CC BY
22
ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПЕРЕРАБОТКИ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
УДК 606
Хвойные бореальной зоны. Том XXXVI, № 1. С. 102-107 ИММОБИЛИЗАЦИЯ БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА НА ТВЕРДЫХ НОСИТЕЛЯХ Е. А. Мельникова1, Е. Б. Мельников2
1 Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, 660037, Красноярск, просп. им. газ. «Красноярский рабочий», 31
E-mail: [email protected] 2Сибирский юридический институт МВД России Российская Федерация, 660131, г. Красноярск, ул. Рокоссовского, 20
Приведены характеристики процесса получения биомассы базидиальных грибов методами глубинного и твердофазного культивирования. Показаны преимущества получения грибной биомассы методом глубинного культивирования. Базидиальные грибы в природных условиях произрастания характеризуются способностью самопроизвольного закрепления на различных поверхностях, и процесс иммобилизации мицелия на твердых носителях является для них в биологическом смысле естественным. Учитывая эти характеристики, было проведено культивирование базидиального гриба Pleurotus pulmonarius в глубинных условиях с использованием иммобилизации мицелия на твердом носителе. Проведенные исследования показали возможность получения иммобилизованной грибной биомассы на закрепленном полимерном носителе.
Принимая во внимание способность мицелия Pleurotus pulmonarius к иммобилизации на неподвижно закрепленном полимерном носителе, было выдвинуто предположение о возможности его иммобилизации и на других твердых частицах, в частности на измельченной пшеничной соломе. Проведение глубинно-твердофазного культивирования Pleurotus pulmonarius с добавлением в питательную среду измельченных частиц пшеничной соломы позволило получить иммобилизованную биомассу на частицах субстрата, пригодную для её последующего использования в качестве посевного материала в процессе твердофазного культивирования с получением белкового кормового продукта. Результаты эксперимента позволили разработать усовершенствованный способ переработки растительной биомассы, в котором способность мицелия к иммобилизации на частицах субстрата была использована на стадии получения инокулята для последующего его использования в качестве посевного материала в процессе твердофазного культивирования Pleurotus pulmonarius на растительном субстрате. Представлены режимы переработки пшеничной соломы с получением, как плодовых тел, так и белкового кормового продукта.
Ключевые слова: базидиомицеты, культивирование, мицелий, вешенка легочная, иммобилизация, субстрат.
Conifers of the boreal area. Vol. XXXVI, No. 1, P. 102-107 IMMOBILISATION OF BASIDIOMYCOTA FUNGI ON SOLID CARRIERS Е. А. Melnikova1, E. B. Melnikov2
:Reshetnev Siberian State University of Science and Technology 31, Krasnoyarsky Rabochy Av., Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation E-mail: [email protected] 2Siberian Law Institute Ministry of Internal Affairs of the Russian Federation 20, Rokossovskogo Str., Krasnoyarsk, 660131, Russian Federation
The characteristics of the process for obtaining biomass of basidiomycetes by methods of deep and solid-phase cultivation are given in the work. The advantages of obtaining fungal biomass by the method of deep cultivation are shown. Bazidial fungi under natural growth conditions are characterized by the ability of spontaneous fixation on various surfaces and the process of immobilization of mycelium on solid carriers is natural for them in the biological sense. Given these characteristics, the basidial fungus Pleurotus pulmonarius was cultured under deep conditions using the immobilization of mycelium on a solid carrier. The conducted studies have shown the possibility of obtaining immobilized fungal biomass on a fixed polymeric carrier with the production ofprotein biomass.
Taking into account the ability of the Pleurotus pulmonarius mycelium to immobilize on a fixed polymer carrier, it was suggested that it could be immobilized on other solid particles, in particular crushed wheat straw. Conducting deep-solid-phase cultivation of Pleurotus pulmonarius with addition of crushed wheat straw particles to the nutrient medium made it possible to obtain immobilized biomass on the substrate particles, suitable for its subsequent usage as a seed during the solid-phase culture to produce a protein feed product. The experimental results allowed developing an improved method for processing plant biomass in which the ability of the mycelium to immobilize on the substrate particles was used in the inoculum preparation stage for its subsequent usage as a seed during the solid-phase cultivation of Pleurotus pulmonarius on a plant substrate. In this paper, the treatment of wheat straw is presented, with the production of both fruiting bodies and protein fodder.
Keywords: basidiomycota fungi, cultivation, mycelium, Pleurotus pulmonarius, immobilization, substratum. The advantages of obtaining fungal biomass by the method of deep cultivation.
ВВЕДЕНИЕ
Плодовые тела грибов рода Р1еигои используются в пищевой промышленности как белковый продукт, который содержит широкий спектр биологически активных веществ, оказывающих положительное влияние на организм человека [1-3]. Кроме того, грибы рода Р1еигои обладают мощной ферментативной системой, позволяющей использовать их в процессе переработки растительной биомассы с получением, как плодовых тел, так и белкового кормового продукта [4; 5]. Применение таких продуктов, в сравнении с традиционными кормовыми продуктами на основе дрожжевых культур имеет значительные преимущества. Известно, что главным недостатком промышленных белковых кормовых продуктов на основе дрожжей является высокое (до 12 % в пересчете на белок) содержание нуклеиновых кислот [6]. Это вносит серьезные ограничения на их дозировку при составлении кормовых рационов для животных.
Грибную биомассу можно получать как классическим методом твердофазного культивирования (в виде плодовых тел), так и методом глубинного культивирования (в виде мицелиальной биомассы). В работе [7] проведено сравнение основных технологических характеристик получения грибной биомассы методами глубинного и твердофазного культивирования (табл. 1).
Данные табл. 1 наглядно показывают, что наиболее перспективным и технологичным методом получения грибной биомассы является процесс глубинного культивирования. При использовании данного метода продолжительность получения грибной биомассы сокращается более чем в 10 раз. При этом становится возможным полная автоматизация процесса и как следствие перспектива создания непрерывного способа получения грибной биомассы. Интенсификация процесса в случае глубинного культивирования, на наш взгляд, связана с созданием благоприятных условий роста мицелия по всему объему питательной
среды, как в отношении температуры культивирования, так и в эффективном обеспечении растущего мицелия питательными веществами и кислородом.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Один из представителей рода Р1еигои - Р1еигои ри1топаги Бг. (Р. риЫопапш) вешенка легочная является перспективным белковым продуцентом, не уступающей по своим питательным свойствам вешен-ке обыкновенной (Р1еигои ostreatus).
Глубинное культивирование Р. ри1топаги проводили в колбе Эрленмейера, ёмкостью 2 л в крахмал-аммонийной среде с содержанием крахмала 30 %. В процессе приготовления раствора крахмала для снижения вязкости проводили ферментативную обработку раствора термостабильной а-амилазой. Подготовленную таким образом питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при 0,05 МПа. Объем питательной среды в процессе культивирования составлял 1,3 л. Перемешивание достигалось за счет непрерывного барботирования воздуха. В связи с этим установка снабжалась барботажной магистралью, состоявшей из барбатера, ватного фильтра, соединительных трубок и стеклянного наконечника, имеющего достаточное количество мелких отверстий для поступления воздуха.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В проведенных ранее исследованиях было показано, что в биомассе Р. ри1топаги содержится около 32 % белка [5]. В его состав входят незаменимые аминокислоты: лизин, лейцин, изолейцин, валин, треонин, фенилаланин. Для сравнения питательных свойств белковой биомассы, полученной двумя, указанным выше методами, было определено содержание основных компонентов белковой биомассы Р1еигои ри1топаг1ш\ полученной методами твердофазного и глубинного культивирования (табл. 2).
Таблица 1
Технологические характеристики процессов получения биомассы Pleurotus pulmonarius
Наименование параметра Значение па раметра
при твердофазном культивировании при глубинном культивировании
Продолжительность процесса получения грибной биомассы, сут. 30-35 2-3
Особенности роста мицелия на поверхности субстратного блока по всему объему питательной среды
Автоматизация процесса используется ручной труд возможна полная автоматизация процесса
Таблица 2
Характеристики белковой биомассы Р1еигои ри1шопаг1ш, полученной методами твердофазного и глубинного культивирования
Наименование Содержание компонента, % [5]
компонента биомасса плодовых тел глубинная биомасса
Общий белок 32,2 31,5
Водорастворимые вещества 23,0 22,2
Нуклеиновые кислоты 4,0 1,1
Липиды 6,4 9,5
Как видно из табл. 2 содержание белков и водорастворимых веществ в биомассе плодовых тел близко к их содержанию в глубинной биомассе. В то же время в глубинной биомассе образуется в 1,4 раза больше липидов, чем в биомассе плодовых тел. Стоит отметить, что плодовые тела характеризуется более высоким содержанием нуклеиновых кислот, что может накладывать определенные ограничения на их использование в качестве пищевого продукта. При анализе данных, представленных в табл. 1 и 2, можно сделать вывод, что биомасса P. pulmonarius может рассматриваться как полноценный белковый пищевой продукт, однако получение такой биомассы наиболее целесообразно проводить методом глубинного культивирования. В этом случае получается продукт более благоприятного состава.
В ходе проведения процесса глубинного культивирования P. pulmonarius отмечалось накопление мицелия на стенках культивационной ёмкости и элементах технологического оборудования, в частности бар-ботажной магистрали. На основе этих наблюдений было выдвинуто предположение, что мицелий имеет склонность к иммобилизации. Вероятно, это связано с тем, что базидиальные грибы в природных условиях произрастания характеризуются способностью самопроизвольного закрепления на различных поверхностях, поэтому процесс иммобилизации мицелия на твердых носителях является для них в биологическом смысле естественным.
В условиях промышленного получения глубинной биомассы обрастание поверхностей производственного оборудования может привести к дополнительным производственным затратам на их очистку и, как следствие, увеличению времени технологического простоя оборудования. Очевидным способом устранения этого нежелательного явления может стать проведение глубинного культивирования с применением способа иммобилизации мицелия на твердом носителе, участвующем в процессе в качестве отдельного конструктивного элемента. Для проверки возможности реализации данного решения было проведено модельное культивирование с использованием в качестве такого элемента полимерной сетки. Выбор данного твердого носителя обусловлен его химической и биологической стойкостью, высокой механической прочностью, развитой поверхностью, достаточной проницаемостью для субстрата и барбатируе-мого воздуха. Проведение процесса культивирования с использованием твердого носителя показало, что растущий мицелий P. pulmonarius в течение первых шести часов роста полностью иммобилизуется на твердом носителе. Также было отмечено, что в про-
цессе роста иммобилизованный мицелий прочно фиксируется в ячейках сетки, и прирост биомассы происходит только на ее поверхности, оставляя свободными поверхности другого технологического оборудования. На рис. 1 представлен внешний вид биомассы P. pulmonarius, полученной методом глубинного культивирования.
Кроме того было отмечено, что в первом случае в процессе культивирования происходит структурирование биомассы. Это позволяло получать продукт однородной структуры, который после сушки легко отделялся от носителя в виде порошка и не требовал дополнительного измельчения [8]. Очевидно, что получение иммобилизованной глубинной биомассы, учитывая её мицелиальное строение, может оказаться в технологическом отношении более целесообразным в сравнении с получением неиммобилизованной.
Принимая во внимание способность мицелия P. pulmonarius к иммобилизации на неподвижно закрепленном полимерном носителе, было выдвинуто предположение о возможности его иммобилизации и на других твердых частицах, в частности на измельченной пшеничной соломе. В ходе исследований использовались частицы длиной 3-5 мм и шириной около 0,1 мм. При проведении эксперимента измельченный растительный субстрат помещали в полимерную сетку и в центре сформированного субстратного блока фиксировали наконечник барботажной трубки, таким образом, чтобы воздух подавался в центр субстратного блока (рис 2), что позволяло прогнозировать рост мицелия по всему объему блока.
Результаты эксперимента показали, что мицелий хорошо фиксируется на поверхности субстратного блока, закрепляясь в ячейках сетки, однако рост мицелия в глубину блока зафиксирован не был, кроме того отмечалось незначительное обрастание мицелием стенок культивационной ёмкости.
Анализ полученных результатов, позволил выдвинуть дальнейшее предположение о возможности более полной иммобилизации мицелия на твердых частицах в случае, если они будут равномерно распределены в глубине питательной среды в условиях интенсивного перемешивания, а не локализованы в виде фиксированного субстратного блока.
Проведенное модельное глубинно-твердофазное культивирование P. pulmonarius с добавлением в питательную среду измельченной соломы показало, что мицелий в динамических условиях способен фиксироваться на твердых частицах растительного субстрата. Показателем иммобилизации мицелия явился тот факт, что в процессе культивирования фиксировали отсутствие прикрепления мицелиальных образований
на стенках культивационной ёмкости и барбатажной магистрали. В тоже время после отделения культу-ральной жидкости отмечался быстрый рост воздушного мицелия на отфильтрованном растительном субстрате.
Полученные результаты позволили разработать усовершенствованный способ переработки расти-
а
тельной биомассы, в котором способность мицелия к иммобилизации на частицах пшеничной соломы была использована на стадии получении инокулята для последующего его использования в качестве посевного материала в процессе твердофазного культивирования P. pulmonarius. Режимы данного способа представлены в табл. 3.
б
Рис. 1. Глубинная биомасса Pleurotus pulmonarius, полученная при иммобилизации мицелия на полимерной сетке (а); без иммобилизации мицелия (б)
Рис. 2. Культивирование Pleurotus pulmonarius с применением способа иммобилизацией мицелия на твердом носителе:
а - культивационная ёмкость в процессе культивирования; б - зафиксированный в полимерной сетке растительный субстрат, колонизированный мицелием
Таблица 3
Технологические режимы переработки растительной биомассы с использованием способа иммобилизации мицелия на твердых частицах
Наименование параметра культивирования Значение параметра
Стадия получения инокулята методом глубинно-твердофазного культивирования Pleurotus pulmonarius
Питательная среда крахмал-аммонийная
Содержание растительного субстрата в питательной среде, г/л 9-10
Размер частиц субстрата (пшеничная солома), мм 3-5
Время стерилизации питательной среды, ч 1
Давление стерилизации, МПа 0,05-0,06
Окончание таблицы 3
Наименование параметра культивирования Значение параметра
рН питательной среды 5,7
Концентрация культуры после засева, г/л 5,0-5,2
Расход воздуха, л/л среды в мин. 1,6-1,7
Продолжительность культивирования, ч 70-72
Стадия твердофазного культивирования Pleurotus pulmonarius
Растительный субстрат пшеничная солома
Размер частиц субстрата, мм 3-5
Влажность субстратного блока, % 65-70
Температура воздуха в растильной камере, оС 24-26
Следует отметить, что данный метод, с использованием стадии глубинно-твердофазного культивирования грибов, имеющих мицелиальное строение, в частности грибов рода Pleurotus имеет неоспоримые технологические преимущества:
- создаются оптимальные условия для сохранения стерильности на стадии засева и процесса культивирования;
- создаются благоприятные условия для роста мицелия;
- мицелий в готовом продукте распределен равномерно по всему объему растительного субстрата;
- на стадии глубинно-твердофазного культивирования происходит иммобилизация мицелия на твердых частицах субстрата, прирост глубинной биомассы и адаптация культуры к используемому растительному субстрату.
На стадии твердофазного культивирования P. pulmonarius в качестве субстрата вместо измельченной пшеничной соломы, также могут быть использованы и измельченные древесные опилки, в частности опилки березы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования показали возможность получения иммобилизованной грибной биомассы на закрепленном полимерном носителе, с получением глубинной биомассы P. pulmonarius перспективной для использования в качестве белковой пищевой добавки. Разработанный метод глубинно-твердофазного культивирования позволил получить иммобилизованную грибную биомассу на частицах растительного субстрата, пригодную для последующего её использования в качестве посевного материала в процессе твердофазного культивирования для получения, как плодовых тел, так и белкового кормового продукта.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Биологические особенности лекарственных макромицетов в культуре : сб. науч. тр. / под ред. С. П. Вассер. Киев : Альтерпресс, 2011. Т. 1. 212 с.
2. Экспертиза грибов : учеб.-справ. пособие / И. Э. Цапалова [и др.] ; под ред. В. М. Позняковского. Новосибирск : Сиб. унив. изд-во, 2002. 256 с.
3. Биологически активные соединения грибов западной Сибири для разработки лекарственных препаратов / Теплякова Т. В. [и др.] // Химия и технология растительных веществ : тез. докл. IX Всерос. науч. конф. с междунар. участием и шк. молодых ученых. Сыктывкар-Москва : Ин-т химии Коми НЦ УрО РАН, 2015. С. 228.
4. Способ получения кормовой добавки : пат. 2093041 Рос. Федерация : МПК А 23 К 1/00, С 12 Р 21/00 / Н. А. Величко, С. М. Репях. № 5046218/13 ; заявл. 05.06.1992 ; опубл. 20.10.1997.
5. Мельникова Е. А. Технология переработки растительной биомассы с получением белковых кормовых продуктов. Микробиологическая конверсия Pleurotus pulmonarius : автореф. дис. ... канд. техн. наук : 05.21.03 / Мельникова Елена Александровна. Красноярск, 2016. 23 с.
6. Беккер З. Э. Физиология и биохимия грибов. М. : Изд-во МГУ, 1988. 230 с.
7. Смирнов К. А., Алашкевич Ю. Д., Решетова Н. С. Особенности твердофазной ферментации // Химия растительного сырья. 2009. № 3. С. 161-164.
8. Способ получения биомассы базидиального гриба Pleurotus pulmonarius : пат. 2588474 Рос. Федерация : C1 / Е. А. Мельникова, Е. Б. Мельников, Т. В. Рязанова, П. В. Миронов ; заявл. 11.03.2015 ; опубл. 27.06.2016.
REFERENCES
1. Biologicheskiye osobennosti lekarstvennykh mak-romitsetov v kul'ture : sb. nauch. tr. / pod red. S. P. Vas-ser. Kiyev : Al'terpress, 2011. T. 1. 212 s.
2. Ekspertiza gribov : ucheb.-sprav. posobiye / I. E. Tsapalova [i dr.] ; pod red. V. M. Poznyakovskogo. Novosibirsk : Sib. univ. izd-vo, 2002. 256 s.
3. Biologicheski aktivnyye soyedineniya gribov zapadnoy Sibiri dlya razrabotki lekarstvennykh preparatov / Teplyakova T. V. [i dr.] // Khimiya i tekhnologiya rastitel'nykh veshchestv : tez. dokl. IX Vseros. nauch. konf. s mezhdunar. uchastiyem i shk. molodykh uchenykh. Syktyvkar-Moskva : In-t khimii Komi NTS UrO RAN, 2015. S. 228.
4. Sposob polucheniya kormovoy dobavki : pat. 2093041 Ros. Federatsiya : MPK A 23 K 1/00, S 12 R
21/00 / N. A. Velichko, S. M. Repyakh. № 5046218/13 ; zayavl. 05.06.1992 ; opubl. 20.10.1997.
5. Mel'nikova E. A. Tekhnologiya pererabotki rasti-tel'noy biomassy s polucheniyem belkovykh kormovykh produktov. Mikrobiologicheskaya konversiya Pleurotus pulmonarius : avtoref. dis. ... kand. tekhn. nauk : 05.21.03 / Mel'nikova Elena Aleksandrovna. Krasnoyarsk, 2016. 23 s.
6. Bekker Z. E. Fiziologiya i biokhimiya gribov. M. : Izd-vo MGU, 1988. 230 s.
7. Smirnov K. A., Alashkevich Yu. D., Reshetova N. S. Osobennosti tverdofaznoy fermentatsii // Khimiya rastitel'nogo syr'ya. 2009. № 3. S. 161-164.
8. Sposob polucheniya biomassy bazidial'nogo griba Pleurotus pulmonarius : pat. 2588474 Ros. Federatsiya : C1 / E. A. Mel'nikova, E. B. Mel'nikov, T. V. Ryaza-nova, P. V. Mironov ; zayavl. 11.03.2015 ; opubl. 27.06.2016.
© Мельникова Е. А., Мельников Е. Б., 2018
Поступила в редакцию 16.11.2017 Принята к печати 26.02.2018
