CC BY
75
УДК 579.233/234+577.114
ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛИПОПОЛИСАХАРИД-БЕЛКОВЫХ КОМПЛЕКСОВ КАПСУЛЫ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUMBRASILENSE БР80 И Бр245 ПРИ РОСТЕ НА АГАРИЗОВАННОЙ СРЕДЕ
Я. В. Халэпа1, С. С. Евстигнеева2, Е. Н. Сигида2, Ю. П. Федоненко2, С. А. Коннова12, В. В. Игнатов2
Саратовский государственный университет 2Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов E-mail: [email protected]
Проведено сравнительное исследование структурных особенностей липополисахарид-белковых комплексов (ЛПБК) из капсульного материала бактерий Azospirillum brasiiense SR80 и Sp245, выращенных в жидкой и агаризованной питательных средах. Анализ данных ГЖХ и ЯМР-спектроскопии выявил отличия структуры липидной и полисахаридной составляющих ЛПБК исследуемых бактерий, в зависимости от условий их культивирования. Отличительной особенностью ЛПБК обоих штаммов, рост которых осуществлялся на плотной среде, являлось наличие ундекановой кислоты и дополнительного полисахарида галактановой природы.
Ключевые слова: Azospirillum brasiiense, капсульный полисахарид, агаризованная питательная среда.
Characterization of the Structural Features of the Capsular Lipopolysaccharide-Protein Complexes of Bacteria Azospirillum brasilense SR80 and Sp245 at Growth on Agaric Medium
Ya. V. Khalepa, S. S. Yevstigneeva, Е. N. Sigida, Yu. P. Fedonenko, S. А. Konnova, V. V. Ignatov
We performed comparisonal studies of the structure of lipopolysac-charide-protein complexes (LPPCs) from Azospirillum brasilense SR80 and Sp245, which were cultivated in liquid and agaric nutrient media. Analysis of GLC and NMR spectroscopy data demonstrated differences between lipid and polysaccharide components of the LPPCs of bacteria under study, depending on the cultivation conditions. The presence of undecanoic acid and additional galactan polysaccharide was shown to be the characteristic feature of the LPPCs of the both strains, cultivated on agaric medium. Key words: Azospirillum brasilense, capsular polysaccharide, agaric nutrient medium.
Многообразие защитных реакций почвенных бактерий, возникающих при стрессовых воздействиях, позволяет им приспосабливаться к меняющимся условиям среды обитания [1]. В качестве одного из адаптационных механизмов устойчивости к неблагоприятным факторам выступают изменения компонентов поверхности бактериальных клеток, которые участвуют во взаимодействии с различными объектами сре-
ды, в том числе с растительными организмами при формировании симбиозов. Такая стратегия переживания стрессовых условий характерна для грамотрицательных бактерий рода Лю^ърггШыш, способных активно влиять на развитие и рост многих растений, в том числе злаковых культур [2, 3]. Показано, что у азоспирилл в ответ на изменения температуры, значений рН, концентрации хлорида натрия, природы источников углерода и азота и т.д. наблюдаются модификации состава, свойств и структур гликополимеров поверхности: экзополисахаридов (ЭПС), капсульных полисахаридов (КПС) и липополисахаридов (ЛПС) внешней мембраны [4, 5].
Условия среды непосредственно влияют на формирование и эффективность растительно-микробных взаимодействий, поэтому изучение защитных реакций азоспирилл в ответ на стрессовые воздействия на молекулярном уровне поможет оптимизировать использование биологических удобрений как альтернативу химическим.
Ранее на примере бактерий Л. brasilense БЯ80 было показано, что увеличение продолжительности выращивания до пяти суток, соответствующих стационарной фазе роста, в жидкой питательной среде не сопровождалось изменениями в структуре высокомолекулярной фракции КПС - липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК). В то же время выращивание данной культуры на агаризованной среде вызывало повышение содержания галактозы в моно-сахаридном составе ЛПБК [6]. Наличие сведений о сходстве адаптивных реакций азоспирилл в ответ на неблагоприятные воздействия окружающей среды [7, 8] подтверждают актуальность дальнейших исследований отмеченных ранее изменений капсульных гликополимеров. В связи с этим целью нашего исследования являлась
© Халэпа Я. В., Евстигнеева С. С., Сигида Е. Н., Федоненко Ю. П., Коннова С. А., Игнатов В. В., 2014
Я. В. Халэпа и др. Характеристика структурных особенностей
сравнительная характеристика структурных изменений ЛПБК бактерий A. brasilense SR80 и Sp245 при переходе от планктонной формы существования в иммобилизованную на поверхности агаризованной среды.
Материалы и методы
В работе были использованы бактерии A. brasilense SR80 и Sp245, любезно предоставленные коллекцией ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (г. Саратов). Исследуемые культуры выращивали в жидкой синтетической питательной среде [9] до окончания экспоненциальной фазы роста, а также на поверхности 2%-ной агаризованной среды при 30°С в течение 72 ч (стационарная фаза роста). С поверхности клеток удаляли капсулу отмыванием 0.15 M NaCl с 0.02%-ным NaN3 при механическом перемешивании на протяжении шести суток с ежедневной заменой отмывающего раствора [10]. Капсуль-ный материал, собранный в течение первых двух дней отмывания клеток, концентрировали, диализовали, центрифугировали при 13000xg и лиофилизировали. Фракционирование КПС осуществляли гель-фильтрацией на колонке с носителем Sepharose CL-4B (45 х 1.8 см, V0 = = 35 мл) с 0.025 M бикарбонатаммонийным буфером (рН 8.3) в качестве элюента и собирали фракции, соответствующие ЛПБК.
Деградацию ЛПБК выполняли 2%-ной уксусной кислотой при 100°С в течение 1.5 ч. Для отделения нерастворимых в воде липидов А гидролизаты центрифугировали при 13000xg. Водорастворимые фракции разделяли гель-проникающей хроматографией на колонках с носителем Sephadex G-50 (46 х 1.6 см, V0 = = 35 мл) с 0.025 М пиридин-ацетатным буфером (рН 4.5) в качестве элюента. Поглощение продуктов реакции элюата с фенолом и серной кислотой определяли спектрофотометрически при X = 490 нм на приборе Specord 40 (Analytik Jena AG, Германия).
Биополимерный состав гликополимеров капсулы устанавливали с использованием традиционных колориметрических методов, описанных в работе [9]. Измерения оптической плотности продуктов реакций проводили на спектрофотометре Specord 40 (Analytik Jena AG, Германия).
Анализ моносахаридного состава осуществляли методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ) ацетатов полиолов [11] на хроматографе GC-2010 (Shimadzu, Япония), снабжённом капиллярной колонкой DB-5 (Hewlett-Packard, США), в
градиенте температур от 160°С (1 мин) до 290°С со скоростью нагрева 7°С/мин.
Состав и соотношение жирных кислот ли-пидов А в виде их метиловых эфиров (МЭЖК) определяли ГЖХ с использованием хроматографа GC-2010 (Shimadzu, Япония), снабжённого капиллярной колонкой EQUTY-1 в градиенте температур от 130 до 250°С со скоростью нагрева 4°С/мин. Метилирование жирных кислот осуществляли согласно [12].
Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли в 96-луночных полисти-рольных планшетах (Медполимер, Россия). По 50 мкл последовательных двукратных разведений образцов (в 0.15 М фосфатно-солевом буфере, pH 7.2) вносили в лунки планшетов. В эксперименте применяли поликлональные кроличьи анти-ЛПС антитела и козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США). В качестве субстратного реагента использовали перекись водорода с о-фенилендиамином. Измерения оптического поглощения исследуемых проб проводили на им-муноферментном анализаторе Multiscan Ascent при X = 492 нм (Thermo scientific, Финляндия).
Спектры ЯМР снимали на спектрометре Avance II 600 (Bruker, Германия) в 99.96%-ной D2O при 27°С. В качестве внутреннего стандарта использовали ацетон. Образцы предварительно лиофилизировали дважды из 99.9%-ной D2O.
Результаты и их обсуждение
Бактерии A. brasilense SR80 были выделены с поверхности проростков пшеницы Triticum aes-tivum L., произраставшей в Саратовской области
[13]. Культура A. brasilense Sp245, которая была изолирована с поверхностно стерилизованных корней пшеницы, произраставшей в Бразилии
[14], является эндофитом, колонизирующим внутренние ткани корней растения-хозяина. Сравнение защитных реакций бактерий р. Azospi-rillum, различающихся по способности заселять поверхность или внутренние ткани растительных организмов, важно для понимания механизма их адаптации к различным стрессовым воздействиям.
В ходе очистки и фракционирования КПС получены ЛПБК A. brasilense SR80 и Sp245
ПЛанктонных (лпб^К80 (пл) и ЛПБ^245 (пл)
)
и иммобилизированных (ЛПБК^80 (им) и ЛПБК8р245 (им)) культур соответственно, выходы которых варьировали от 45 до 47%. В составе исследуемых гликополимеров были идентифицированы углеводы (29-88%), белки (до 3%),
Химия
51
2-кето-3-дезоксиоктоновая кислота (0.6-1.8%), остатки фосфорной (до 1.5%) и характерных для азоспирилл жирных кислот: 3-гидрокси-тетрадекановой, 3-гидроксигексадекановой и октадеценовой. Также в составе жирных кислот
ЛПБ^80 (им) и ЛПБ^р245 (им) впервые бьша
обнаружена ундекановая (Сп^) кислота (16-23% от суммы идентифицированных МЭЖК). Ранее СП0 была выявлена как минорный компонент в составе липидов А ЛПС фитопатогенных бактерий Xanthomonas ЪоМогит pv. уШат [15], а также Selenomonas sputigena, являющегося возбудителем периодонтита [16].
Углеводные составляющие исследуемых гликополимеров, полученные после мягкого кислотного гидролиза, разделяли гель-фильтрацией и собирали фракции, соответствующие полисахаридам (ПС), выходы которых варьировали от 28 до 36%.
Результаты исследования моносахаридного состава методом ГЖХ показали, что ПСsp245 (пл) состоял из рамнозы с примесью галактозы, а в ПСsp245 (им) было выявлено наличие рамнозы и галактозы в соотношении —1:1.6. Аналогичные изменения были обнаружены в составе
ПС
): соотношение рамнозы, фукозы,
^80 (им)'
ксилозы, галактозы и галактозамина составляло —1:4:1:12:1.5, что по содержанию галактозы в три раза выше по сравнению с ПСsR80 (пл).
Предварительные исследования, проведённые методом спектроскопии ЯМР, показали, что в спектрах 1Н-ЯМР ПС(им) обоих штаммов присутствуют дополнительные сигналы, помимо тех, что характерны для ПС(пл) (рис. 1). Учитывая преобладание в моносахаридном составе ЛПБ^80 (им) и ЛПБ^р245 (им) галактозы:
можно предположить, что новый ПС по своей химической природе представлен галактаном.
А. brasilense SR80
А. brasilense Sp245
^_
I
Н 10 до
в
¿.А щ п
и ' и и 10 и 13
Рис. 1. 1Н-ЯМР спектры полисахаридов, выделенных из ЛПБК бактерий А. brasilense SR80 и Бр245 при планктонном
(а, в) и иммобилизированном (б, г) культивировании
б
а
г
Тестирование антигенных свойств методом
ИФА показало взаимодействие как ЛПБК так и ЛПБК
(им)
\пл) бактерий А. brasilense SR80 и Sp245 с полученными нами ранее гомологичными антителами к препаратам ЛПС этих культур (рис. 2). Этот факт, очевидно, свидетельствует о присутствии в препаратах общих антигенных
детерминант, что не исключает возможности появления в них и других антигенов. Из результатов ИФА следует увеличение интенсивности такого взаимодействия гомологичных антител с ЛПБК(им) обеих культур, по сравнению с ЛПБК(пл). Возможно, обнаруженный в ЛПБК(им) галактан способствует презентированию из-
52
Научный отдел
Я. В. Халэпа и др. Характеристика структурных особенностей
D
1 -
0,8 -0,6 -0,4 -0,2 -0
492
№ лунки планшета а
-■А- I
II
9 10 11
1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
D
492
III
IV
1 2 3 4 5 6 7!
№ лунки планшета
б
—I-1-1
9 10 11
Рис. 2. Иммуноферментный анализ ЛПБК бактерийA. brasilense SR80 (а) и Sp245 (б), выращенных в жидкой (I, III) и
твёрдой (II, IV) средах, с анти-ЛПС антителами
вестных антигенных детерминант либо несёт дополнительные детерминанты, узнаваемые поликлональными антителами.
При использовании агаризованных сред для выращивания бактерий имеет место гипотетическая возможность попадания агарозы во фракции исследуемых гликополимеров при смыве культуры с поверхности среды. Поскольку одним из неотъемлемых компонентов агарозы является кислотолабильный сахар 3,6-ангидрогалактоза, наличие примесей в исследуемых нами препаратах ПС, получаемых в результате кислотного гидролиза, предполагается маловероятным.
На основании полученных результатов можно сделать вывод, что культивирование азоспирилл на плотной среде сопровождается продукцией нового гликополимера в составе капсулы. Так как этот полимер имеет галак-тановую природу, не исключено, что таким образом бактерии реагируют на смену условий существования, защищаясь как от избыточного количества кислорода, так и от других факторов среды. Выращивание бактерий A. lipoferum Бр59Ь в присутствии флавоноида кверцетина (стрессовые условия) также сопровождалось накоплением галактозы в составе образца КПС, помимо рамнозы и глюкозы [7]. Подобные изменения в структуре ЭПС A. brasilense Cd были показаны при культивировании бактерий в условиях солевого стресса. В моносахарид-ном составе ЭПС идентифицирована галактоза (~90%) и следовые количества других сахаров (глюкозы, маннозы, ксилозы, фукозы, рамнозы и арабинозы) [8]. Бактерии A. brasilense имеют два гена, кодирующих синтез фермента
УДФ-глюкоза-4-эпимеразы, который осуществляет внутримолекулярные превращения УДФ -глюкозы в УДФ-галактозу и наоборот. В ответ на стрессовые условия азоспириллы через экспрессию данных генов регулируют уровень УДФ-глюкозы и УДФ-галактозы, участвующих в синтезе ЭПС, тем самым изменяя его структуру [17]. Возможно, при росте бактерий A. brasilense SR80 и Sp245 на плотной среде синтез ЛПБК претерпевает аналогичные изменения. Индуцирование синтеза нового гликополимера на основе галактозы может являться одной из защитных реакций азоспирилл в ответ на изменение условий существования.
Выражаем благодарность сотрудникам лаборатории химии углеводов Института органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН (г. Москва) за снятие ЯМР-спектров и старшему научному сотруднику лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН, канд. биол. наук Г. Л. Буры-гину за проведение ИФА.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 14-04-01658).
Список литературы
1. Schimel J., Balser T. C., Wallenstein M. Microbial stress-
response physiology and its implications for ecosystem function // Ecology. 2007. Vol. 88. P. 1386-1394.
2. Волкогон В. В. Ассоциативные азотфиксирующие
микроорганизмы // Микробиол. журн. 2000. Т. 62, № 2. С. 51-68.
3. Лукин С. А., Кожевин П. А., Звягинцев Д. Г. Азоспи-
риллы и ассоциативная азотфиксация у небобовых
Биология
53
культур в практике сельского хозяйства // Сельскохоз. биология. 1987. Вып. 1. С. 51-58.
4. Коннова С. А., Федоненко Ю. П., Макаров О. Е., Игнатов В. В. Исследование влияния условий выращивания бактерий Azospirillum brasilense на состав их внеклеточных полисахаридсодержащих материалов // Изв. РАН. Сер. биол. 2003. Вып. 4. С. 430-437.
5. Burdman S., Jurkevitch E., SchwartsburdB., HampelM., Okon Y. Aggregation in Azospirillum brasilense : effects of chemical and physical factors and involvement of extracellular components // Microbiology. 1998. Vol. 144. P. 1989-1999.
6. Халэпа Я. В., Суркина А. К., Гринёв В. С. Различия в структуре капсульных полисахаридов бактерий Azo-spirillum brasilense при планктонном и иммобилизи-рованном культивировании // Исследования молодых учёных в биол. и экол. Саратов : Изд-во Сарат. ун-та, 2013. Вып. 11. С. 101-106.
7. Каневский М. В., Коннова С. А., Бойко А. С., Федоненко Ю. П., Сигида Е. Н., Игнатов В. В. Влияние флавоноидов на состав гликополимеров поверхности Azospirillum lipoferum Sp59b // Микробиология. 2014. Т. 83, № 2. С. 143-151.
8. Fischer S. E., Miguel M. J., Mori G. B. Effect of root exudates on the exopolysaccharide composition and the lipopolysaccharide profile of Azospirillum brasilense Cd under saline stress // FEMS Microbiol. Lett. 2003. Vol. 219. P. 53-62.
9. Konnova S. A., Makarov O. E., Skvortsov I. M., Igna-tov V. V. Isolation, fractionation and some properties of polysaccharides produced in a bound form by Azo-spirillum brasilense and their possible involvement in Azospirillum--wheat root interactions // FEMS Microbiol. Lett. 1994. Vol. 118. P. 93-100.
10. Егоренкова И. В., Коннова С. А., Федоненко Ю. П., Дыкман Л. А., Игнатов В. В. Роль полисахаридсодержащих компонентов капсулы Azospirillum brasilense в адсорбции бактерий на корнях проростков пшеницы // Микробиология. 2001. Т. 70, №1. С. 45-50.
11. Sawardeker J. S., Sloneker J. H., Jeanes A. Quantitative determination of monosaccharides as their alditol acetates by gas liquid chromatography // Anal. Chem. 1965. Vol. 37. P. 1602-1604.
12. Mayer H., Tharanathan R. N., Weckesser J. Analysis of lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria // Methods Microbiol. 1985. Vol. 18. P. 157-207.
13. Позднякова Л. И., Каневская С. В., Леванова Г. Ф., Барышева Н. Н., Пилипенко Т. Ю., Богатырёв В. А., Фёдорова Л. С. Таксономическое изучение азоспи-рилл, выделенных из злаков Саратовской области // Микробиология. 1988. Т. 57, №2. С. 275-278.
14. Baldani V. L. D., Baldani J. I., Döbereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat // Can. J. Microbiol. 1983. Vol. 29. P. 924-929.
15. Molinaro A., Lanzetta R., Evidente A., Parrilli M., Holst O. Isolation and characterisation of the lipopolysaccharide from Xanthomonas hortorum pv. vitians // FEMS Microbiol. Lett. 1999. Vol. 181. P. 49-53.
16. Kumada H., Watanabe K., Nakamu A., Haishima Y., Kondo S., Hisatsune K., Umemoto T. Chemical and biological properties of lipopolysaccharide from Sele-nomonas sputigena ATCC 33150 // Oral. Microbiol. Immunol. 1997. Vol. 12. P. 162-167.
17. Tripathi A. K., Mishra B. M., Tripathi P. Salinity stress responses in the plant growth promoting rhizo-bacteria, Azospirillum spp // J. Biosci. 1998. Vol. 23. P. 463-471.
УДК 502.31 + 332.01 + 304.442
СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИНДЕКСА РАЗВИТИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА (на примере Волжского бассейна)
Н. В. Костина1, Г. С. Розенберг1, Г. Р. Хасаев2 , Г. В. Шляхтин3
Институт экологии Волжского бассейна РАН, Тольятти 2Самарский государственный экономический университет 3Саратовский государственный университет E-mail: [email protected]
Обсуждаются индексы оценки устойчивого развития территории Волжского бассейна. С использованием экспертной информационной системы REGION проведен статистический анализ индекса развития человеческого потенциала, показана его связь с некоторыми экологическими параметрами. Ключевые слова: индекс развития человеческого потенциала, Волжский бассейн, устойчивое развитие.
Statistical Analysis of the Human Development Index (for Example, Volga Basin)
N. V. Kostina, G. S. Rozenberg, G. R. Khasaev, G. V. Shlykhtin
Assessment indexes of sustainable development of the territory of the Volga basin are discussed. Using expert information system
© Костина Н. В., Розенберг Г. СХасаев Г. Р., Шляхтпн Г. В., 2014
