CC BY
120
УДК 579.234
ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТАВА ЛИПОПОЛИСАХАРИДА ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM HALOPRAEFERENS Аи4
Е. Н. Сигида1, Ю. П. Федоненко1, М. П. Чернышова1, В. С. Гринёв1, С. А. Коннова12, В. В. Игнатов1
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов 2Саратовский государственный университет E-mail: [email protected]
Проведено исследование состава липополисахарида почвенных галотолерантных бактерий Azospirillum halopraeferens Au4. Выявлена более высокая электрофоретическая подвижность S-форм ЛПС A. halopraeferens Au4 в полиакриламидном геле, по сравнению с типовым штаммом A. brasilense Sp7. Установлено, что состав ЖК ЛПС штамма Au4 незначительно отличался от ЛПС большинства изученных штаммов A. brasilense и A. lipoferum. В коровой области ЛПС отмечено преобладание глюкозы. С использованием методов иммунохимии и структурного анализа показано, что ОПС A. halopraeferens Au4 характеризуется уникальной структурой повторяющихся звеньев, не встречавшейся ранее у других штаммов азоспирилл. В составе ОПС обнаружены метилированная 6-дезоксигексоза, L-рамноза, D-фукоза, D-ксилоза и D-глюкоза.
Ключевые слова: Azospirillum, липополисахарид, выделение, структура.
Characterization of the Composition
of the Lipopolysaccharide from Halotolerant Bacteria
Azospirillum halopraeferens Au4
E. N. Sigida, Yu. P. Fedonenko, M. P. Chernyshova, V. S. Grinev, S. A. Konnova, V. V. Ignatov
The composition of the lipopolysaccharide of soil halotolerant bacteria Azospirillum halopraeferens Au4 was studied. S-LPS of A. halopraeferens Au4 demonstrated higher electrophoretic mobility compared to the type strain A. brasilense Sp7. Fatty acid composition of the LPS did not significantly differ from that of LPS of most studied strains of A. brasilense and A. lipoferum. Glucose was shown to be the predominate sugar of the core region of the LPS. Serological and structural studies of the LPS of A. halopraeferens Au4 revealed the presence of the structurally unique repeating units in their OPS that had never been found previously in the OPS of other Azospirillum sp. strains. The OPS was found to contain methylated 6-deoxyhexose, L-rhamnose, D-fucose D-xylose and D-glucose. Key words: Azospirillum, lipopolysaccharide, isolation, structure.
Неотъемлемой составляющей почвенных экосистем являются обитающие в прикорневой зоне растений микроорганизмы. Среди многообразия заселяющих ризосферу видов особый интерес представляют бактерии, способные образовывать взаимовыгодные ассоциации с растениями. Обоюдная польза этих ассоциаций обусловлена тем, что корневые экссудаты растений являются источниками углерода и энергии
для бактерий, которые, в свою очередь, синтезируют фитогормоны и антибиотики, способствуют солюбилизации соединений фосфора, железа и других минеральных веществ [1, 2].
Типичными представителями ризосферной микрофлоры являются а-протеобактерии рода Azospirillum. К настоящему моменту род Azo-spirillum насчитывает 18 видов, большинство из которых были выделены из ризосферы и ризопланы различных злаков, однако физиологические аспекты взаимодействия этих бактерий с растениями изучены в основном на примере трех видов - А. brasilense, А. Иро/егит и А. irakense. Показано, что в растительно-микробных взаимодействиях с участием азоспирилл важная роль принадлежит углеводсодержащим гликополимерам поверхности этих бактерий, участвующих в начальных стадиях формирования ассоциаций [3, 4]. Среди них особое место занимают липополисахариды (ЛПС), которые формируют внешний слой наружной мембраны и поступают в бактериальное микроокружение в составе липополисахарид-белковых и поли-сахарид-липидных комплексов [5]. Известно об участии поверхностных гликополимеров в преодолении азоспириллами неблагоприятных факторов внешней среды - высокой и низкой температуры, экстремальных значений рН, снижения влажности [6]. Кроме того, показана способность некоторых штаммов азоспирилл к использованию собственных ЛПС в качестве единственного источника углерода в среде [7, 8].
Молекула ЛПС является гликолипидом, который включает гидрофобный домен липид А, погруженный в мембрану остатками жирных кислот (ЖК), и гидрофильный домен, экспонированный в окружающую среду и состоящий из гетероолигосахарида кора и О-специфического полисахарида (ОПС), построенного из повторяющихся звеньев. Биосинтез липидной и полисахаридной составляющих ЛПС происходит независимо друг от друга, поэтому в мембранном пуле одновременно могут содер-
жаться как S-формы ЛПС, включающие все вышеперечисленные компоненты, так и R-формы, лишенные ОПС. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что азоспириллы продуцируют преимущественно S-формы ЛПС, разнообразные по структуре ОПС [9-11].
Бактерии A. halopraeferens, в отличие от представителей других видов этого рода, являются галотолерантными и были выделены из ри-зопланы злака Leptchloa fusca L., используемого для восстановления непригодных для сельского хозяйства солончаковых почв в Пакистане [12]. Известно, что в условиях абиотического стресса, в том числе солевого загрязнения, когда происходит лимитирование роста растений, почвенные бактерии также способны комплексно воздействовать на физиологические аспекты их жизнедеятельности, изменяя фитогормональ-ный статус, поддерживая ионный гомеостаз и улучшая минеральное питание [13, 14].
Актуальность исследования гликополиме-ров этих бактерий обусловлена отсутствием литературных данных об их составе и структуре, необходимых для выяснения молекулярных механизмов коммуникаций, происходящих в ризосфере между микроорганизмами и растениям, с перспективой повышения эффективности биоремедиации неплодородных почв.
Материалы и методы
Использованный в работе бактериальный штамм A. halopraeferens Au4 был предоставлен коллекцией ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН (г. Саратов). Для выращивания бактерий использовали жидкую малатно-солевую среду с витаминами [5], содержащую 5 г/л NaCl. Бактерии культивировали до окончания экспоненциальной фазы роста при температуре 41 °С, перемешивая на вибростенде. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 0.15 М растворе NaCl и смывали с поверхности капсульный материал механическим перемешиванием в течение 5 сут со сменой отмывающего раствора каждые 12 ч.
ЛПС выделяли из высушенных ацетоном бескапсульных клеток горячим 45% водным раствором фенола без разделения слоев [15]. Примеси белков осаждали из раствора ЛПС добавлением 40% CCI3CO2H до конечного значения рН 2.7.
Деградацию ЛПС проводили 2% CH3CO2H при 100 °С в течение 4-5 ч. Образовавшийся осадок липида А отделяли центрифугированием. Водорастворимую фракцию разделяли гель-хроматографией на колонке с Sephadex G-50
в 0.05 М пиридин-ацетатном буфере (рН 4.5), контролируя элюцию с помощью дифференциального проточного рефрактометра Knauer (Германия).
О-дезацилирование ЛПС проводили в 12% растворе NH4OH при температуре 37 °С в течение 16 ч. Модифицированный ЛПС выделяли колоночной хроматографией с носителем TSK HW-40 («Toyosoda», Япония), в качестве элюента использовали 1% CH3CO2H.
Денатурирующий электрофорез с додецил-сульфатом натрия выполняли в 15% полиакрила-мидном геле (ДСН-ПААГ) [16]. Визуализацию углеводсодержащих компонентов осуществляли окрашиванием гелей красителем на основе нитрата серебра [17]. Колориметрическое определение содержания в препаратах ЛПС углеводов, КДО и фосфора проводили известными методами, описанными нами ранее [5]. Измерения выполняли на Specord 40 («Analytik Jena AG», Германия).
В иммунохимических исследованиях использовали полученные ранее антитела (Ат) к О-антигенам азоспирилл. Иммуноферментный анализ (ИФА) выполняли в полистирольных 96-луночных планшетах («Медполимер», Россия). Для визуализации взаимодействия антигенов и первичных антител использовали козьи антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена («Sigma»). В качестве субстратного реагента использовали перекись водорода с о-фенилендиамином. Измерения оптического поглощения исследуемых проб проводили на иммуноферментном анализаторе Multiscan Ascent («Thermo scientific», Финляндия) при X = 492 нм.
Состав жирных кислот (ЖК) ЛПС в виде метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК) определяли с помощью ГЖХ на хроматографе G^2010 («Shimadzu», Япония), снабженном капиллярной колонкой DB-5 («Agilent», США). Метилирование выполняли методом, описанным в работе [18]. Анализ моносахаридого состава и установление абсолютных конфигураций нейтральных сахаров проводили методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов [19] и ацетили-рованных гликозидов с оптически активным спиртом (Я)-2-октанолом [20] соответственно.
Спектры ЯМР записывали на спектрометре DRX-500 («Bruker», Германия) в растворе 99.96%-ной D2O при 30°С (внутренний стандарт -ацетон, 5с 31.45 и З-триметилсилилпропаноат-й^, 5h 0.0. Образцы предварительно лиофилизовали дважды из 99.9%-ной D2O.
Результаты и их обсуждение
Выделенный водно-фенольной экстракцией из сухих бескапсульных клеток препарат ЛПС А. Ъа1оргае/егет Аи4 содержал все характерные для этих молекул компоненты: углеводы (67.4±3.6%), в том числе КДО (1.3±0.2%), фосфор (1.9±0.1%) и 3-гидроксиалкановые кислоты.
Результаты электрофореза в ДСН-ПААГ препарата ЛПС с последующей визуализацией углеводсодержащих компонентов свидетельствовали о его гетерогенности по молекулярной массе, обусловленной присутствием как Б-, так и Я-форм ЛПС (рис. 1). По сравнению с данными электрофореза для ЛПС других штаммов азоспирилл (к примеру, типового штамма А. brasilense Бр7), Б-формы ЛПС Аи4 обладали большей электрофоретической подвижностью
1 2
Рис. 1. Результат ДСН-ПААГ электрофореза ЛПС бактерий А. Ьга5Иете Бр7 и А. ИаОргае/егет Аи4
в ПААГ. Наблюдаемое явление может быть вызвано структурными особенностями этого препарата, а именно, меньшим количеством повторяющихся звеньев в ОПС либо большим значением эффективного отрицательного заряда молекулы.
Исследование структуры ЛПС осложняется амфифильностью этих соединений, обусловливающей их способность образовывать мицеллы в растворах. В связи с этим для установления полного строения ЛПС проводят структурный анализ каждого из компонентов ЛПС в отдельности. Мягкий кислотный гидролиз ЛПС, приводящий к разрушению кислотолабильной молекулы КДО, соединяющей липид А с олигосахаридом кора, позволил получить все составляющие компоненты ЛПС. Осадок липида А был отделен центрифугированием, а растворимые в воде ОПС и олигосахарид кора были фракционированы с помощью гель-проникающей хроматографии (рис. 2). Выходы полученных фракций приведены в табл. 1.
мл
Рис. 2. Профиль элюции на 8ерИа11ех 0-50 деградированного ЛПС А. На1оргае/егет Аи4: I - О-специфический полисахарид; II - коровый олигосахарид
Таблица 1
Состав моносахаридов ОПС и олигосахарира кора А halopraeferens Аи4
Препарат Выход, % от массы ЛПС Моносахариды, % от суммы площадей пиков идентифицированных ацетатов полиолов
6Шех20Ме ЯЬа Рис Ху1 01с Мап ОШАс Мап№Ас Нер
ОПС 44 9 18 26 21 21 - - - -
Коровый ОС 11 - 9 6 7 48 15 5 3 7
Примечание. «-» - содержание компонента менее 3%.
Наличие отрицательно заряженных группировок, ориентация и распределение жирных кислот липида А обуславливает биологические свойства ЛПС. Известно, что А. Иро/егыт и А. 1гакеп5е продуцируют нетоксичные или слаботоксичные ЛПС, проявляющие антагонистические по отношению к классическим эндотоксинам свойства [21, 22]. Анализ состава ЖК препарата ЛПС А. halopraeferens Au4 не выявил значительных качественных отличий от ЛПС различных штаммов А. brasilense и А. lipoferum [23]. По данным ГЖХ МЭЖК, преобладающи-
ми кислотами являлись 3-гидрокситетрадека-новая (3-ОН-С^^), 3-гидроксигексадекановая (3-ОН-С^^) и октадеценовая (С^^), доля которых составляла более 85% от суммы идентифицированных кислот (рис. 3, а, табл. 2). В минорных количествах также были обнаружены гексадекановая (С^^) и нонадекановая кислоты (^9 0). Для ЛПС А. halopraeferens Au4, так же, как и для других видов азоспирилл, было выявлено высокое содержание (~40%) непредельной кислоты С181, редко встречающейся в составе липида А других бактерий.
и 5
_^_^ I
^Х^Ли, У ик^-А.
и
" : : = : ■ ■ V," „
Время, мин
б
Рис. 3. Хроматограмма ГЖХ МЭЖК препаратов ЛПС (а) и О-дезацилированного ЛПС* (б) А. halopraeferensЛи4
Таблица 2
Состав ЖК нативного ЛПС и О-дезацилированного ЛПС* А. На1оргае/егет Аи4 (% от суммы площадей пиков МЭЖК ЛПС)
а
Препарат ЖК
3-ОН-С14о с 16:1 3-ОН-С1бЮ с 18:1 с 19:0
ЛПС 35.3 1.3 14.0 39.5 4.8
ЛПС* 3.3 0.5 54.9 25.4 5.0
О-дезацилирование липида А является одним из этапов при установлении его структуры, позволяющим определить, какие из жирных кислот в его составе являются амидосвязанны-ми. В процессе О-дезацилирования происходит
гидролиз сложноэфирной связи и отщепление жирных кислот, этерифицирующих глюкозамин или гидроксикислоты, при этом амидо связанные кислоты остаются незатронутыми. Гидролиз ЛПС в мягких щелочных условиях позволил
получить О-дезацилированный препарат (ЛПС*), отличающийся от исходного ЛПС возрастанием доли 3-ОЫ-С160 и снижением доли 3-ОЫ-С140 (см. рис. 3, б, табл. 1). Эти данные свидетельствовали о том, что З-ОЫ-С160 является К-связанной, а 3-ОЫ-С140 - О-связанной. Информация о характере связей маркерных жирных кислот в ЛПС А. Ъа1оргае/егет Аи4 согласуется с данными о структуре липида А А. Иро/егит 8рБг17. для которого было установлено, что первичная 3-ОЫ-С160 кислота присоединена амидной связью, первичная 3-ОЫ-С^о - эфирной, а гекса-декановая и октадеценовая кислоты являются вторичными [24]. Наличие общих структурных особенностей гидрофобной части ЛПС у штаммов различных видов бактерий рода Azospiril-1ит может свидетельствовать о консервативном характере строения их липида А.
Известно о том, что строение полисахарид-ной части ЛПС ассоциативных и симбиотических бактерий оказывает влияние на процесс колонизации поверхности клеток хозяина [25]. Ранее на основании анализа структур О-специфических полисахаридов и иммунохимических тестов была разработана схема серотипирования азо-спирилл [10, 11, 26]. ИФА с использованием Ат
к ЛПС азоспирилл различных серогрупп выявил только для некоторых из них слабое взаимодействие с ЛПС A. halopraeferens Au4, (данные не приведены), что могло свидетельствовать о наличии в его ОПС структурно отличных от других видов азоспирилл полисахаридных цепей.
Моносахаридный состав ОПС и корово-го олигосахарида, определенный ГЖХ ацетатов полиолов, был различным (рис. 4, см. табл. 1). В составе ОПС 2-Ме-6-дезоксигексоза (2-Me-6dHex), рамноза (Rha), фукоза (Fuc). ксилоза (Xyl) и глюкоза (Glc) были обнаружены в приблизительно равных количествах. В олигосахариде кора преобладающим сахаром являлась Glc, а количества Rha, Fuc и Xyl были приблизительно равными (возможно, из продукта, образовавшегося после деградации молекул SR- формы ЛПС, т.е. молекул, содержащих одно звено О-цепи). Кроме того, в составе корового ОС были идентифицированы манноза (Man), N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и гептоза (Hep). 2-Me-6dHex в коровом ОС отсутствовала, помимо этого на хроматограмме наблюдался пик неидентифицированного моносахарида, время удерживания которого было близко к таковому для Fuc.
3
10
"'I.........I...........
¡2 13 14 Премя, wim
h.
3?
I
ILL
16 17
Время, мин
б
Рис. 4. Хроматограмма ГЖХ ацетатов полиолов, полученных после гидролиза ОПС A. halopraeferens
Au4 (а) и олигосахарида кора (б)
а
Определение абсолютных конфигураций моносахаридов, входящих в состав ОПС, выявило ь-конфигурацию КЬа и Б-конфигурацию Бис, Ху1 и 01с.
В результате анализа основной серии сигналов ГЖХ-МС частично метилированных ацета-
тов полиолов было установлено наличие в ОПС 3,4-дизамещенной 6-дезоксигексапиранозы, терминальной глюкозы и производного, соответствующего 2-замещенной ксилопиранозе или 4-замещенной ксилопиранозе. В минорной серии присутствовали 2-замещенная 6-дезоксигесапи-
раноза, 3-замещенная 6-дезоксигексапираноза и 3-замещенная-2-ОМе-6-дезоксигексапираноза. Таким образом, исследуемый ОПС является разветвленным с терминальной глюкозой и 3,4-дизамещенной 6-дезоксипиранозой в точке ветвления.
- и 13С-ЯМР спектры содержали сигналы разной интенсивности, что свидетельствовало о структурной гетерогенности ОПС. В связи с наличием нескольких серий сигналов в спектрах ЯМР их отнесение на данном этапе работы произвести не удалось ввиду их перекрывания. Гетерогенность ОПС может быть вызвана как нерегулярным строением полисахаридной цепи, в том числе чередованием достаточно длинных фрагментов, так и нестехиометрическим метилированием остатка 6-дезоксигексозы.
Известно, что наличие нестехиометри-ческих заместителей значительно влияет на серологические свойства ОПС, создавая новые или маскируя существующие антигенные детерминанты. Такие заместители довольно часто встречаются в составе ОПС патогенных и ассоциативных бактерий. Для бактерий рода Rhizobium при культивировании в условиях симбиоза показано увеличение доли ацети-лированных и метилированных полисахаридов, повышающее липофильные свойства ЛПС [27].
На основании имеющихся в литературе данных о структурах ОПС азоспирилл можно утверждать, что повторяющиеся звенья штамма A. halopraeferens Аи4 отличаются от таковых азоспирилл других видов. ь-КЬа, присутствующая в ОПС A. halopraeferens Аи4, была обнаружена в октасахаридном повторяющемся звене ОПС A. brasilense БЯ55 [8], а тетрасахаридные повторяющиеся звенья, состоящие из ь-КЬа в основной цепи и терминальной Б-01е, формируют ОПС азоспирилл, отнесенных к серогруппе III [11]. Б-Бие ранее не встречалась в составе ОПС азоспирилл, а ь-Бие и Б-Ху1 были обнаружены в ОПС A. brasilense 8Я80, Бр7 и 1ш6Б2 [28-30].
Таким образом, было установлено, что ЛПС A. halopraeferens Аи4 незначительно отличается по составу липида А, но характеризуется большей, по сравнению с ЛПС других видов азо-спирилл, электрофоретической подвижностью в ДСН-ПААГ и имеет уникальную структуру ОПС, не обнаруженную ранее в составе ЛПС других штаммов азоспирилл. Учитывая, что ОПС является наиболее вариабельным фрагментом ЛПС, можно предположить, что его строение является результатом адаптации бактерий
к существованию в уникальной экологической
нише - в засолённых почвах.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 14-04-01658).
Список литературы
1. Bhattacharyya P. N., Jha D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) : emergence in agriculture // World J. Microb. Biot. 2012. Vol. 28. P. 1327-1350.
2. Lugtenberg B., Kamilova F. Plant-growth-promoting rhizobacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2009. Vol. 63. P. 541-556.
3. Skvortsov I. M., Ignatov V. V. Extracellular polysaccharides and polysaccharide-containing biopolymers from Azospirillum species : properties and the possible role in interaction with plant roots // FEMS Microbiol. Lett. 1998. Vol. 165. P. 223-229.
4. Evseeva N. V., Matora L. Y., Burygin G. L., Dmitrien-ko V. V., Shchyogolev S. Y. Effect of Azospirillum brasilense Sp245 lipopolysaccharide on the functional activity of wheat root meristematic cells // Plant Soil. 2011. Vol. 346. P. 181-188.
5. Konnova S. A., Makarov O. E., Skvortsov I. M., Ignatov V. V. Isolation, fractionation and some properties of polysaccharides produced in a bound form by Azo-spirillum brasilense and their possible involvement in Azospirillum - wheat root interaction // FEMS Microbiol. Lett. 1994. Vol. 118. P. 93-99.
6. Коннова С. А., Брыкова О. С., Сачкова О. А., Егоренкова И. В., Игнатов В. В. Исследование защитной роли полисахаридных компонентов капсулы бактерий Azospirillum brasilense // Микробиология. 2001. Т. 70. С. 503-508.
7. Kefalogianni I., Aggelis G. Modeling growth and biochemical activities of Azospirillum spp. // Appl. Micro-biol. Biot. 2002. Vol. 58. P. 352-357.
8. Boyko A. S., Konnova S. A., Fedonenko Y. P., Zdoroven-ko E. L., Smol'kina O. N., Kachala V. V., Ignatov V. V. Structural and functional peculiarities of the lipopolysac-charide of Azospirillum brasilense SR55, isolated from the roots of Triticum durum // Microbiol. Res. 2011. Vol. 166. P. 585-593.
9. Fedonenko Y. P., Konnova O. N., Zatonsky G. V., Shash-kov A. S., Konnova S. A., Zdorovenko E. L., Ignatov V. V., Knirel Y. A. Structure of the O-polysaccharide of the lipopolysaccharide of Azospirillum irakense KBC1 // Carbohydr. Res. 2004. Vol. 339. P. 1813-1816.
10. Бойко А. С., Смолькина О. Н., Федоненко Ю. П., Здоровенко Э. Л., Качала В. В., Коннова С. А., Игнатов В. В. Особенности структуры О-полисахаридов азоспирилл серогруппы I // Микробиология. 2010. Т. 79, № 2. С. 219-227.
11. Федоненко Ю. П., Бойко А. С., Здоровенко Э. Л., Коннова С. А., Шашков А. С., Игнатов В. В., Книрель Ю. А. Структурные особенности О-специфических по-
лисахаридов бактерий Azospirillum серогруппы III // Биохимия. 2011. Т. 76, № 7. С. 976-982.
12. Reinhold B., Hurek T., Fendrik I., Pot B., Gillis M., Kersters K., Thielemans S., De Ley J. Azospirillum halopraeferens sp. nov., a nitrogen-fixing organism associated with roots of kallar grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth) // Inter. J. Syst. Bacteriol. 1987. Vol. 37. P. 43-51.
13. Dodd I. C.., Perez-Alfocea F. Microbial amelioration of crop salinity stress // J. Exp. Bot. 2012. Vol. 63. P. 3415-3428.
14. Mendes R., Garbeva P, Raaijmakers J. M. The rhi-zosphere microbiome : significance of plant-beneficial, plant-pathogenic and human-pathogenic microorganisms // FEMS Microbiol. Rev. 2013. Vol. 37. P.634-663
15. Кульшин В. А., Яковлев А. П., Аваева С. Н., Дмитриев Б. А. Улучшенный метод выделения липополи-сахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1987. № 5. C. 44-46.
16. Hitchcock P. J., Brown T. M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stain polyacrylamide gels // J. Bacteriol. 1983. Vol. 154. P. 269-277.
17. Tsai C. M., Frasch C. E. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. Vol. 119. P. 115-119.
18. Mayer H., Tharanathan R. N., Weckesser J. Analysis of lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria // Methods Microbiol. 1985. Vol. 18. P. 157-207.
19. Sawardecker J. S., Sloneker J. H., Jeans A. Quantitative determination of monosaccharides as their alditol acetates by gas liquid chromatography // Anal. Chem. 1965. Vol. 37. P. 1602-1603.
20. Leontein K., Lindberg B., Lonngren J. Assignment of absolute configuration of sugars by g.l.c. of their acetylated glycosides formed from chiral alcohols // Carbohydr. Res. 1978. Vol. 62. P. 359-362.
21. Komaniecka I., Zdzisinska B., Kandefer-Szerszen M., Choma A. Low endotoxic activity of lipopolysaccha-rides isolated from Bradyrhizobium, Mesorhizobium, and Azospirillum strains // Microbiol. Immunol. 2010. Vol. 54. P. 717-725.
22. Суркина А. К., Коннова С. А., ФедоненкоЮ. П., Игнатов В. В. Гликополимеры бактерий рода Azospirillum
как перспективные антагонисты классических эндотоксинов // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2013. Т. 13, вып. 2. С. 78-85.
23. Игнатов В. В., Коннова О. Н., Бойко А. С., Фомина А. А., ФедоненкоЮ. П., Коннова С. А. Характеристика состава жирных кислот липидов А липополи-сахаридов бактерий рода Azospirillum // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2009. Т. 9, вып. 1. С. 36-41.
24. Choma A., Komaniecka I. Characterization of a novel lipid A structure isolated from Azospirillum lipoferum lipopolysaccharide // Carbohydr. Res. 2008. Vol. 343. P. 799-804.
25. Lerouge I., Vanderleyden J. O-antigen structural variation: mechanisms and possible roles in animal/plant-microbe interactions // FEMS Microbiol. Rev. 2002. Vol. 26. P. 17-47.
26. Коннова О. Н., Бойко А. С., Бурыгин Г. Л., Федоненко Ю. П., Матора Л. Ю., Коннова С. А., Игнатов В. В. Химические и серологические исследования бактерий рода Azospirillum // Микробиология. 2008. Т. 77, № 3. С. 350-357.
27. Kannenberg E. L., Carlson R. W. Lipid A and O-chain modifications cause Rhizobium lipopolysaccharides to become hydrophobic during bacteroid development // Mol. Microbiol. 2001. Vol. 39. P. 379-391.
28. Boyko A. S., Dmitrenok A. S., Fedonenko Yu. P., Zdorovenko E. L., Konnova S. A., Knirel Y. A., Igna-tov V. V. Structural analysis of the O-polysaccharide from Azospirillum brasilense Jm6B2 containing 3-O-methyl-D-rhamnose (D-acofriose) // Carbohydr. Res. 2012. Vol. 355. P. 92-95.
29. Sigida E. N., Fedonenko Y. P., Zdorovenko E. L., Konnova S. A., Shashkov A. S., Ignatov V. V., Knirel Y. A. Structure of repeating units of a polysaccharide(s) from the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense SR80 // Carbohydr. Res. 2013. Vol. 371. P. 40-44.
30. Sigida E. N., Fedonenko Yu. P., Shashkov A. S., Zdorovenko E. L., Konnova S. A., Ignatov V. V., Knirel Y. A. Structural studies of the O-specific polysaccharide(s) from the lipopolysaccharide of Azospirillum brasilense type strain Sp7 // Carbohydr. Res. 2013. Vol. 380. P. 76-80.
