CC BY
79
УДК 502.521
Г. Г. Ягафарова, С. В. Леонтьева, А. Х. Сафаров, Ю. А. Федорова, Э. М. Зайнутдинова
ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССА АКТИВАЦИИ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ
ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ ЭКОТОКСИКАНТОВ
Ключевые слова: очистка почвы, биостимулятор, нефтеокисляющие микроорганизмы.
Исследованы биостимуляторы роста нефтеокисляющих микроорганизмов: гуминовый препарат, органический отход птицефабрик (куриный помет), спиртовая барда, водный экстракт из избыточных активных илов биологических очистных сооружений нефтехимических предприятий. Установлено, что наиболее эффективным стимулятором роста нефтеокисляющих аборигенных микроорганизмов является гуминовый препарат «Гумиком». Консорциумы, активизированные на модифицированных питательных средах, обладают высокой деструктивной способностью относительно специфических загрязнителей.
Keywords: clean soil, biostimulator, oil-oxidizing microorganisms.
Biogrowth factors of the oil-oxidizing microorganisms are investigated: humic preparation, organic withdrawal of poultry farms (a chicken dung), spirit the bard, water extract from excess active Ils of biological treatment facilities of the petrochemical enterprises. It is established what the most effective growth factor of the oil-oxidizing native microorganisms is humic preparation "Gumikom". The consortia which are made active on the modified nutrient mediums possess high destructive ability of rather specific pollutants.
Введение
Загрязнению объектов окружающей среды экот-ксикантами уделено большое внимание. Наибольший интерес представляет проблема разработки эффективных и экологически безвредных методов защиты окружающей среды от загрязнений такими экотокси-кантами, как нефть и нефтепродукты, в том числе тяжелые нефти. Наиболее перспективными среди таких методов представляются биотехнологические методы с использованием высокоэффективных штаммов-деструкторов различных экотоксикантов [1]. В настоящее время на основе таких микроорганизмов разработаны и широко применяются биопрепараты для очистки объектов окружающей среды от органических загрязнений, и, в первую очередь, от нефти и нефтепродуктов. Однако, стоимость такой очистки довольно высока. В связи с этим, разработка методов активации аборигенной микрофлоры остаётся чрезвычайно актуальной. Известно, что в почве и грунте, особенно загрязненной нефтью и нефтепродуктами, содержатся аэробные штаммы, способные биотранс-формировать нефть и нефтепродукты. Среди них часто встречаются микроорганизмы родов Arthrobacter, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus и др. [2, 3]. Несмотря на большое разнообразие существующих биостимуляторов, большинство из них не нашло широкого распространения, вследствие их дороговизны и низкой эффективности.
Целью данной работы явилось исследование процессов активации аборигенной микрофлоры для очистки объектов окружающей среды от экотоксикантов.
С этой целью были исследованы биостимуляторы роста нефтеокисляющих микроорганизмов: гумино-содержащий препарат «Гумиком», органический отход птицефабрик (куриный помет), спиртовая барда, водный органический экстракт, выделенный из избыточных активных илов биологических очистных сооружений нефтехимических предприятий.
Препарат «Гумиком» производится путем обработки бурого угля водными щелочными растворами и представляет собой раствор, который содержит в себе: гумат калия 4,0-6,0 %; калий 0,3-0,5 %; фосфор 0,1-0,3 %; азот 0,1-0,3 %; микроэлементы (Cu, B, Mo, Zn, Mn, Fe, Se). Гумино-минеральный комплекс «Гумиком» - органоминеральное удобрение, стимулятор роста, активизирует почвенную микрофлору, улучшает растворимость минералов посредством стимуляции корневой системы растений, стимулирует биоремедиацию нефтезагрязненных почв [4].
Жидкая спиртовая барда является отходом спиртового производства. Обладает высокой питательной ценностью. Она имеет в достаточном количестве легко растворимые азотистые соединения и полезные вещества: протеин (20-22 %), жир (5-7 %), клетчатка (13-18 %), зола (7-8 %), комплекс микроэлементов (кобальт, марганец, ванадий, железо и др.) [5].
В состав органического отхода птицефабрик входит такие элементы, как азот, фосфор и калий (1,6, 1,7 и 0,9 %, соответственно). Помимо макроэлементов содержатся микроэлементы (15-38 мг Mn, 12-39 Zn, 1-1,2 1-2,5 ^ и 300-400 мг Fe в пересчете на 100 г сухого птичьего помета), а также сырой протеин, аминокислоты, клетчатка, безазотистые экстрактивные вещества, сырой жир и зола [6].
Водный экстракт из избыточных активных илов получают выделением органического вещества ила путем его щелочной экстракции, с последующим до-окислением реагентом-окислителем и нейтрализацией получаемого раствора до рН = 5,5-7,5. Биостимулятор представляет собой гуминовые вещества и другие биогенные макро- и микроэлементы [7].
Экспериментальная часть
Исследование биостимулирующей способности проводили в полной минеральной среде Маккланга, г/л дистиллированной воды: NaNO3 - 2,0; K2HPO4 -1,0; MnSO4 - 0,013; MgSO4•7H2O - 0,5; ZnSO4 -0,002; Fe2(SO4)3 - 0,001; рН - 6,7-7,0 [8]. В качестве
единственного источника углерода и энергии использовали гексадекан в количестве 1 % масс. Для активации консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов, образцы нефтезагрязненного грунта в количестве 1 % масс. переносили в колбу со стерильной питательной средой. В качестве стимулятора добавляли:
1) «Гумиком» (0,01 % масс.)
2) спиртовую барду (5 % масс.)
3) органический отход птицефабрик (2 % масс.)
4) водный экстракт из избыточных активных илов (5 % масс.)
Контролем служил образец с минеральной средой, гексадеканом и микроорганизмами, но без стимуляторов. Культивирование проводили в течение трех суток на термостатированной качалке при 300С. Об активирующей способности биостимуляторов судили по приросту гетеротрофных микроорганизмов, которые определяли чашечным методом Коха [8].
Результаты исследований представлены в табл. 1.
Таблица 1 - Влияние биостимуляторов на рост аборигенных гетеротрофных микроорганизмов
На протяжении всего эксперимента наблюдался прирост количества гетеротрофных микроорганизмов наблюдался при добавлении биостимулятора «Гумиком» и через 72 часа составил 1,256x10е. Прирост микроорганизмов в контрольном образце не превышал 5,4х105.
Таким образом, гуминосодержащий препарат «Гумиком» является наиболее эффективным стимулятором роста нефтеокисляющих аборигенных микроорганизмов, поэтому дальнейшие исследования проводились с ним.
Согласно разработанному ранее способу [9], активированная аборигенная микрофлора может быть использована для очистки нефтезагрязненных почв. Однако, в случае нефтезасоленных загрязнений или наличие таких загрязнителей как тяжелая и битуминозная нефть, данный способ не был достаточно эффективен. По-видимому, это связано с тем, что активация консорциумов проводилась на типовой минеральной среде.
Свойства активной деградации экотоксикантов, в том числе нефти и нефтепродуктов у микроорганизмов, вероятно, обусловливаются наличием у определенных штаммов специфичных плазмидных ДНК [10].
Плазмиды могут определять вирулентность бактерий, например, способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода [1].
Среди признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:
1) устойчивость к антибиотикам;
2) образование колицинов;
3) продукция факторов патогенности;
4) способность к синтезу антибиотических веществ;
5) расщепление сложных органических веществ;
6) образование ферментов рестрикции и модификации.
Так, в углеводородокисляющих штаммах Rhodococcus erythropolis AC-1339Д, Pseudomonas putida ВКМ1301 методом электрофоретического анализа выявлено наличие плазмидной ДНК размером 20 т.п.н. [2].
Получены штаммы микроорганизмов, относящиеся к родам Acinetobacter и Mycobacterium, подвергающие деструкции широкий спектр нормальных углеводородов. В ходе исследования генетического детерминирования признака деградации минерального масла у наиболее активного штамма-деструктора Acinetobacter calcoaceticus TM-31 удалось обнаружить наличие двух типов плазмид размером 9,4 т. п. н. [11].
У бактерий, относящихся к роду Pseudomonas, имеются оксиредуктазы или гидроксилазы, способные разлагать большое число молекул углеводородов и ароматических соединений. В случае некоторых штаммов Pseudomonas putida гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе плазмид. Известны четыре такие плазмиды: ОСТ (разложение октана, гексана и декана), XYL (разложение ксилола, толуола), CAM (разложение камфоры), NAH (разложение нафталина) [10].
Учитывая вышесказанное, было выдвинуто предположение, что для сохранения активности аборигенных штаммов относительно конкретного экотокси-канта, который в течение длительного времени был использован в качестве источника углерода и энергии, необходима корректировка состава питательной среды, чтобы гены не теряли свою активность.
С целью изучения процесса активации аборигенных консорциумов на модернизированных питательных средах, была поставлена следующая серия опытов:
1. Среда Маккланга+«Гумиком»+ гексадекан (1% масс.)+ NaCl (5% масс.)+1г нефтезасоленной почвы.
2. Среда Маккланга+ «Гумиком»+ газойлевая фракция (1% масс.)+1г почвы, загрязненной тяжелой нефтью.
3. Среда Маккланга+ «Гумиком»+ гексадекан (1% масс.)+нефтезагрязненная почва.
После 3 суток культивирования на термостатированной качалке при 30 0С были получены суспензии активированных аборигенных микроорганизмов. Ими обработали почвы с соответствующими загрязнителями согласно способу [11]. Для сравнения образцы почв обработали суспензиями активированных аборигенных микроорганизмов, полученными в результате выращивания на типовых средах. Контролем служили
Используемый биостимулятор Количество гетеротрофных микроорганизмов, х103 Кл/мл среды
Нач. 24 48 72
часа часов часа
Гумиком 15,8 189,8 987,4 1256,8
Спиртовая барда 15,5 126,8 529,3 998,2
Органический отход птицефаб- 14,9 154,9 622,7 845,7
рик
Водный экстракт из избыточных 16,1 89,7 550,4 780,3
активных илов
Контроль 15,6 42,8 120,8 540,2
образцы почв без интродукции аборигенных микроорганизмов
Об эффективности аборигенов судили по степени очитки почв от нефти, а также косвенно по приросту гетеротрофных микроорганизмов.
Результаты исследований представлены на рис. 1.
Рис. 1 - Эффективность очистки почв от нефти аборигенными нефтеокисляющими микроорганизмами
Как видно из рисунка 1, консорциумы, активизированные на модифицированных питательных средах, обладают значительно высокой деструктивной способностью относительно специфических загрязнителей. Так степень очистки для нефтезасоленных почв составила 83 %, в то время как степень очистки кон-социумом аборигенов, активированный на типовой среде, не превышала 45 %. В опытах с почвой, загрязненной тяжелой нефтью, названные показатели составили 65 % и 29 %, соответственно.
Полученные результаты свидетельствуют, что трудноразлагаемые загрязнители окружающей среды, такие как тяжелая нефть и нефтезасоленные почвы в условиях высокой минерализации способны деструк-тировать только специфичные микроорганизмы, у
которых, по мнению авторов, ген закодирован в плаз-мидах.
Таким образом, для очистки почв, загрязненных специфическими загрязнителями необходима корректировка питательных сред для активации микроорганизмов-деструкторов: для активации галофильных микроорганизмов рекомендуется введение в состав питательной среды ЫаО!, для сохранения активности штаммов относительно высокоминерализованных загрязнителей. В случае загрязнения тяжелой нефтью необходима модификация источника углерода и энергии - например, газойлевая фракция.
Литература
1. Г.Г. Ягафарова, С.В. Леонтьева, Ю.А. Федорова, А.Х. Сафаров, Микробная трансформация экотоксикантов, Уфа, 2015.
2. В.В. Жилова, И.Г. Мигранова, Материалы 58-я научно-технической конференция студентов, аспирантов и молодых ученых, 2005. С. 64.
3. Г.Г. Хайруллина, Э.М. Зайнутдинова, Материалы 63-я научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ, 2012. - С. 61.
4. Ю.А. Федорова, Н.Н. Чиглинцева, Г.Г. Ягафарова, Д.И. Ягафарова, А.Х. Сафаров, Вестник ПНИПУ. Прикладная экология. Урбанистика, 3 (19), 60-68 (2015).
5. М.В. Головцов, Г.Г. Ягафарова, С.В. Леонтьева, И.Р. Ягафаров, Я.И. Гросберг, Башкирский химический журнал, 14, 5, 48-50 (2007).
6. А.Х. Сафаров, Е.Н. Пушкарь, В сборнике: Научное и экологическое обеспечение современных технологий III Всероссийская конференция молодых ученых, 2016. С. 48.
7. Л.Р. Акчурина, Ю.А. Федорова, А.Х. Сафаров, Г.Г. Ягафарова, Нефтегазовое дело, 11, 3, 123-127 (2013).
8. Н.С. Егоров, Руководство к практическим занятиям по микробиологии, МГУ, М., 1995. 224с.
9. Патент РФ 2352630 (2007).
10. Г.Г. Ягафарова, Автореферат ... д.т.н., Санкт-Петербург, 1994.
11. Г.Г. Ягафарова, С.В. Леонтьева, Я.И. Гросберг, А.Х. Сафаров, И.Р. Ягафаров, Экология и промышленность России, 12, 20-21 (2010).
© Г. Г. Ягафарова - д.т.н., профессор, заведующая кафедрой прикладной экологии, «Уфимский государственный нефтяной технический университет», [email protected]; С.В. Леонтьева - к.т.н., доцент кафедры прикладной экологии того же вуза; А.Х. Сафаров - к.т.н., доцент кафедры прикладной экологии того же вуза; Ю.А. Федорова - к.т.н., доцент кафедры прикладной экологии того же вуза; Э. М. Зайнутдинова - к.б.н., доцент кафедры прикладной экологии того же вуза.
© G. G. Yagafarova - Ph.D., professor, Head of Applied Ecology Department, Ufa State Oil Technical University, [email protected]; S. V. Leonteva - Ph.D., assistant professor of Applied Ecology Department of the same University; A. Kh. Safarov - Ph.D., assistant professor of Applied Ecology Department of the same University; Yu.A. Fedorova - Ph.D., assistant professor of Applied Ecology Department of the same University; E. M. Zainutdinova - Ph..D., assistant professor of Applied Ecology Department of the same University.
Все статьи номера поступили в редакцию журнала в период с 01.05.16. по 05.06.16.
