детей первого года жизни остаются неудовлетворительными: БСВ редко превышает 45 %, а основной причиной неудачи терапии являются рецидивы [4—14]. На сегодняшний день наиболее эффективным способом прогнозирования развития рецидивов считается определение минимальной остаточной болезни (МОБ). Для этой цели применяются такие высокочувствительные методы клинической лабораторной диагностики, как многоцветная проточная цитометрия и различные варианты поли-меразной цепной реакции (ПЦР). Однако биологические особенности ОЛ у детей первого года жизни требуют разработки специальных методов выявления МОБ с последующим сравнительным анализом полученных результатов между ними и оценкой вероятности развития рецидивов.
При использовании метода проточной цитомет-рии для мониторинга МОБ у детей первого года жизни с ОЛЛ основными сложностями являются особенности иммунофенотипа опухолевых клеток при наличии перестроек гена MLL, а также нестабильность экспрессии антигенов во время терапии [15, 16]. Кроме того, чаще всего описываются только алгоритмы оценки МОБ у детей с CD10-позитивными В-линейными ОЛЛ, в то время как у детей первого года жизни преобладают CD10-негативные варианты. Несмотря на то, что при CD10-позитивном и CD10-негативном вариантах ОЛЛ из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ) применяется одинаковая панель антигенов, отдельные маркеры используются в различных целях (табл. 1). Исходя из этого, нами было сформулировано 2 различных алгоритма анализа данных (рис. 1). Для
Таблица 1. Задачи применения различных антигенов для определения МОБ при CD10-позитивном и CD10-негативном ВП-ОЛЛ
Маркер CD10-позитивный ВП-ОЛЛ CD10-негативный ВП-ОЛЛ
CD19 Выделение всех клеток В-линии Выделение всех клеток В-линии
CD10 Выделение опухолевых клеток Исключение из анализа нормальных ВП
CD20 Выделение опухолевых клеток, исключение из анализа В-лимфоцитов Исключение из анализа нормальных ВП и В-лимфоцитов
CD34 Выделение опухолевых клеток Выделение опухолевых клеток
CD58 Выделение опухолевых клеток Выделение опухолевых клеток
CD38 Дифференцирование опухолевых клеток от нормальных ВП Дифференцирование опухолевых клеток от периферической крови
CD45 Выделение опухолевых клеток Выделение опухолевых клеток
успешного определения МОБ нужно также учитывать, что фенотип опухолевых клеток может существенно меняться во время терапии [17, 18].
Еще одним способом мониторинга МОБ, использовавшимся нами, является обнаружение химерных транскриптов с участием MLL методами качественной обратно-транскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР) и/или количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для выявления химерных транскриптов. Этот метод дает хорошую возможность контролировать МОБ у пациентов первого года жизни, так как перестройки 11q23/MLL встречаются у большинства из них [4, 5, 10, 19—21], а данный метод молекулярной диагностики является стандартизованным, легко воспроизводимым и относительно быстро выполнимым [22—24]. Более того, ОТ-ПЦР позволяет получать результаты определения МОБ, сопоставимые с результатами выявления перестроек генов Ig/TCR [25, 26] и проточной цитометрии [27].
Сравнительная характеристика различных методов определения МОБ приведена в табл. 2.
Актуальность создания системы мониторинга МОБ у детей первого года жизни обусловлена еще и тем, что в нашей стране Л. Г. Фечиной разработан оригинальный отечественный протокол MLL-Baby для терапии ОЛЛ у детей этой возрастной группы [30], который предусматривает многократное определение МОБ (рис. 2). Это, в свою очередь, обусловливает необходимость установления роли наличия и величины МОБ в различные точки наблюдения для прогнозирования исходов терапии.
Определение МОБ невозможно без всесторонней оценки инициальных характеристик лейкозных клеток, включая наличие и тип перестройки 11q23/MLL, а также иммунофенотипа опухолевых бластов с использованием стандартного цитогенетического исследования, флуоресцентной гибридизации in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH), ПЦР, проточной цитометрии. Более того, считается, что целый ряд объективных факторов затрудняют диагностику ОЛ у детей первого года жизни: криптические варианты транслокаций, большое разнообразие перестроек 11q23/MLL, существование различных типов химерных транскрип-тов с участием гена MLL, нестабильность иммунофе-нотипа опухолевых бластов [16, 31—38].
Показано, что клинические особенности ОЛ и чувствительность к терапии зависят не только от наличия перестройки 11q23/MLL per se, но и от типа гена-партнера [39, 40], которых на сегодняшний день известно 79 [41]. Наиболее частыми партнерами MLL являются гены AF4, MLLT1, MLLT3, MLLT10, MLLT4, ELL, на долю которых суммарно приходится около 85 % всех случаев MLL-позитивных ОЛ как у детей, так и у взрослых [31, 41, 42]. За счет оставшихся 15 % и достигается большое разнообразие химерных генов с участием MLL, и именно их биологические особенности и клинические характеристики ОЛ, ассоцииро-
са
а
cv
CS
(в
а
CV
са
а
см
ев
С019+$$С'°ш-клетки
С010Ш20-клетки
Оценка экспрессии СР10 и других маркеров на графиках СйЮ/другой маркер Оценка экспрессии СР34, СР45, СР20, СР58, СР38
Результат не получен
Результат полуЧен^^х^^
Обратное гейтирование (график РБС/ББС)
Рис. 1. Алгоритм анализа данных проточной цитометрии для мониторинга МОБ при CD10-позитивном и CD10-негативном вариантах ВП-ОЛЛ
Таблица 2. Характеристика различных методов, применяемых для определения МОБ у пациентов с ОЛЛ (приводится по [28, 29] с дополнениями)
Показатель Метод
определение перестроек генов % и ТСК методом ПЦР-РВ определение химерных транскриптов методом ПЦР-РВ многоцветная проточная цитометрия
Чувствительность 10-4-10-5 10-4-10-6 10-4-10-5 (зависит от количества вносимых клеток)
Е ш Количественный диапазон 10-2-10-4 10-4-10-5 Варьирует в различных исследованиях
• Применимость для подавляюще- • Высокая чувствительность; • Применимость для подавляющего большинства пациентов с ОЛЛ; • быстрота; • возможность количественной оценки результата; • источник дополнительной информации о нормальных и опухолевых клетках; • стандартизация в рамках проводимых протоколов терапии
Преимущества го большинства пациентов с ОЛЛ; • высокая чувствительность; высокая степень стандартизации; • доказанная надежность • стабильность мишени во время курса терапии; • быстрота; • относительная простота
при использовании в качестве стратификационного критерия; •исходный материал (ДНК) стабилен при транспортировке выполнения; • для наиболее частых химерных транскриптов имеется стандартизованная методика
Недостатки
• Большая длительность;
• возможная нестабильность выбранных маркеров (феномен клональной эволюции);
• для проведения теста требуется высокий уровень знаний и опыта
Применимость
90-95 %
• Применимо только у части пациентов (40-45 %);
• полная стандартизация проведена только для BCR-ABL; для остальных химерных генов разработаны только условия проведения ОТ-ПЦР;
• существует риск ложнопозитивных результатов вследствие контаминации;
• исходный материал (РНК) малостабилен при транспортировке
• BCR-ABL (5-8 % детей и 30-35 % взрослых с ВП-ОЛЛ);
• ^3^X1 (1-2 % детей и взрослых);
• перестройки MLL (70-80 % детей младше 1 года; 3-5 % детей старше
1 года; 5-7 % взрослых);
• ETV6-RUNX1 (20-25 % детей)
• Изменение иммунофенотипа во время терапии;
• В-линейная регенерация может затруднять проведение анализа;
• низкая клеточность во время
и после индукции может затруднять проведение анализа;
• для проведения теста требуется высокий уровень знаний и опыта
> 95 %
(зависит от количества одновременно определяемых маркеров)
ванных с редкими перестройками гена ИЬЬ, наименее изучены. Традиционно считается, что наиболее неблагоприятной при ОЛЛ является транслокация ^4;11)/ MLL-AF4, в то время как прогноз для пациентов
с ^П^/Жг-Жт и t(9;11)/MLL-MLLT3 несколько лучше [40]. С другой стороны, в рамках проспективного исследования Interfant-99 пациенты с любой из вышеперечисленных транслокаций имели сходную
Профаза DEXA
Дни
ТН1
I
t
ТН1 _|_
ТН2 ТН3
ТН4
ТН5
ТН6
Только МОБ+
i УУУУУУУУi
A
сс
Консолидация I + ATRA
Консолидация II + ATRA
Консолидация III + ATRA
Поддерживающая терапия + 8 курсов ATRA
Протокол MLL-Baby
12 Гр только > 12 мес с инициальным нейролейкозом
Поддерживающая терапия + 8 курсов ATRA
ТН2
t
ТН3
ТН4 ТН5
ТН6
ТН7
ТН8
ТН9
Недели
алааалаа
Только МОБ+
J_
CS
а
cv
CS
cv
0
8
15
36
43
33
106
Критерии стратификации:
• иве - ^{4;11){ц21;ц23)/МИ-АР4 или день 36/43 попгезропаег;
• !Рв - любые другие перестройки 1^23/М/1 или отсутствие перестроек 1^23/М£ в случае достижения клинико-гематологической ремиссии на 36-й день.
Рис. 2. Схема протокола MLL-Baby с указанием точек наблюдения (ТН), в которые проводилась оценка МОБ
величину БСВ [5]. Наиболее неблагоприятными транслокациями при остром миелобластном лейкозе (ОМЛ) являются t(10;11)(p12;q23)/MLL-MLLT10 и t(6;11) (q27;q23)/MLL-MLLT4 [39].
Таким образом, оценка МОБ на основе анализа инициальных цитогенетических, молекулярно-генети-ческих и иммунофенотипических свойств опухолевых бластов при ОЛ у детей первого года жизни является актуальным вопросом детской гематологии/онкологии.
Материалы и методы
Для сравнения методов выявления МОБ — проточной цитометрии и ОТ-ПЦР — в анализ был включен 401 образец костного мозга (КМ), полученный от 65 пациентов первого года жизни с ОЛЛ. МОБ методом проточной цитометрии определяли на приборах FACS Canto, FACS Canto II и FACS Aria (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения FACS Diva 4.0-6.1 (Becton Dickinson, США). Результат определения МОБ рассчитывали в виде процентного содержания опухолевых клеток среди всех ядросодер-жащих клеток КМ. Образцы КМ считали МОБ-пози-тивными при величине МОБ > 0,01 %. При этом для большинства образцов удалось достичь аналитической чувствительности в 0,001 %. Методические осо-
бенности технологии проточной цитометрии для мониторинга МОБ были описаны нами ранее [17, 43].
Перестройки 11q23/MLL выявляли методами стандартной цитогенетики, FISH, ОТ-ПЦР по ранее описанным протоколам [35, 36, 44]. Для исключения образцов низкого качества из анализа перед проведением ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ выполняли оценку качества РНК с использованием микроструйных чипов RNA 6000 Nano LabChip (Caliper Technologies, США) на биоанализаторе Agilent 2100 (Agilent, Германия) согласно инструкции производителя. В дальнейшую работу брали образцы, в которых показатель целостности РНК превышал 4,2 [45].
В исследование по оценке прогностической значимости выявления МОБ методом ПЦР-РВ было включено 53 пациента с ОЛЛ и установленным типом перестроек гена MLL, получавших лечение по протоколу MLL-Baby. В исследуемой группе было 20 (37,7 %) мальчиков и 33 (62,3 %) девочки, медиана возраста составила 5,3 (0,03-11,80) месяца. У 25 (47,2 %) пациентов был выявлен химерный транскрипт MLL-AF4, у 10 (18,9 %) - MLL-MLLT3, у 9 (17,0 %) - MLL-MLLT1, у 5 (9,4 %) - MLL-MLLT10, у 4 (7,5 %) - MLL-EPS15. МОБ определяли в 142 парных образцах КМ и периферической крови. Количественную ПЦР-РВ c чувствительностью не ниже 10-4 проводили согласно реко-
са
а
сч
ев
се
а
cv
мендациям международного протокола «Европа против рака» [22, 23].
Для статистической обработки данных использовали программное обеспечение SPSS 18.0, Statistica 8.0, R-statistics. При сравнении 2 групп пациентов по количественным признакам использовали критерий Манна—Уитни. Результаты терапии оценивали по кривым БСВ, построенным по методу Каплана—Майера, а также по кумулятивной вероятности развития рецидива. Для сравнения кривых использовали непараметрические log-rank критерий и критерий Грея соответственно. Стандартную ошибку рассчитывали по формуле Гринвуда. Расчет отношения опасности (ОО) с 95 % доверительным интервалом (ДИ) был проведен по методу Кокса в однофакторной и многофакторной моделях. Параметры сравнивали с использованием теста Вальда. Все различия считали достоверными при р < 0,05. Информированное согласие на проведение диагностических и лечебных процедур было получено во всех случаях.
Результаты
Качественная сопоставимость результатов проточной цитометрии и ОТ-ПЦР в 401 образце КМ составила 87,0 %. При этом в 50 образцах МОБ была обна-
ружена только в ходе ПЦР, и лишь в 2 — только при проточной цитометрии. Сопоставимость результатов была достоверно ниже в образцах, взятых на этапе индукционной терапии (п = 131; 78,6 %) по сравнению с образцами этапов консолидации/интенсификации (п = 209; 90,4 %) и терапии рецидива (п = 61; 93,4 %) (р = 0,002). В то же время не выявлено значимых различий между 3 точками наблюдения (15-й, 36-й и 43-й дни) во время индукционной терапии (р = 0,098) (рис. 3).
Образцы пациентов с наличием химерного транскрипта MLL-MLLT3 имели наименьшие показатели сопоставимости данных проточной цитометрии и ОТ-ПЦР по сравнению с теми, у которых выявлялись MLL-AF4, MLL-MLLT1, MLL-EPS15(р < 0,001) (рис. 4). Наличие в образце нормальных ВП не влияло на сопоставимость результатов обнаружения МОБ (р = 0,838).
Несмотря на то, что прямое количественное сопоставление результатов определения МОБ двумя данными методами невозможно, кинетика величины МОБ во время терапии сходна для проточной цито-метрии и ПЦР-РВ (рис. 5). Вследствие этого у пациентов, у которых определяется химерный транскрипт с вовлечением MLL, возможно одновременное применение данных методов. Во время индукционной терапии и в начале консолидации/интенсификации, когда
Все образцы (n = 401)
Индукция ремиссии (n = 131)
Консолидация/
ОНКОГ обнаружено 2 NJ LO 5 о обнаружено 8 № 27
ОТ-ПЦР не обнаружено 2 О н е ж у 126 га 1 н б о е н 17
£ п.
интенсифик ация (n = 209)
100 19
1 89
Терапия рецидива (n = 61)
37 4
унар 0 20
обнаружено не обнаружено
Сопоставимость 87,0 %
обнаружено не обнаружено обнаружено не обнаружено обнаружено не обнаружено Проточная цитометрия
Сопоставимость 78,6 % Сопоставимость 90,4 % Сопоставимость 93,4 %
День 15 (n = 45) День 36 (n = 52) День 43 (n = 34)
обнаружено 3 № 5 обнаружено 3 NJ 1 Л обнаружено 8 8
ОТ-ПЦР не обнаружено о О н е жу 4 1 1 н б о е н 5 не обнаружено о 8
обнаружено не обнаружено обнаружено не обнаружено обнаружено не обнаружено
Проточная цитометрия
Сопоставимость 88,9 % Сопоставимость 71,1 % Сопоставимость 76,5 %
Рис. 3. Сопоставимость выявления МОБ на разных этапах терапии
МИ-АР4 (п = 230)
МП-МОЛ (п = 76)
Ми-МШ3 (п = 73)
Ми-ЕРБ15 (п = 22)
обнаружено 5 1 ю обнаружено 3 1 о обнаружено 2 2 (Л обнаружено то 3
ОТ-ПЦР не обнаружено 2 6 не обнаружено 0 2 не обнаружено 0 2 не обнаружено 0 11
ю
а
см
ев
обнаружено не обнаружено Сопоставимость 93,9 %
обнаружено не обнаружено Проточн; Сопоставимость 86,8 %
Наличие ВП (п = 271)
обнаружено не обнаружено Проточная цитометрия
Сопоставимость 65,7 %
Отсутствие ВП (п = 130)
обнаружено не обнаружено
Сопоставимость 86,4 %
обнаружено 3 3 Ю обнаружено 8 № 18
ОТ-ПЦР не обнаружено 2 О н е ж у 100 га 0 н б о е н 26
ю
а
см
обнаружено не обнаружено обнаружено не обнаружено
Проточная цитометрия Сопоставимость 87,4 % Сопоставимость 86,1 %
Рис. 4. Сопоставимость выявления МОБ у пациентов с различными типами химерных транскриптов, а также в зависимости от наличия нормальных ВП
День 0 День 15 День 36 День 43 Нт (I) НВ2 (II) ШЗ (III) Нт (IV) НВ2 (V) 1-тз (VI) Рецидив
100
10
о т
и ц
о р
П
0,1
0,01
0,001
156,490
100,0
93,500 35,010 8,900
1,660
0,860 1,854 2,298
1,193 0,420 0,260 0,180 0,310 0,070 0,660 ^0,175
0,061
0,032 0,026
0,003
100
10
П
0,1
0,01
0,001
Рис. 5. Динамика выявления МОБ методами проточной цитометрии (синяя кривая) и ПЦР-РВ (красная кривая) у пациентки с наличием химерного транскрипта MLL-AF4
са
а
см
ев
се
а
см
МОБ-негативные п = 31, в ППР 23; БСВ 0,70 ± 0,09
МОБ-позитивные
I п = 22, в ППР 2; БСВ 0,06 ± 0,06
24 36 48 60 72 84 96 108 120 130 Время наблюдения, мес
Ей 1,0
и д
ци 0,9 ец
£ 0,8 и
тви 0,7
з
а
а 0.6 ь т
ос 0,5 н
тоя 0,4 р
е
£ 0,3 а
вн 0,2
£ 0,1 м
<с 0,0
МОБ-позитивные 0,92 ± 0,01
МОБ-негативные 0,29 ± 0,08
0
20
40 60 80 Время наблюдения, мес
100
120
Медиана времени наблюдения 5,02 года
Рис. 6. БСВ и кумулятивная вероятность развития рецидива у МОБ-позитивных и МОБ-негативных пациентов в зависимости от выявления МОБ в точке наблюдения 4 в КМ. Здесь и на рис. 7: ППР — полная продолжительная ремиссия
В
С
1,0 0,9 0,8 0,7 0.6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
МОБ-негативные п = 14, в ППР 12; БСВ 0,85 ± 0,09
МОБ-позитивные п = 11, в ППР 1; БСВ 0,09 ± 0,08
1од-гапк р = 0,0004
га 1,0 в
иди 0,9
ц
е
ре 0,8 я
иит 0,7 в
з
ра 0.6
ьтос 0,5 н
тя 0,4
о р
ве 0,3 я
явна 0,2 и
к 0,1
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Время наблюдения, мес
му 0,0
МОБ-позитивные 0,88 ± 0,08
0
МОБ-негативные 0,14 ± 0,01
р < 0,001
20
:
40
60 80 Время наблюдения, мес
100
—I—
120
о р
е В
1,0 0,9 0,8 0,7 0.6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0
МОБ-негативные п = 17, в ППР 11; БСВ 0,64 ± 0,11
0
МОБ-позитивные
11, в ППР 1; БСВ 0,096 ± 0,08
1од-гапк р = 0,0047 12
24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 Время наблюдения, мес
2 1,0
и д
ид 0,9 ц
е
£ 0,8 I 0,7
з
ра 0.6 ь
тос 0,5 нт
§ 0,4 р
е
ве 0,3
я
а
вн 0,2 и
тля 0,1
у
Л 0,0
МОБ-позитивные 0,90 ± 0,08
МОБ-негативные 0,35 ± 0,06
р < 0,002
20
40 60 80 Время наблюдения, мес
Медиана времени наблюдения 5,02 года
100
120
Рис. 7. БСВ и кумулятивная вероятность развития рецидива у 25 пациентов группы высокого риска (с наличием MLL-AF4) (а) и 28 пациентов группы промежуточного риска (все остальные перестройки гена MLL) (б) в зависимости от обнаружения МОБ в точке наблюдения 4 в КМ
а
б
0
необходимо количественное определение МОБ, предпочтительнее использовать данные проточной цитоме-трии. Но в последующих точках наблюдения достаточно только качественного определения МОБ, поэтому целесообразнее использовать результаты ОТ-ПЦР/ ПЦР-РВ вследствие более высокой чувствительности метода.
Оценка прогностической роли выявления МОБ в ходе лечения по протоколу MLL-Baby показала, что наличие МОБ в точке наблюдения 4 в КМ ведет к достоверному снижению БСВ и повышению кумулятивной вероятности развития рецидива (рис. 6). При разделении пациентов по группам риска протокола MLL-Baby сохранялись достоверные различия в величинах БСВ и кумулятивной вероятности развития рецидива между МОБ-позитивными и МОБ-негативны-ми больными в точке наблюдения 4 в КМ (рис. 7). В то же время использование периферической крови
для выявления МОБ у данной группы пациентов себя не оправдало. Технически это выполнимо, однако значимой прогностической роли выявление МОБ в периферической крови не имело. При проведении многофакторного анализа единственным значимым фактором являлось сохранение МОБ в точке наблюдения 4 в КМ (ОО 7,326; 95 % ДИ 2,378-22,565) (табл. 3).
Сходные данные получены и для ОМЛ у детей первого года жизни. Длительное сохранение МОБ при ОМЛ, даже в условиях клинико-гематологической ремиссии, неизбежно приводит к рецидиву (рис. 8).
Обсуждение
МОБ, как уже отмечалось ранее, — это сохранение в организме пациента опухолевых клеток в количествах, не распознаваемых стандартными цитологическими методами. Но даже в том случае, если в образцах КМ, взятых во время терапии, количество опухолевых
см
ев
Таблица 3. Анализ прогностических показателей, влияющих на возникновение рецидивов у пациентов первого года жизни с ОЛЛ, получающих терапию по протоколу МЬЬ-ВаЬу, с учетом МОБ в точке наблюдения 4 в КМ
СМ
Показатель Пациенты События Однофакторный анализ Многофакторный анализ
ОО 95 % ДИ Р ОО 95 % ДИ Р
Возраст
Старше 6 месяцев 22 8 Референтное — 0,059 Референтное — 0,513
Младше 6 месяцев 31 19 2,179 0,949—5,005 1,393 0,515—3,765
Иммунофенотип
В1-ОЛЛ 36 16 0,746 0,346—1,610 0,623 1,611 0,405—6,416 0,499
В11-ОЛЛ 8 7 2,136 0,899—5,077 0,079 1,225 0,274—5,469 0,790
ВШ-ОЛЛ 9 4 0,703 0,242—2,041 0,514 1 — —
Наличие MLL-AF4
Нет 28 4 Референтное — 0,685 Референтное — 0,529
Есть 25 8 0,853 0,396—1,840 0,752 0,311—1,821
Инициальный лейкоцитоз, х 10^/л
< 100 29 11 Референтное — 0,019 Референтное — 0,995
> 100 24 16 2,443 1,129—5,285 0,996 0,338—2,934
Инициальное поражение центральной нервной системы
Нет 33 12 Референтное — 0,004 Референтное — 0,071
Есть 19 15 2,995 1,382—6,493 2,187 0,936—5,114
Количество бластов в 1 мкл крови на 8-й день терапии дексаметазоном
< 1000 46 21 Референтное — 0,096 Референтное — 0,993
> 1000 7 6 2,131 0,856—5,304 0,996 0,364—2,722
МОБ в точке наблюдения 4
Отсутствие 31 7 Референтное — 0,001 Референтное — 0,001
Наличие 22 20 7,181 3,002—17,177 7,326 2,378—22,565
са
а
см
ев
се
а
см
100,000
10,000
- 1,000
0,100
0,010
0,001
302,083
100,0 Т 53Л02 45,701 91,808 f 14,894 / \J / »19,543
\ f \ 5,658 5,286 0,955 / г • 11 492 9,766 11,492
1,175 0,364
0,146 \ --Уо,129 0,133
_ 0,146 f \0,129 0,039
/°,068\о,016 / 0,018 »"оДОб'0,034 0,045 0,025 0,022
0,012 -_/ 0,007 0,006 0,002
01
01
Ln t— t—
о
40
0 1 1
о
40
о о
о
о о
Отмена терапии Рецидив
Рис. 8. Мониторинг МОБ у пациента с ОМЛ и наличием химерного транскрипта MLL-MLLT11 методом ПЦР-РВ. Синяя кривая — величина МОБ, красная — чувствительность, рассчитанная согласно рекомендациям консорциума «Европа против рака» [22]
клеток ниже уровня чувствительности цитологического метода (< 1 %), они вносят существенный вклад в неблагоприятный исход заболевания [46—51]. Определение МОБ — это один из современных вариантов оценки ответа опухоли на химиотерапию, и оно находит свое применение при лечении не только ОЛ, но и ряда солидных опухолей, лимфом, множественной мие-ломы.
Большие усилия были приложены для стандартизации всех этапов количественного анализа при определении специфических для каждого больного перестроек генов иммуноглобулинов (Ig) и Т-клеточных рецепторов (TCR) методом ПЦР. Это дало возможность определить требования к количеству вносимого в реакцию материала, сформулировать основные понятия и принципы, разработать алгоритмы данного вида лабораторной диагностики в условиях проведения многоцентровых исследований [52, 53]. Данный метод широко применяется при мониторинге МОБ у детей и взрослых с ОЛЛ в европейских странах [28, 46, 49, 54]. На основании результатов мониторинга МОБ уже сегодня проводится стратификация пациентов с ОЛЛ, получающих терапию по многим современным протоколам [50, 54—56]. Метод хорошо себя зарекомендовал не только при de novo ОЛЛ, но и при рецидивах [57, 58].
Из недостатков определения МОБ методом выявления индивидуальных перестроек Ig/ TCR следует отметить то, что проведение такого исследования техни-
чески сложно, растянуто во времени и относительно дорого [28, 29, 48]. Это затрудняет его использование для решения клинических задач в условиях нашей страны.
Еще одним подходом для мониторинга МОБ является использование сиквенса зоны разрыва в MLL и гене-партнере [59] для создания пациент-специфичной тест-системы с оценкой методом ПЦР-РВ [54, 60, 61]. К преимуществам данного метода следует отнести возможность абсолютного подсчета МОБ (по сравнению с использованием РНК/кДНК), а также прямую взаимосвязь между количеством химерного гена с участием MLL и опухолевых клеток лейкозного клона (по сравнению с перестройками ^/ТСВ). В целом последовательность выполнения и интерпретации результатов очень близка к тому, что было предложено Европейской рабочей группой по изучению МОБ при ОЛЛ (ESG-MRD-ALL, в настоящее время - EuroMRD) для перестроек ^/ТСВ [52]. Данный подход технически выполним и позволил с успехом проводить мониторинг МОБ как у детей первого года жизни [54], так и у взрослых [60] с наличием перестроек MLL. Сравнительный анализ определения МОБ по перестройкам /§/ТСВ и индивидуальной структуре зоны разрыва в ДНК при образовании химерного гена с участием MLL показал хорошую степень сопоставимости двух методов [54].
Третьим из существующих способов мониторинга МОБ является применение ОТ-ПЦР и/или ПЦР-РВ для обнаружения химерных транскриптов. Химерные
транскрипты, выявляемые методом ОТ-ПЦР, или величина МОБ, определяемая при проведении ПЦР-РВ, используются в качестве фактора ответа на терапию относительно редко. Одной из причин этого является то, что химерные гены встречаются в среднем только у 40 % пациентов с ОЛЛ. Однако в случае обнаружения химерных транскриптов они являются высокочувствительными (10-4—10-6) и стабильными маркерами [28, 29]. Поэтому данный вариант мониторинга МОБ нашел свое применение в группах, выделенных именно по наличию конкретного химерного гена. Так, в работе L. Elia и соавт. при выявлении химерных транс-криптов MLL-AF4 методами ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ
у 17 взрослых пациентов с ОЛЛ было показано, что у больных, достигших МОБ-негативности, кумулятивная вероятность развития рецидива была ниже, чем у остававшихся МХХ-АР4-позитивными (44 и 88 % соответственно) [61]. Позднее этой же группой исследователей был проведен анализ 12 случаев ОЛЛ, включая 1 пациента младше 1 года и 3 — старше 1 года с наличием химерного транскрипта ЫЬЬ-ЫЬЬТ1. Интересно, что у 5 больных в этой группе, включая пациента первого года жизни, получавшего терапию по протоколу Шег!аП>99, было отмечено длительное персисти-рование химерного транскрипта ЫЬЬ-ЫЬЬТ1, а также повторное его выявление после достижения МОБ-не-
CV
CS
Определение ^¿¿-ассоциированного иммунофенотипа
FISH t(7;12)*
11q23/M£+, ген-партнер неизвестен
11q23/M£+, редкий химерный транскрипт
11q23/Mi+, типичный химерный транскрипт
FISH t(7;12)
ДИ-ПЦР*
Клонирование в плазмиду + 10-кратные разведения
ОТ-ПЦР
Подбор праймеров и зонда
ПЦР-РВ
Оценка специфичности
Калибровочная кривая ]
1
Мониторинг МОБ (ПЦР-РВ)
Мониторинг МОБ (проточная цитометрия)
са
а
cv
Рис. 9. Алгоритм комплексной лабораторной диагностики и мониторинга МОБ при ОЛу детей первого года жизни на основании инициальных характеристик опухолевых бластов. Под MLL-ассоциированным иммунофенотипом понимали наличие экспрессии Ж2на СD45+-клетках при отсутствии экспрессии CD10 и CD20у пациентов с ОЛЛ, а также наличие экспрессии CD11b, NG2, CD99, CD15, CD65 при ОМЛ.
*ОТ-ПЦР проводится в 2 этапа в зависимости от частоты встречаемости отдельных перестроек гена М!Х. У пациентов с ОЛЛ 1-й этап:
MLL-AF4, М1Х-М1ХТ1, MLL-MLLT3; 2-й этап: MLL-EPS15, MLL-MLLT10. У пациентов с ОМЛ 1-й этап: MLL-MLLT3, MLL-MLLT10, М1Х-МЬЬТ11, MLL-ELL; 2-й этап: MLL-AF4, MLL-MLLT4, MLL-MYO1F, MLL-FOXO4. MLL-SEPT6, MLL-SEPT9.
для выявления транслокации ^7;12) проводится пациентам с ОМЛ. ***ДИ-ПЦР — длинная инвертированная ПЦР
es
^ гативности без последующего развития клинико-ге-^ матологического рецидива [62]. Все это свидетельствует в пользу того, что определение МОБ путем 1- выявления химерных транскриптов с участием MLL сч должно применяться в таргетных группах, каковой являются дети первого года жизни, как для получения новых данных о биологии опухоли, так и для оценки клинической значимости этого метода, что и было продемонстрировано нами. 5 Четвертым методом определения МОБ является
Е многоцветная проточная цитометрия. При оценке МОБ этим способом позитивными считаются образ® цы, в которых на точечных графиках определяется г группа из 10 и более клеток, имеющих лейкоз-ассоци-ированный иммунофенотип и значения параметров - светорассеяния, соответствующие лимфоцитам/лимЕ фобластам. Максимальная чувствительность метода (анализ 1 000 000 клеток) составляет 0,001 %, т. е. возможно выявить 1 опухолевую клетку среди 100 000 5 нормальных. В то же время далеко не во всех случаях клеток в образце достаточно для достижения такой чувствительности. Поэтому минимально достаточной 2Е рутинной чувствительностью обычно принято считать 0,01 %, для достижения которой необходим анализ ^ 100 000 клеток. Если по тем или иным причинам не уда-2 ется собрать достаточное количество клеток, а опухо-
левые клетки не выявляются, исследование считается не выполненным.
Результаты определения МОБ методом проточной цитометрии при ОЛЛ у детей первого года жизни на данный момент представлены лишь в 1 публикации группы Interfant, в которой исследовался 51 пациент, получавший терапию по протоколам Interfant-99 и Inter-fant-06 в рамках итальянской группы AIEOP. МОБ определяли на 15-й и 33-й дни индукционной терапии. Авторами работы был сделан вывод о том, что определение МОБ методом проточной цитометрии на 15-й день терапии может быть с успехом использовано в комбинации с другими прогностическими факторами для стратификации пациентов [63].
Исходя из собственных данных, представленных здесь и опубликованных ранее [17, 27, 35—38, 43], мы сформулировали алгоритм комплексной диагностики и мониторинга МОБ при ОЛ у детей первого года жизни на основании сочетанного применения различных методов клинической лабораторной диагностики (рис. 9).
Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 14-35-00105, а также постановлением № 211 Правительства Российской Федерации, контракт № 02.А03.21.0006.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Cimino G., Moir D.T., Canaani O. et al. Cloning of ALL-1, the locus involved
in leukemias with the t(4;11)(q21;q23), t(9;11)(p22;q23), and t(11;19)(q23;p13) chromosome translocations. Cancer Res 1991;51(24):6712-4.
2. Ziemin-van der Poel S., McCabe N., Gill H.J. et al. Identification of a gene, MLL, that spans the breakpoint in 11q23 translocations associated with human leukemias. Proc Natl Acad Sci USA 1991;88(23):10735-9.
3. Tkachuk D., Kohler S.,
Cleary M. Involvement of a homolog of Drosophila tritorax by 11q23 chromosomal translocations in acute leukemias. Cell 1992;71(4):691-700.
4. Шориков Е.В. Результаты программного лечения острого лимфобластного лейкоза у детей первого года жизни. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2005. 34 с. [Shorikov E.V. Treatment results
of acute lymphoblastic leukemia in infants. Author's abstract of thesis ... of candidate of medicine. Moscow, 2005. 34 p. (In Russ.)].
5. Pieters R., Schrappe M., De Lorenzo P.
et al. A treatment protocol for infants younger than 1 year with acute lymphoblastic leukaemia (Interfant-99): an observational
study and a multicentre randomised trial. Lancet 2007;370(9583):240-50.
6. Hilden J., Dinndorf P., Meerbaum S. et al. Analysis of prognostic factors of acute lymphoblastic leukemia in infants: report
on CCG 1953 from the Children's Oncology Group. Blood 2006;108(2):441-51.
7. Ferster A., Bertrand Y., Benoit Y. et al. Improved survival for acute lymphoblastic leukaemia in infancy: the experience
of EORTC-Childhood Leukaemia Cooperative Group. Br J Haematol 1994;86(2):284-90.
8. Silverman L., McLean T., Gelber R. et al. Intensified therapy for infants with acute lymphoblastic leukemia: results from
the Dana-Farber Cancer Institute Consortium. Cancer 1997;80(12):2285-95.
9. Lauer S., Camitta B., Leventhal B. et al. Intensive alternating drug pairs after remission induction for treatment of infants with acute lymphoblastic leukemia:
A Pediatric Oncology Group pilot study. J Pediatr Hematol Oncol 1998;20(3):229-33.
10. Tomizawa D., Koh K., Sato T. et al. Outcome of risk-based therapy for infant acute lymphoblastic leukemia with or without an MLL gene rearrangement, with emphasis on late effects: a final report of two consecutive studies, MLL96 and MLL98,
of the Japan Infant Leukemia Study Group. Leukemia 2007;22(11):2258—63.
11. Dördelmann M., Reiter A., Borkhardt A. et al. Prednisone response is the strongest predictor of treatment outcome in infant acute lymphoblastic leukemia. Blood 1999;94(4):1209—17.
12. Biondi A., Rizzari C., Valsecchi M.G. et al. Role of treatment intensification
in infants with acute lymphoblastic leukemia: results of two consecutive AIEOP studies. Haematologica 2006;91(4):534—7.
13. Frankel L., Ochs J., Shuster J.J. et al. Therapeutic trial for infant acute lymphoblastic leukemia: the Pediatric Oncology Group experience (POG 8493).
J Pediatr Hematol Oncol 1997;19(1):35—42.
14. Chessells J., Harrison C., Watson S. et al. Treatment of infants with lymphoblastic leukaemia: results of the UK Infant Protocols 1987-1999. Br J Haematol 2002;117(2):306-14.
15. de Zen L., Bicciato S., te Kronnie G. et al. Computational analysis of flow cytometry antigen expression profiles
in childhood acute lymphoblastic leukemia: an MLL/AF4 identification. Leukemia 2003;17(8):1557-65.
16. Borkhardt A., Wuchter C., Viehmann S. et al. Infant acute lymphoblastic leukemia —
combined cytogenetic, immunophenotypical and molecular analysis of 77 cases. Leukemia 2002;16(9):1685-90.
17. Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю., Цаур Г.А. и др. Алгоритм применения проточной цитометрии для мониторинга минимальной остаточной болезни
при CDlO-негативном остром лимфо-бластном лейкозе из В-линейных предшественников. Вопросы диагностики в педиатрии 2012;(5):31—6. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al. Methodology of flow cytometry application for minimal residual disease monitoring in childhood CD10-negative B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Voprosy diagnostiki v pediatrii = Diagnostic Issues in Pediatrics 2012;(5):31-6. (In Russ.)].
18. Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю., Цаур Г.А. и др. Изменения иммунофено-типа опухолевых бластов при CDlO-пози-тивном остром лимфобластном лейкозе
у детей к 15-му дню индукционной терапии по протоколу ALL-MB-2008. Иммунология 2010;(2):60-4. [Popov A.M., Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al. Changes in blasts immunophenotype in CD10-positive children acute lymphoblastic leukemia by 15th day of induction therapy according ALL-MB-2008 protocol. Immunologiya = Immunology 2010;(2):60-4. (In Russ.)].
19. Pui C.H., Carroll W., Meshinchi S. et al. Biology, risk stratification, and therapy
of pediatric acute leukemias: an update. J Clin Oncol 2011;29(5):551—65.
20. Biondi A., Cimino G., Pieters R. et al. Biological and therapeutic aspects of infant leukemia. Blood 2000;96(1):24-33.
21. Chen C.S., Sorensen P., Domer P. et al. Molecular rearrangements on chromosome 11q23 predominate in infant acute lymphoblastic leukemia and are associated with specific biologic variables and poor outcome. Blood 1993;81(9):2386-93.
22. Beillard E., Pallisgaard N., van der Velden V. et al. Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using "real-time" quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) —
a Europe Against Cancer Program. Leukemia 2003;17(12):2474-86.
23. Gabert J., Beillard E., van der Velden V. et al Standardization and quality control studies of "real-time" quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction
of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia — a Europe Against Cancer Program. Leukemia 2003;17(12):2318-57.
24. van Dongen J., Macintyre E., Gabert J. et al. Standardized RT-PCR analysis
of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia 1999;13(12):1901—18.
25. Zaliova M., Fronkova E., Krejcikova K. et al. Quantification of fusion transcript reveals a subgroup with distinct biological properties and predicts relapse
in BCR/ABL-positive ALL: implications for residual disease monitoring. Leukemia 2009;23(5):944-51.
26. Taube T., Eckert C., Korner G. et al. Real-time quantification of TEL-AML1 fusion transcripts for MRD detection
in relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Comparison with antigen receptor-based MRD quantification methods. Leuk Res 2004;28(7):699-706.
27. Попов А.М., Цаур Г.А., Вержбицкая Т.Ю. и др. Сравнение результатов определения минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии
и выявления химерного транскрипта полимеразной цепной реакцией у детей, больных B-линейным острым лимфо-бластным лейкозом. Гематология и транс-фузиология 2010;55(2):3-9. [Popov A.M., Tsaur G.A., Verzhbitskaya T.Yu. et al. Comparison of the results of evaluating the minimal residual disease by flow cytometry and by detecting of chimeric transcript by the polymerase chain reaction in children with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Gematologiya i transfuziologiya = Hematology and Transfusiology 2010;55(2):3-9. (In Russ.)].
28. Bmggemann M., Schrauder A., Raff T. et al. Standardized MRD quantification in European ALL trials: proceedings
of the second international symposium on MRD assessment in Kiel, Germany, 18-20 September 2008. Leukemia 2010;24(3):521-35.
29. Szczepanski T. Why and how to quantify minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia 2007;21(4):622-6.
30. Fechina L., Shorikov E., Tsaur G. et al. Contribution of all-trans retinoic acid
to improved early relapse-free outcome in infant acute lymphoblastic leukemia comparing to the chemotherapy alone. Blood 2007;110(11):832А, abstract 2828.
31. Meyer С., Kowarz E., Hofmann J. et al. New insights to the MLL recombinome
of acute leukemias. Leukemia 2009;23(8):1490-9.
32. Pieters R. Biology and treatment of infant leukemias. In: Treatment of acute leukemias: new directions for clinical research. Ed. by C.H. Pui. Totowa: Humana Press, 2003. Pp. 61-73.
33. Reaman G. Biology and treatment
of infant leukemias. In: Treatment of acute leukemias: new directions for clinical research. Ed C.H. Pui. Totowa: Humana Press, 2003. Pp. 75-83.
34. Цаур Г.А., Флейшман Е.В., Попов А.М. и др. Цитогенетическая и моле-кулярно-генетическая характеристика острых лейкозов у детей первого года жизни. Клиническая онкогематология 2011;4(2):134-41. [Tsaur G.A.,
Fleyshman E.V., Popov A.M. et al. Cytogenetics and molecular genetics of infant acute leukemias. Klinicheskaya onkogemato-logiya = Clinical Oncohematology 2011;4(2):134-41. (In Russ.)].
35. Цаур Г.А., Попов А.М., Алейникова О.В. и др. Характеристика перестроек 11q23(MLL) у детей первого года жизни с острым лимфобластным лейкозом. Онкогематология 2011;(3):57— 64. [Tsaur G.A., Popov A.M., Aleynikova O.V. et al. Detection
of 11q23(MLL) rearrangements in infant acute lymphoblastic leukemia. Onkogematologiya = Oncohematology 2011;(3):57-64. (In Russ.)].
36. Цаур Г.А., Плеханова О.М., Гиндина Т.Л. и др. Применение метода флуоресцентной гибридизации in situ для выявления перестроек гена MLL при острых лейкозах у детей первого года жизни. Медицинская генетика 2012;(7):35-45. [Tsaur G.A., Plekhanova O.M., Gindina T.L. et al. Detection of MLL gene rearrangements in infants under 12 month of age with acute leukemias by fluorescence in situ hybridization. Meditsinskaya genetika = Medical Genetics 2012;(7):35-45.
(In Russ.)].
37. Цаур Г.А., Флейшман Е.В., Гиндина Т.Л. и др. Характеристика перестроек 11q23/MLL при остром миелоидном лейкозе у детей первого года жизни. Клиническая онкогематология 2012;5(4):365-70. [Tsaur G.A., Fleyshman E.V., Gindina T.L. et al. Detection of 11q23(MLL) rearrangements in infant acute myeloid leukemia. Klinicheskaya onkogematologiya = Clinical Oncohematology 2012;5(4):365-70. (In Russ.)].
38. Цаур Г.А., Флейшман Е.В., Плеханова О.М. и др. Редкие перестройки хромосомного района 11q23 и гена MLL
при острых лейкозах у детей первого года жизни. Вопросы диагностики в педиатрии 2012;(6):16-24. [Tsaur G.A., Fleyshman E.V., Plekhanova O.M. et al. Rare 11q23/MLL rearrangements in infant acute leukemia. Voprosy diagnostiki v pediatrii = Diagnostic Issues in Pediatrics 2012;(6):16-24. (In Russ.)].
39. Balgobind B., Raimondi S., Harbott J. et al. Novel prognostic subgroups
in childhood 11q23/MLL-rearranged acute myeloid leukemia: results of an international retrospective study. Blood 2009;114(12):2489-96.
40. Pui C.H., Gaynon P., Boyett J. et al. Outcome of treatment in childhood acute lymphoblastic leukaemia with rearrangements of the 11q23 chromosomal region. Lancet 2002;359(9321):1909-15.
41. Meyer C., Hofmann J., Burmeister T. et al. The MLL recombinome of acute leukemias in 2013. Leukemia 2013;27(11):2165-76.
42. Felix C., Hosler M., Slater D. et al. MLL genomic breakpoint distribution within
is
a
cv
ев
(S
a
cv
Ц the breakpoint cluster region in de novo _j leukemia in children. J Pediatr Hematol g Oncol 1998;20(4):299-308. ig 43. Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю.,
Цаур Г.А. и др. Особенности мониторинга CV минимальной остаточной болезни
при B-линейных острых лимфобластных ^ лейкозах методом проточной цитометрии
у детей первого года жизни. Детская он-2 кология 2008;(2):32-5. [Popov A.M., в Verzhbitskaya T.Yu., Tsaur G.A. et al.
Peculiarities of minimal residual disease В monitoring by flow cytometry
in infants with B-lineage acute lymphoblastic leukemia Detskaya onkologiya = ts Pediatric Oncology 2008;(2):32-5. Z (In Russ.)].
44. Цаур Г.А., Наседкина Т.В., Попов А.М. и др. Время достижения молекулярной ремиссии как фактор Ц прогноза у детей первого года жизни
острым лимфобластным лейкозом. се Онкогематология 2010;(2):46—54. s [Tsaur G.A., Nasedkina T.V., Popov A.M. PJ et al. Time to molecular remission as i— prognostic factor in infant acute _ lymphoblastic leukemia. Onkogematolo-X giya = Oncohematology 2010;(2):46-54. (In Russ.)].
^ 45. Цаур Г.А., Друй А.Е., Попов А.М. и др. в Возможность использования микроструй-^ ных биочипов для оценки качества и коЕ личества РНК у пациентов с онкологиче-¡JJ скими и онкогематологическими в заболеваниями. Вестник уральской меди* цинской академической науки * 2011;(4):107—11. [Tsaur G.A., Druy А.Е., Popov А.М. et al. Microfluidic biochips for RNA quantity and quality evaluation in patients with oncological disorders. Vestnik ural'skoy meditsinskoy akademicheskoy nauki = Bulletin of the Ural Medical Academic Research 2011;(4):107-11. (In Russ.)].
46. van Dongen J.J., Seriu T., Panzer-Grumayer R. et al. Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia in childhood. Lancet 1998;352(9142):1731-8.
47. Dworzak M.N., Froschl G., Printz D. et al. Prognostic significance and modalities of flow cytometric minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002;99(6):1952-8.
48. Campana D. Minimal residual disease studies in acute leukaemia. Am J Clin Pathol 2004;122:S47-57.
49. Flohr T., Schrauder A., Cazzaniga G. et al. Minimal residual disease-directed risk stratification using real-time quantitative PCR analysis of immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements
in the international multicenter trial AIEOP-BFM ALL 2000 for childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2008;22(4):771-82.
50. Borowitz M., Devidas M., Hunger S.
et al. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia and its relationship to other prognostic factors: a Children's Oncology Group study. Blood 2008;111(12):5477-85.
51. Цаур Г.А., Попов А.М., Наседкина Т.В. и др. Прогностическое значение минимальной остаточной болезни, определенной путем выявления химерных транскриптов у детей первого года жизни, больных острым лимфобластным лейкозом, получающих терапию по протоколу MLL-Baby. Гематология и трансфузиоло-гия 2012;57(4):12-22. [Tsaur G.A.,
Popov A.M., Nasedkina T.V. et al. Prognostic significance of minimal residual disease detected by PCR for fusion gene transcripts in infant acute lymphoblastic leukemia treated by MLL-baby protocol. Gematologiya i transfuziologiya = Hematology and Transfusiology 2012;57(4):12-22. (In Russ.)].
52. van der Velden V., Cazzaniga G., Schrauder A. et al. Analysis of minimal residual disease by Ig/TCR gene rearrangements: guidelines for interpretation of real-time quantitative PCR data. Leukemia 2007;21(4):604-11.
53. van der Velden V., Panzer-Grumayer E.R., Cazzaniga G. et al. Optimization of PCR-based minimal residual disease diagnostics for childhood acute lymphoblastic leukemia
in a multi-center setting. Leukemia 2007;21(4):706-13.
54. van der Velden V., Corral L., Valsecchi M.G. et al. Prognostic significance of minimal residual disease in infants with acute lymphoblastic leukemia treated within the Interfant-99 protocol. Leukemia 2009;23(6):1073-9.
55. Garand R., Beldjord K., Cavé H. et al. Flow cytometry and IgH/TCR quantitative
PCR for minimal residual disease quantitation in acute lymphoblastic leukemia: a French multicenter prospective study on behalf of the FRALLE, EORTC and GRAALL. Leukemia 2013;27(2):370-6.
56. Schrappe M., Valsecchi M. G., Bartram C. et al. Late MRD response determines relapse risk overall and in subsets of childhood T-cell ALL: results
of the AIEOP-BFM-ALL 2000 study. Blood 2011;118(8):2077-84.
57. Eckert C., Biondi A., Seeger K. et al. Prognostic value of minimal residual disease in relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 2001;358(9289): 1239-41.
58. Bader P., Kreyenberg H., Henze G. et al. Prognostic value of minimal residual disease quantification before allogeneic stem-cell transplantation in relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia: the ALL-REZ BFM Study Group. J Clin Oncol 2009;27(3): 377-84.
59. Meyer C., Schneider B., Reichel M. et al. Diagnostic tool for the identification of MLL rearrangements including unknown partner genes. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(2):449-54.
60. Burmeister T., Meyer C., Schwartz S. et al. Monitoring minimal residual disease by quantification of genomic chromosomal breakpoint sequences in acute leukemias with MLL aberrations. Leukemia 2006;20(3):451-7.
61. Elia L., Gottardi E., Floriddia G. et al. Retrospective comparison of qualitative and quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction in diagnosing and monitoring the ALL1-AF4 fusion transcript in patients with acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia 2004;18(11):1824-30.
62. Elia L., Grammatico S,, Paoloni F. et al. Clinical outcome and monitoring of minimal residual disease in patients with acute lymphoblastic leukemia expressing
the MLL/ENL fusion gene. Am J Hematol 2011;86(12):993-7.
63. Popov A., Buldini B., de Lorenzo P. et al. Identification of low risk group in infants with acute lymphoblastic leukemia by flow cytometric minimal residual disease measurement at day 15 of Interfant-99 and Interfant-06 protocols treatment. Blood 2013;122(21):abstract 1333.
