CC BY
79
УДК 628.3
М. В. Мадякина, Е. О. Михайлова, М. В. Шулаев
ИДЕНТИФИКАЦИЯ АБОРИГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ -ДЕСТРУКТОРОВ УГЛЕВОДОРОДОВ ИЗ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ
Ключевые слова: нефтезагрязненная почва, аборигенные микроорганизмы, выделение микроорганизмов, нефтедеструкторы.
Проведены выделение и идентификации аборигенных микроорганизмов - деструкторов из нефтезагрязненных грунтов Самарской области. С помощью системы для идентификации MALDI Вю1урегбыли выделены микроорганизмы родов Pseudomonas, Bacillus, Raoultella, Enterobacter и Klebsiella.
Keywords: oil-contaminated soils, indigenous microorganisms isolated microorganisms, oil destructors.
The isolation and identification of indigenous microorganisms - the oil destructors for contaminated soils of the Samara region were made. Microorganisms genera Pseudomonas, Bacillus, Raoultella, Enterobacter and Klebsiella were determined by using MALDI Biotyper system.
Введение
Нефтяные загрязнения, полученные в результате добычи, транспортировки и переработки нефти и при других разливах, по токсичности и масштабам представляет собой общепланетарную опасность. Нефть и нефтепродукты вызывают отравление, гибель организмов и деградацию почв. Самоочищение природных объектов от нефтяного загрязнения -процессдлительный. Поэтому методы, основанные на разложении нефтепродуктов микроорганизмами - нефтедеструкторами, как аборигенными, так и вносимыми из вне специально в процессе очистки, обеспечивают требуемую степень деструкции нефти, являются наиболее перспективными так как не нарушают почвенных экосистем и позволяют сократить время восстановления почвы.
Выбор подходящего микроорганизма - нефтеде-структора должен проводиться с учетом определен-ныхтребований. Во-первых, внесение микроорга-низмовдолжно быть абсолютно безопаснымдля окружающей среды и человека. Во-вторых, скорость и полнота разложения ксенобиотика должна превосходить аналогичные показатели микроорганизмов, обитающих на участке, подлежащем восстановлению. В-третьих, вносимые микроорганизмы должны быть устойчивыми к неблагоприятным факторам среды.
Среди микроорганизмов, потенциально пригодных для создания на их основе биопрепаратов для очистки почв от углеводородных загрязнений, описаны Pseudomonasputida и Pseudomonassp., представители родов Rhodococcus и Xanthomonas, способные к деструкции такого труднодоступного субстрата, как мазут, Acinetobacter и Mycobacterium, подвергающие деструкции широкий спектр углеводородов. Кроме того, наиболее эффективными штаммами-деструкторами являются бактерии, содержащие плазмидыбиодеградации [1].
Целью настоящей работы явились выделение и идентификация микроорганизмов- деструкторов из нефтезагрязненных грунтов.
Материалы и методы
В качестве объектов исследования выступали непереработанный нефтезагрязненный грунт с высоким содержанием загрязнителя (более 15%) с тер-
ритории ранее использованной под объекты ЛПДС-2 АРНУ, ОАО «СЗМН»; непереработанный нефте-загрязненнный грунт с высоким содержанием загрязнителя (более 15%) с территории полигона по обезвреживанию нефтешламов ООО «РН-Сервис-Экология» (Самарская обл.); непереработанный нефтезагрязненный грунт со средним содержанием загрязнителя (3 - 5%) с территории Новокуйбышевского НПЗ (Самарская обл.); активный ил биохимической очистки с Новокуйбышевского НПЗ (Самарская обл.).
Каждый образец грунта из присланного материала был рассыпан на горизонтальную поверхность слоем высотой 5 см, пробы для приготовления суспензии брались по принципу конверта (ГОСТ 17.4.3.01-83)[2].
Почвенные образцы анализировали в первые сутки. Для придания образцу большей однородности, соблюдая все условия асептики, тщательно перемешивали почву, вынимали корни растений, различные включения, измельчали образец.
На стерильное часовое стекло стерильным шпателем (или алюминиевой ложкой) помещали по 10 г почвы. Чтобы при взвешивании в почву не попали микроорганизмы из воздуха, особенно споры грибов, часовое стекло накрывали, шпатели и ложки стерилизовалифламбированием.
Навеска почвы переносилась в колбу на 250 мл со 100 мл стерильной водопроводной воды, взбалтывалась 10 мин на механической качалке, после чего частицы почвы в ходе отстаивания отделялись от раствора.
Перед приготовлением суспензии для каждого образца готовились 2 стерильные колбы на 250 мл; одна содержала 100 мл стерильной водопроводной воды, другая — пустая. Водой из первой колбы растертая почвенная масса смывалась в пустую стерильную колбу. Колба с полученной суспензией встряхивалась 5 мин, оставлялась на 30 минут [3].
Из полученной суспензии делался посев на двеплотныепитательныесреды.
1. Минеральная среда следующего состава: КШз, К^Р04, №2НР04, МаНР04, MgSO4x7H2O, агар.
2. LB-агар.
В качестве единственного источника углерода добавлялось 2 мл керосина.
Все образцы проверялись на установке BrukerDaltonik MALDI Biotyper для определения рода и вида микроорганизмов. MALDI Biotyper идентифицирует микроорганизмы с помощью MALDI-TOF (Matrix лазерной десорбции ионизации-времени пролета) Для идентификации МО используется колония после первичного посева. При прямой идентификации колония наносится на многоразовую металлическую мишень, покрывается матричным раствором и после высыхания производится идентификация микроорганизма в масс-спектрометре по спектрам рибосомальных белков. Биоинформационное программное обеспечение прибора позволяет надёжно и точно проводить идентификацию любых микроорганизмов до видового уровня путём сопоставления получаемых масс-спектров бактерий с обширной базой данных [4].
При анализе бактериологического материала использовался грубый лизис бактерий в растворе 50 % ацетонитрила, 2,5 % трифторуксусной кислоты и применением а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве MALDI матрицы.
Экспериментальная часть
Из 41 колоний было отобрано 15 видов нефтеде-структоров.
Из серии образцов непереработанного нефтеза-грязненнного грунта с высоким содержанием загрязнителя (более 15%) с территории ранее использованной под объекты ЛПДС-2 АРНУ, ОАО «СЗМН» на минеральной среде были выделены и идентифицированы следующие микроорганизмы: Pseudomonaschlororaphis, Pseudom-
onasbrassicacearum, Pseudomonasthivervalensis, Pseudomonaskilonensis. На среде LB-агар: Pseudomo-naskoreensis, Pseudomonascorrugate, Bacillussubtilis, Pseudomonasbrassicacearum, Pseudomonasvancou-verensis.
Из образцов непереработанного нефтезагрязнен-ного грунта с высоким содержанием загрязнителя (более 15%) с территории полигона по обезвреживанию нефтешламов ООО «РН-Сервис-Экология» (Самарская обл.) на минеральной среде были определены: Bacillusmegaterium, Pseudomonasbras-sicacearum, Pseudomonaskilonensis. На LB-агаре: Pseudomonasbrassicacearum, Pseudomonasthiverva-lensis, Bacillussubtilis, Bacilluscereus.
В опытах с непереработанным нефтезагрязнен-ным грунтом со средним содержанием загрязнителя (3-5%) с территории Новокуйбышевского НПЗ (Самарская обл.) на минеральной среде были выделены и определены: Raoultellaornithinolytica,
Bacillusmegaterium, Enterobactercloacae. НасредеLB-агар: Raoultellaornithinolytica, Raoultellaplanticola, Bacilluscereus, Klebsiellaoxytoca.
В образцах активного ила биохимической очистки с Новокуйбышевского НПЗ (Самарская обл.) были получены на минеральной среде такие микроорганизмы как: Enterobacterkobei, Pseudomonasbrassi-cacearum, Pseudomonaskilonensi. На среде LB-агар были выделены: Bacillusmegaterium, Enterobacter-
cloacae, Enterobacterkobei, Bacilluscereus, Bacillussubtilis, Pseudomonasbrassicacearum, Pseudomonaschlororaphis.
Полученные результаты свидетельствуют, что видовое разнообразие характерно для нефтезагряз-ненных почв. Pseudomonas - грамотрицательные аэробные не спорообразующие почвенные бактерии, некоторые виды - патогены бактерий и человека, благодаря способности разлагать различные химические соединения (полициклические ароматические углеводороды, толуол и т.д.) [5, 6] являются наиболее перспективными в качестве компонентов биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв [7]. Бактерии рода Bacillus - аэробные грамположи-тельные палочки, образующие внутриклеточные споры, используются в качестве главного объекта генной инженерии как продуценты разнообразных целевых продуктов [8]. Являясь почвенными сапро-фитами, нетребовательными к питательным средам также представляют интерес как потенциальные деструкторы нефтии и находят применение в препаратах для очистки нефтешлама от нефти и нефтепродуктов [9, 10]. Кроме того, среди обнаруженных микроорганизмов широко представлены бактерии семейства Enterobacteriaceae. Enterobacter - грамот-рицательные палочковидные бактерии, факультативные анаэробы, широко распространенные в природе встречаются в пресной воде, почве, сточных водах. Род Klebsiella представлен грамотрицатель-ными условно патогенными палочками, растущими на простых питательных средах; наличие капсулы делает их весьма устойчивыми к воздействию окружающей среды [11]. Raoultella - род грамотрица-тельных факультативно-анаэробных палочковидных бактерий также имеющих капсулу. Таким образом, дальнейшее изучение жизнедеятельности как отдельных видов микроорганизмов, так и их консорциума, может способствовать созданию новых препаратов для утилизациинефтепродуктоввпочве.
Работа выполнена на базе Междисциплинарного ЦКП КФУ для обеспечения клеточных, геномных и постгеномных исследований в Приволжском регионе.
Литература
1. А.Б. Гафаров, Биотехнология, 6, 80-85 (2008)
2. ГОСТ 17.4.4.02-84 Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа. - Введ. 198412-19
3. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для вузов / Е. 3. Теппер. В. К. Шильникова, Г. И. Переверзе-ва; Под ред. В. К. Шильни-ковой. - 5-е изд., перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2004. - 256 е.: ил
4. BrucerCorporatiion MALDI Biotyper системы [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.bruker.com/products/mass-spectrometry-and-separations/maldi-biotyper/overview.html
5. Yen KM; Karl MR; Blatt LM; Simon, MJ; et al.., J. Bacte-riol, 173, 17, 5315-27(1991).
6. M.M. O'Mahony; A.D. Dobson; J.D. Barnes; I.Singleton,Chemosphere,63 (2), 307-314 (2006).
7. Современные методы переработки нефтешламов / Г.Г.
Ягафарова, С.В. Леонтьева, А.Х. Сафарова, И.Р. Ягафа-ров. - М.: Химия, 2010. - 190 с.
8. TumbullP.C.B.. BaronS.; etal., eds. Bacillus. In: Bar-ron'sMedicalMicrobiology (4thed.). UnivofTexasMedi-calBranch. 1996.
9. Патент РФ № 2077397 от 20.04.1997. Способ рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.
© М. В. Мадякина, аспирант кафедры химической кибернетики КНИТУ, [email protected], Е. О. Михайлова, к.б.н., доцент кафедры бизнес-статистики и математических методов в экономике КНИТУ, [email protected]; М. В. Шулаев, д-р.техн. наук, профессор кафедры химической кибернетики КНИТУ, [email protected].
© M. V. Madyakina, postgraduate student of the Department of chemical Cybernetics, KNRTU, [email protected]; E. O. Mikhailova, PhD, associate professor of business statistics and mathematical methods in Economics, [email protected]; M. V. Shulaev, Doctor of technical sciences (Full Professor), Professor of the Department of chemical Cybernetics, KNRTU, [email protected].
10. Патент РФ № 2297290 от 04.10.2005. Способ рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами.
11. List of prokaryotic names with standing in nomenclature [Электронныйресурс]. - Режимдоступа: http ://www.bacterio .net/klebsiella.html
