CC BY
82
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ IGF-1-ЗАВИСИМАЯ ЭКСПРЕССИЯ МРНК... 17
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616-006.448-02:577.175.722
C.C. Шушанов, Т.А. Кравцова, А.А. Ставровская IGF-1-ЗАВИСИМАЯ ЭКСПРЕССИЯ МРНК ГЕНА MRP1 И LRP В ЛИНИЯХ КЛЕТОК МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Шуманов Cаин Сакенович, канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза
адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-17-69 e-mail: [email protected]
Статья поступила: 12.04.2012, принята к печати: 30.10.2012.
Резюме
В работе была исследована роль экзогенного IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов MDR1, MRP1, BCRP, LRP, ответственных за возникновение МЛУ, в трех линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. Указанные линии клеток культивировали в среде без сыворотки в присутствии и отсутствии экзогенного IGF-1 в течение 72 ч, а затем с использованием метода ОТ-ПЦР исследовали экспрессию мРНК генов МЛУ. Было показано, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1, добавленный в физиологических концентрациях, негативно регулировал экспрессию мРНК генов MRP1 и LRP и не влиял на экспрессию мРНК гена BCRP. Экспрессия мРНК MDR1 в этой линии клеток не выявлялась изначально. В двух других линиях клеток ММ: RPMI1640 и IM9 экзогенный IGF-1 не влиял на экспрессию мРНК исследованных генов МЛУ.
Ключевые слова: множественная миелома, инсулиноподобный фактор роста 1-го типа, экспрессия мРНК, множественная лекарственная устойчивость.
S.S. Shushanov, T.A. Kravcova, A.A. Stavrovskaya
IGF-1 - DEPENDENT EXPRESSION OF MRNA OF GENE MRP1 AND LRP IN HUMAN MULTIPLE MYELOMA CELL LINES
FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
The role of exogenous insulin-like growth factor type-1 (IGF-1) in the regulation of mRNA expression of genes: MDR1, MRP1, BCRP, LRP, responsible for the emergence of MDR, in the three cell lines of human MM: RPMI1640, RPMI8226, and IM9 were investigated. These cell lines were cultured in serum-free medium in the presence and absence of exogenous IGF-1 levels within 72 hours, and then using the RT-PCR investigated the mRNA expression of MDR genes. It was shown that the exogenous IGF-1 added at the physiological concentrations in to the cell line RPMI8226 negatively regulate the expression of mRNA: MRP1 and LRP, and did not affect the mRNA expression of the gene BCRP. Expression of MDR1 mRNA in this cell line is not detected initially. In two other cell lines MM: RPMI1640 and IM9 exogenous IGF-1 had no effect on mRNA expression of MDR genes studied.
Key words: multiple myeloma, insulin-like growth factor type-1, mRNA expression, multidrug resistance.
Введение
ММ - лимфопролиферативное заболевание, морфологическим субстратом которого являются плазматические клетки, продуцирующие моноклональный иммуноглобулин. Одним из злокачественных свойств клеток ММ является их способность мигрировать и локализоваться в костном мозге, где они пролиферируют и секретируют моноклональный иммуноглобулин (М-белок), а также активируют остеокласты, которые разрушают костную ткань [1]. Длительность жизни больных в основном зависит от чувствительности к лечению противоопухолевыми препаратами, среди которых алкили-рующие соединения (мелфалан, циклофосмамид, хлорбутин и другие), доксорубицин, бортезомиб (велкейд) [5]. Со временем у многих больных ММ развивается устойчивость к самым разным химиопрепаратам, различающимся и по химической струк-
туре, и по механизму действия. Иными словами, возникает множественная лекарственная устойчивость [2; 3]. Одним из хорошо охарактеризованных на сегодняшний день молекулярных механизмов МЛУ опухолей человека является повышенная активность Pgp, кодируемого геном MDR1. Pgp является трансмембранным белком и работает по принципу насоса, который, используя энергию АТФ, выбрасывает из клетки лекарственные препараты. То есть, чем большее количество этого белка в мембране клетки, тем больше лекарства выбрасывается из клетки и, как результат, более высокая устойчивость клетки к лекарственным препаратам [2; 3]. Р. 8оппеуеИ и соавт. показали, что у нелеченных больных ММ экспрессия Pgp обнаруживается только в 12 % образцов биопсий, тогда как у леченных больных, у которых возник рецидив и они стали нечувствительными к химиопрепаратам, экспрессия Pgp обнаруживается в 40-80 % случаев [21].
Синтез белка Pgp регулируется на уровне транскрипции его мРНК то есть, чем больше в клетке мРНК гена MDR1, тем больше в мембране, окружающей клетку, белка Pgp.
Наряду с Pgp в МЛУ вовлечены также и другие известные на сегодняшний день белки: АТФ-зависимые транспортеры MRP1, BCRP, а также белок LRP, экспрессия которых также регулируется на уровне траскрипции их мРНК [2; 3; 7].
Несмотря на то, что сегодня созданы различные классы ингибиторов, которые в основном являются конкурентами субстратов перечисленных выше белков-транспортеров, их действие в преодолении МЛУ пока недостаточно эффективно, и в некоторых случаях такие ингибиторы вызывают сильные негативные побочные эффекты [11]. Поэтому наряду с дальнейшим совершенствованием уже имеющихся ингибиторов и поиском новых классов и типов ингибиторов МЛУ, которые были бы с одной стороны более эффективными, а с другой - универсальными для всех белков-транспортеров и не имели бы побочных эффектов, необходимо параллельно проводить фундаментальные исследования молекулярных механизмов регуляции экспрессии и активации самих белков МЛУ. Предварительные экспериментальные данные позволяют высказать гипотезу о том, что лекарственная устойчивость клеток ММ может возникать при взаимодействии между В-клеточным опухолевым клоном и микроокружением костного мозга, которое состоит из экстраклеточного матрикса, клеток стромы и других клеток. Показано, что взаимодействие клеток ММ с клетками стромы костного мозга активирует в последних транскрипцию и секрецию цитокинов и ростовых факторов, в том числе и инсулиноподобного фактора роста 1 типа, который, как было установлено, не только усиливает пролиферацию, выживание и миграцию клеток ММ, но также участвует в механизмах возникновения резистентности к общепринятым химиопрепаратам [13; 16]. Вместе с тем роль IGF-1 и его рецепторов в возникновении МЛУ при ММ на сегодня не изучена. В данной работе мы поставили перед собой цель исследовать роль экзогенного IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК генов MDR1, MRP1, BCRP, LRP, ответственных за МЛУ при ММ в трех линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9.
Материалы и методы
Линии клеток ММ и IGF-1
В работе были использованы три типа суспензионных линий клеток множественной миеломы человека, экспрессирующие на своей поверхности указанные в скобках маркеры дифференцировки: IM-9 (CD138+, CD38-, CD45+, CD56-, CD19+), RPMI 8226 (CD1, CD38+, CD45-, CD56±, CD19-), RPMI 1640 (CD138+, CD38+, CD45-, CD56±, CD19-) [14]. Происхождение указанных линий клеток: человек, костный мозг, миелома. Способ культивирования: суспензионный в среде RPMI-1640 с 10 %-ной ТЭС при 37 “C, 5 % CO2. В экспериментах использовался человеческий рекомбинантный IGF-1 (Millipore).
Выделение РНК из клеток ММ и ОТ-ПЦР
Для выделения тотальной РНК использовали Trizol (“Sigma”, США). Процедуру выделения РНК проводили согласно стандартному протоколу. Электрофорез выделенной РНК проводили в 1 %-ном агарозном геле при напряжении 100 Вольт в течение 30-40 мин. Качество выделенной РНК оценивали по наличию полос рибосомальной РНК. Концентрацию
РНК определяли по оптическому поглощению при V 260 нм. Экспрессию мРНК исследуемых генов определяли полуколичественным методом ОТ-ПЦР. Реакционная смесь для синтеза кДНК содержала 2 мкг тотальной клеточной РНК, 4 мкл “случайных” (гексануклеотиды) праймеров (фирма “Литех”, Россия),
1 мкл 25 мМ даТР (“Мві Регшепіає”), 2-4 ед. ингибитора РНКаз (“МВІ Регтейає”), 100 ед. обратной транскриптазы М-МиЬУ (“МВІ Регтепіає”). Объем смеси составлял 25 мкл. Синтез кДНК с матрицы РНК проводили на амплификаторе “Терцик” (“ДНК-технология”, Россия) со следующими параметрами: обратная транскрипция - 42 °С, 50 мин; денатурация - 94 °С; 5 сек. Для наработки продуктов ПЦР составляли реакционную смесь, содержащую: 1 мкл раствора кДНК; 20 пкмоль каждого из праймеров; 1 мкл 25 мМ ЛЫТР (“МВІ Регтепіає”); 2,5 мкл 10-кратного буфера с (КН4)2804 (“МВІ Регтепіає”), 25 мМ MgCl2; 1 ед. Taq-ДНК полимеразы; Н2О до конечного объема 25 мкл; минерального масла - 30 мкл. Нуклеотидные последовательности использованных специфических праймеров приведены в таблице. Реакцию амплификации проводили на ампли-фикаторе “Терцик” (“ДНК-технология”, Россия) по следующей схеме: денатурация - 94 °С, 10 сек; ан-нилинг - Тт, 10 сек; синтез - 72 °С, 20 сек. значения температуры Тт и количество циклов ПЦР для каждого из генов приведены в таблице. В качестве внутреннего контроля для оценки количества взятой в реакцию РНК определяли экспрессию GAPDH. Продукты реакции ОТ-ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Размеры фрагментов оценивали в соответствии с расположением полос маркерной ДНК, гель фотографировали при ультрафиолетовом возбуждении с помощью цифровой камеры “8ат8и^ ССТУ ЬЕЖ”.
Результаты и обсуждение
ЮР-1 оказывает свой биологический эффект через связывание и активацию его рецептора ЮР-1Я, который является рецепторной тирозин киназой, гетеротетрамером, состоящим из двух внеклеточных а-субъединиц, связывающихся с ЮР-1, и двух внутриклеточных р-субъединиц, содержащих тирозин киназный домен.
Связывание ЮР-1 с ЮР-1Я приводит к активации внутренней тирозин киназы ЮР-1Я и последующему аутофосфорилированию тирозинов внутриклеточной р-субъединицы, включая околомем-бранный тирозин в положении 950, тирозины в тирозин киназном домене в положениях 1131; 1135 и 1136, и тирозины в С-концевом домене в положениях 1250; 1251 и 1316 [18]. Фосфорилированный тирозин в положении 950 служит сайтом связывания для субстратов ЮР-1Я, включающих ІЯ8(1-4), 8Ис, .ТАК-1, .Так-2.
После связывания и последующего фосфо-рилирования, перечисленные субстраты инициируют передачу сигналов от ЮР-1Я внутрь клетки посредством активирования целого ряда нижележащих эффекторов [12]. ЮР-1 также может связываться и активировать изоформу А рецептора инсулина (ІЯ-Л) [17], а также гибридный рецептор ЮР-1МР-А [20; 22].
В первой части исследования мы исследовали экспрессию мРНК IGF-1R, и (А и В изо-
формы рецептора инсулина) в трех линиях культур клеток ММ человека: ИрМі1640, ЯРМІ8226. ІМ-9 (рис. 1). Экспрессия мРНК IGF-1R была выраженной
во всех трех линиях клеток ММ. Экспрессия мРНК Ш-А была высокой в линиях клеток ЯРМІ 1640 и ЯРМІ8226, а в линии клеток ІМ9 - слабой. мРНК Ш-B не выявлялась ни в одной из трех линий клеток ММ. Таким образом, во всех трех линиях клеток ММ экспрессировались мРНК IGF-1R и мРНК Ш-А, и не экспрессировалась мРНК Ш-В. Поскольку в исследованных линиях клеток ММ мы выявили экспрессию мРНК IGF-1R и Ш-А (рис. 1), можно полагать, что возможны три типа лиганд-рецепторных взаимодействия: ЮР-МвР-Ж, ІОР-1/ЮР-1К/ІК-А, ЮР-1/ІЯ-А.
Во второй части исследования методом ОТ-ПЦР мы охарактеризовали экспрессию мРНК генов MDR1, MRP1, LRP и BCRP (рис. 2). Мы показали, что мРНК перечисленных генов экспрессируются во всех трех линиях культур клеток ММ человека: ЯРМІ1640, ЯРМІ8226 и ІМ9 (рис. 2). Уровень экспрессии мРНК гена MDR1 является высоким только в линии клеток ІМ-9, а в клетках ЯРМІ 1640 и ЯРМІ8226 экспрессия мРНК гена MDR1 является чрезвычайно слабой, практически на уровне чувствительности метода ОТ-ПЦР. В то же время, в линии клеток ІМ9 мРНК генов LRP и BCRP экспрессируются слабее, чем в линиях клеток ЯРМІ 1640 и ЯРМІ8226. Экспрессия мРНК гена MRP1 во всех перечисленных линиях культур клеток примерно одинакова. Таким образом, две линии клеток ММ: ЯРМІ1640 и ЯРМІ8226 являются очень похожими между собой по экспрессии мРНК генов: MDR1, MRP1, LRP и BCRP и отличаются от линии клеток ІМ9, в которых наблюдается очень высокая экспрессия мРНК MDR1 и низкая, по сравнению с клетками ЯРМІ1640 и ЯРМІ8226, экспрессия мРНК LRP и BCRP (рис. 2).
В следующей части работы в линиях клеток ММ человека ЯРМІ1640, КРМІ8226 и ІМ9 мы исследовали роль экзогенного ЮР-1 в регуляции экспрессии мРНК генов MDR1, MRP1, LRP и BCRP (рис. 3). С этой целью указанные линии клеток ММ культивировали в течение 72 ч в среде без сыворотки в присутствии и отсутствии ЮР-1 в концентрации 20 нг/мл, что соответствует его физиологической концентрации в сыворотке крови человека. В ходе эксперимента мы обнаружили, что в линии клеток ЯРМІ8226 присутствие экзогенного ЮР-1 приводит к выраженному ингибированию экспрессии мРНК генов LRP и MRP1, а в линии клеток ЯРМІ1640 - к незначительному ингибированию экспрессии мРНК MRP1 (рис. 3). В линии клеток ІМ9 ЮР-1 не изменяет экспрессию мРНК исследованных генов MDR.
На следующем этапе в указанных линиях клеток ММ мы исследовали экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и Ш-А в присутствии и отсутствии ЮР-1 (рис. 4). Мы обнаружили, что в линии клеток ЯРМІ8226 экзогенный ЮР-1 ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и Ш-А, и это четко коррелирует с заметным уменьшением в этой линии клеток количества мРНК генов LRP и MR.P1 (рис. 3). В линии клеток ЯРМІ1640 экзогенный ЮР-1 также ингибирует экспрессию мРНК Ш-А и незначительно ингибирует экспрессию мРНК IGF-Ш (рис. 4), что коррелирует с незначительным уменьшением экспрессии мРНК MRP1 (рис. 3). В линии клеток ІМ9 экзогенный ЮР-1 не ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и Ш-А, и экспрессия мРНК исследованных генов МЛУ также не изменяется. Таким образом, из трех взятых линий клеток ММ человека, две линии: ЯРМІ1640 и ЯРМІ8226 оказались чувствительными к ЮР-1, и
присутствие этого фактора приводит к ингибированию экспрессии мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A, и это в свою очередь коррелирует с ингибированием экспрессии мРНК MRP1 и LRP. Полученные нами данные предполагают следующую последовательность событий: в клетках RPMI8226 и RPMI1640 экзогенный IGF-1 ингибирует экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A, в результате этого уменьшается количество рецепторов IGF-1R и IR-A на поверхности клеток ММ, что приводит к уменьшению числа IGF-1/IGF-1R и IGF-1/IR-A взаимодействий и, как следствие, это приводит к инактивации нижележащих сигнальных путей в клетке, которые участвуют в регуляции экспрессии мРНК гена LRP и MRP1. Учитывая тот факт, что ингибирование экспрессии мРНК рецепторов IGF-1R и IRA (в клетках RPMI8226) приводит к выраженному ингибированию экспрессии мРНК LRP и MRP1, а ингибирование экспрессии мРНК рецептора IR-A (в клетках RPMI1640) - к незначительному ингибированию экспрессии мРНК MRP1 можно предположить, что в регуляции экспрессии мРНК LRP и MRP1 участвует IGF-1/IGF-1R сигнальный путь, а IGF-1/IRA сигнальный путь не является решающим. Ни в одной из трех линий клеток ММ экспрессия мРНК BCRP и мРНК MDR1 в присутствии IGF-1 не изменялась. Экспрессия мРНК гена MDR1 в клетках RPMI1640 и RPMI8226 является изначально чрезвычайно слабой (рис. 2), поэтому судить о роли экзогенного IGF-1 в регуляции экспрессии мРНК гена MDR1 в этих клетках не представляется возможным.
IGF-1-зависимая негативная регуляция экспрессии мРНК IGF-1R была описана в литературе ранее. Например, в экспериментах in vitro в мышечных клетках мыши C2C12 и в клетках нейроб-ластомы человека SH-SY5Y было показано, что IGF-1 негативно регулирует экспрессию мРНК IGF-1R на уровне транскрипции и не влияет на стабильность мРНК IGF-1R. Вместе с тем, IGF-1 рес-понсивные элементы в промоторной области гена IGF-1R не выявлены [12]. В нашей работе мы впервые показали, что в линии клеток ММ человека RPMI8226 экзогенный IGF-1 негативно регулирует экспрессию мРНК IGF-1R и мРНК IR-A, а в линии клеток RPMI1640 экзогенный IGF-1 негативно регулирует экспрессию мРНК IR-A.
На сегодня в литературе имеется не так много работ, посвященных исследованию роли IGF-1 и его рецептора IGF-1R в регуляции экспрессии генов, ответственных за МЛУ. Было показано, что в клетках рака толстой кишки мыши линии MCLM и в Т-лимфобластных клетках линии человека CCRF-CEM IGF-I индуцировал экспрессию гена MDR1 и значительно ингибировал гибель клеток от цито-токсических препаратов [10; 19]. В работе J. Ge и соавт. методом иммуногистохимии исследовали экспрессию IGF-1R и MRP1 в 102 образцах больных раком желудка и обнаружили, что IGF-1R экспрессировался в 75,2 % случаев, а MRP1 - в 69 % случаев. Такая высокая степень корреляции в экспрессии этих генов, несмотря на химиотерапию, ассоциировалась с плохим прогнозом у больных раком желудка [9].
В работе P. Maiso и соавт. показано, что ингибирование тирозин киназной активности IGF-1R усиливает действие леналидомида, дексаметазона, мелфалана и бортезомиба, а использование ингибитора тирозин киназной активности IGF-1R совместно с дексаметазоном и бортезомибом заметно подавляет рост клеток ММ in vitro [6].
Рис. 1. Экспрессия мРНК рецепторов ЮР-1: ЮР-Ж и Ш.-Л в линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226,1М9 в среде с 10%-ной ТЭС.
Рис. 2. Экспрессия мРНК генов, обуславливающих MDR, в линиях культур клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, 1М9 в среде с 10%-ной ТЭС.
Рис. 3. Экспрессия мРНК генов, обуславливающих MDR, в линиях культур клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, Ш9 в среде без сыворотки, в присутствии и в отсутствие экзогенного ЮР-1.
Рис. 4. Экспрессия мРНК рецепторов ЮР-1: ЮР-Ж и Ш.-Л в линиях клеток ММ человека: RPMI1640, RPMI8226, Ш9 в среде без сыворотки, в присутствии и в отсутствие экзогенного ЮР-1.
Нуклеотидные последовательности специфичных праймеров к генам, размер продукта,
Таблица температура отжига
Ген Название праймера. Нуклеотидная последовательность Размер продукта, пары оснований Т емп-ра отжига праймера
МОК1 \IDR1-F \IDR1-R 5-‘ССС АТС АТТС С А АТАйСАЄв -3 ’ 5 ’-СТТСАААСТТСТССТССТОА -3 ’ 167 п.о. 60<С
МКР1 МИРІ-Б МИР 1-Я 5 '-АТСААОАССО СТО ТС АТТС С-З5 5 ’О АОСААОО АТО АСТТОСАОО-З’ 180 п.о. 60<С
ВСКР ВСКР -¥ ВСКР-К 5 ’-TGCCCAGGACTCAATGC.AA.CAG -3' 5 ’ - А С А АТ ТТС А О Є Т АО О С ААТТ Є Т Є -3 * 172 п о. 60^С
ЬЯР ЬКР-ґ ЬКР-К 5 ’-СССССАТАС САСТАТАТССАТСТО -3 ’ 5 ’-ТССААААОССАСТСАТСТССТЄ -3’ 405 п.о. 60^С
Ш.-А ІКА-Р ІКА-Я 5 * -А АС С АО АОТ ОАО ТАТО АО О АТ-3’ 5 ’-ССОТТССАО АОСОААОТОСТТ -3’ 600 п.о. 60<С
ІКВ ІКВ-Ґ Г КВ -к 5 * -А АС С АО АОТ ОАО ТАТО АО ОАТ-З’ 5 ’-СССГТС САО АОСОААО ТОСТТ -3 ’ 63 6 п.о. 60*С
ЮБ-ГО. ГСР-1К-Е ЮР-К-К 5 ’ - А ТТО А О О А О ОТ С АС АО АО ААС - 3 ’ 5 -ТТСАТАТССТЄ ТТТТОО ССТЄ -3 ’ 755 п о. 61°С
О АРОН ОАРОН-Р ОАРОН-К 5 ’-ССССЮ ЄСС ААО О ТС АТСС АТС АС АА.СТГ Т-3 ' 5 ’-О ОС САТОАООТСС АССАСССТОТТОСТОТА-З * 513 п.о. 60<С
Недавно в аспиратах костного мозга, полученных от больных ММ, нами была сопоставлена экспрессия двух изоформ мРНК гена инсулиноподобного фактора роста 1-го типа IGF-1A и IGF-1B с экспрессией мРНК генов, ответственных за МЛУ: MDR1, MRP1, LRP, BCRP. В ходе исследования было выявлено, что обе изоформы мРНК гена IGF-1 в подавляющем большинстве случаев экспрессировались в тех же образцах, в которых гиперэкспрессировалась мРНК MDR1 и LRP, причем, степень коэкспрессии изоформ мРНК IGF-1 и мРНК MDR1 составила 90 %, а изоформ мРНК IGF-1 и мРНК LRP - 87,5 % [4].
Таким образом, в своей работе мы впервые показали, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1, добавленный в культуральную среду в физиологических концентрациях, ингибировал экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A (А изоформы рецептора инсулина), и это коррелировало с ингибированием экспрессии мРНК MRP1 и LRP. В другой линии клеток RPMI1640 экзогенный IGF-1 также ингибировал экспрессию мРНК IR-A и незначительно ингибировал экспрессию мРНК IGF-1R, что приводило к незначительному уменьшению экспрессии мРНК MRP1. В линии клеток IM9 экзогенный IGF-1 не влиял на экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A и в присутствии IGF-1 экспрессия мРНК исследованных генов МЛУ не изменялась.
Возможно, что IGF-1-зависимая регуляция экспрессии генов, ответственных за МЛУ, зависит от свойств самих клеток множественной миеломы. Например, в пока еще неопубликованной работе, мы показали, что клетки RPMI8226, в отличие от двух других линий клеток RPMI1640 и IM9, хорошо выживали и быстрее размножались в среде без сыворотки в течение 72 ч. Также клетки RPMI8226 отличались от двух других исследованных линий клеток тем, что экспрессировали мРНК IGF-2 (инсулиноподобный фактор роста
2 типа). Ранее было показано, что IGF-2 взаимодействует и с рецептором IGF-1R, и с рецептором IR-A, и активирует размножение клеток [8; 15]. Также не исключено, что экспрессия мРНК различных белков-транспортеров, участвующих в возникновении МЛУ, регулируются различным образом, и, возможно, что в их регуляции участвуют межклеточные взаимодействия, различные факторы роста и их рецепторы и активируемые ими сигнальные пути, мишенями которых являются промоторные регионы генов МЛУ. На эти и другие вопросы нам предстоит ответить в ходе наших дальнейших экспериментальных работ в этом направлении.
Литература
Заключение
Исследование механизмов возникновения лекарственной устойчивости к химиопрепаратам, применяемым при лечении больных ММ, является на сегодня одним из актуальных направлений в экспериментальной онкологии.
В этой работе мы исследовали роль экзогенного инсулиноподобного фактора роста 1 типа (IGF-1) в регуляции экспрессии мРНК генов MDR1, MRP1, BCRP, LRP, ответственных за возникновение МЛУ, в трех линиях клеток множественной миеломы человека: RPMI1640, RPMI8226 и IM9. Мы впервые показали, что в линии клеток RPMI8226 экзогенный IGF-1, добавленный в культуральную среду в физиологических концентрациях, ингибировал экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A (А изоформы рецептора инсулина) и это корреллировало с ингибированием экспрессии мРНК MRP1 и LRP.
В другой линии клеток RPMI1640 экзогенный IGF-1 также ингибировал экспрессию мРНК IR-A и незначительно ингибировал экспрессию мРНК IGF-1R, что приводило к незначительному уменьшению экспрессии мРНК MRP1. В линии клеток IM9 экзогенный IGF-1 не влиял на экспрессию мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A и в присутствии IGF-1 экспрессия мРНК исследованных генов МЛУ не изменялась.
Таким образом, из трех взятых линий клеток ММ человека две: RPMI1640 и RPMI8226 - оказались чувствительны к IGF-1, и присутствие этого фактора приводило к ингибированию экспрессии мРНК рецепторов IGF-1R и IR-A, и это в свою очередь коррелировало с ингибированием экспрессии мРНК MRP1 и LRP.
Мы предполагаем, что уменьшение количества рецепторов IGF-1R и IR-A на поверхности клеток ММ приводит к уменьшению числа IGF-1/IGF-1R и IGF-1/IR-A взаимодействий и, как следствие, это приводит к инактивации нижележащих сигнальных путей в клетке, которые участвуют в регуляции экспрессии мРНК генов МЛУ.
В пользу этого предположения также свидетельствуют наши данные, полученные ранее в экспериментах in vivo. Исследования роли IGF-1/IGF-1R и IGF-1/IR-A-зависимых сигнальных путей в регуляции экспрессии генов МЛУ при ММ нами будут продолжены.
1. Вотякова О.М., Демина Е.А. Множественная миелома / Клиническая Онкогематология. - Руководство для врачей под редакцией профессора Волковой М.А. (Издание второе, переработанное и дополненное). - М.: Медицина, 2007. - C. 847-73.
2. Ставровская А.А. Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная активностью транспортных белков клетки: некоторые новые факты и перспективы исследований // Биологические мембраны. - 2003. - 20(3). - С. 196-205.
3. Ставровская А.А. Опухолевая клетка в обороне // Соровский образовательный журнал. - 2001. -7(7). - С. 17-23.
4. Шушанов C.C., Марьина Л.Г., Черных Ю.Б. и др. Коэкспрессия мРНК генов систем IGF/инсулин и множественной лекарственной устойчивости у больных множественной миеломой // Клиническая Онкогематология. - 2010. - Т. 3, № 2. - C. 105-13.
5. Anderson С.К., Kyle R.A., Dalton W.S. et al. Multiple Myeloma: New Insights and Therapeutic Approaches // Hematology. - 2000. - 2000(1). - P. 147-65.
6. BasergaR., Rubin R. Cell cycle and growth control // Crit Rev Eukaryot Gene Expr. - 1993. - 3(1). - P. 4761.
7. Dean M. The Human ATP-Binding Cassette (ABC) Transporter Superfamily // Bookshelf ID: NBK3. -2002. - P. 1-50.
8. Frasca F., Pandini G., Scalia P. et al. Insulin receptor isoform A a newly recognized, high-affinity insulinlike growth factor II receptor in fetal and cancer cells // Mol Cell Biol. - 1999. - 19. - P. 3278-88.
9. Ge J., Chen Z., Wu S. et al. Expression Levels of Insulin-Like Growth Factor-1 and Multidrug Resistance-Associated Protein-1 Indicate Poor Prognosis in Patients with Gastric Cancer // Digestion. - 2009. - 80. - P. 48-158.
10. Guo Y.S., Jin G.F., Houston C.W. et al. Insulin-like growth factor-1 promotes multidrug resistance in MCLM colon cancer cells // J Cell Physiol. - 1998. - 175(2). - P. 141-8.
11. Hatok J., Racay P., Hudecek J. et al. Genes of multidrug resistance in haematological ignancies // Biologia, Bratislava. - 2006. - 61(3). - P. 247-56.
12. Hernandez-Sanchez C., Werner H., Roberts C.T. et al. Differential Regulation of Insulin-like Growth Fac-tor-I (IGF-I) Receptor Gene Expression by IGF-I and Basic Fibroblastic Growth Factor // JBC. - 1997. -272(8). - P. 4663-70.
13. Hideshima T., Bergsagel P.L., Kuehl W.M. et al. Advances in Biology of Multiple Myeloma: Clinical Applications // Blood. - 2004. - DOI 10.1182/blood. -2004.-01-0037. For personal use only.
14. Kalitin N., Kostjukova M., Kakpakova E. et al. Vascular endothelial growth factor 1 (VEGFR1) gene expression depends on immunophenotype of human multiple myeloma cells // Eur J Cancer. - 2011. - 47(1). -S644.
15. Leibiger B., Leibiger I.B., Moede T. et al. Selective insulin signaling through A and B insulin receptors regulates transcription of insulin and glucokinase genes in pancreatic b cells // Molecular Cell. - 2001. - 7. -P. 559-70.
16. Mitsiades C.S., Mitsiades N., Kung A.L. et al. The IGF/IGF-1R system is a major therapeutic target for multiple myeloma, other hematologic malignancies and solid tumors // Blood. - 2002. - P. 100-170a.
17. Sacco A., Morcavallo A., Pandini G. et al. Differential signaling activation by insulin and insulin-like growth factors I and II upon binding to insulin receptor isoform A // Endocrinology. - 2009. - 150(8). - P. 3594-602.
18. Samani A.A., Yakar S., LeRoith D. et al. The role of the IGF system in cancer growth and metastasis: Overview and recent insights // Endocrine Reviews. - 2007. - 28. - P. 20-47.
19. Schwarze C.P., Neu S., Beck J. et al. Influence of IGF-I and Cell Density on MDR1 Expression in the T-Lymphoblastoid Cell Line CCRF-CEM // Horm Res. - 1999. - 52. - P. 192-9.
20. Slaaby R., Schaffer L., Lautrup-Larsen I. et al. Hybrid receptors formed by insulin receptor (IR) and insulinlike growth factor I receptor (IGF-IR) have low insulin and high IGF-1 affinity irrespective of the IR splice variant // J Biol Chem. - 2006. - 281. - P. 25869-74.
21. Sonneveld P. Multidrug resistance in haematological malignancies // J. Int. Med. - 2000. - 247. - P. 521-34.
22. Soos M.A., Field C.E., Siddle K. et al. Purified hybrid insulin/insulin-like growth factor-I receptors bind insulin-like growth factor-I, but not insulin, with high affinity // Biochem J. - 1993. - 290. - P. 419-26.
Список сокращений
IGF-1 - insulin-like growth factor 1 (инсулиноподобный фактор роста 1-го типа)
MM - multiple myeloma
Pgp - белок Р-гликопротеина
МЛУ (MDR) - множественная лекарственная устойчивость (multidrug resistance)
ММ - множественная миелома
