CC BY
105
ОБЗОРЫ, ДИСКУССИИ
© Якушева Е.Н., Черных И.В., Бирюкова А.С., 2011 УДК 615.033
ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛИКОПРОТЕИНА-Р КАК БЕЛКА ТРАНСПОРТЕРА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
Е.Н. Якушева, И.В. Черных, А.С. Бирюкова
ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Рязань
В обзоре литературы охарактеризованы актуальность проблемы, химические свойства субстратов гликопротеина-Р, структура, функции, локализация транспортера, факторы, влияющие на активность гликопротеина-Р.
Ключевые слова: гликопротеин-Р, структура, функции, лекарственные вещества
Современная фармакотерапия большинства заболеваний включает многочисленные лекарственные средства синтетического и природного происхождения. Накопилось достаточно данных о возможности фармакокинетического взаимодействия между ними на этапе биотрансформации в организме [3]. Для прогнозирования фармакокинетического взаимодействия лекарственных препаратов в процессе всасывания, распределения и экскреции, также необходимо знать потенциальную возможность веществ влиять на транспортные системы организма, в том числе гликопротеин-Р (Pgp) и изменять его функциональную активность. Это позволит исключить неэффективность фармакотерапии и нежелательные реакции лекарственных средств, связанные с изменением их концентрации в плазме крови. Проблема становится особенно актуальной из-за полипрагмазии, столь характерной для рутинной клинической практики. Для того чтобы предотвращать сложные клинические ситуации, необходимо повысить информированность врачей, провизоров и пациентов по данному вопросу, а также наладить систему экспертизы применяемых и регистрируемых препаратов на предмет их воздействия на метаболические и транспортные системы.
Транспортеры, принадлежащие к ABC (Adenosine triphosphat binding cassette)-
суперсемейству поддерживают химический гомеостаз, опосредуя транспорт молекул через клеточные мембраны вне зависимости от концентрационного градиента. ABC-
транспортеры кодируются 48 генами человеческого генома, которые объединены в семь подсемейств (ABCA - ABCG), исходя из сходства нуклеотидных последовательностей. Эти гены кодируют мембранные белки с широким диапазоном субстратной специфичности и субклеточной локализации. Среди данных генов наиболее изученным является ABCB1 (MDR1) [36], в связи с тем, что именно он кодирует Pgp [35]. Семейство MDR включает два гена человека (MDR1 и MDR2) и три гена грызунов (mdrl, mdr2, mdr3). В гене имеется две области промоторов. Один промотор функционирует в нормальных тканях, в то время как активность второго выявляется в ткани опухолей, устойчивых к лекарственной терапии [42].
Белки транспортеры, родственные Pgp, обнаружены также у ряда бактерий, например микобактерий туберкулеза [10], и грибов, например, Candida albicans [11], где они играют ключевую роль в формировании устойчивости к противотуберкулезной и противогрибковой терапии соответственно.
Ген MDR1, кодирующий Pgp, обладает полиморфизмом. В настоящее время активно изучается клиническое значение
четырех аллельных вариантов, представляющих замену в нуклеотидной последовательности ДНК одного нуклеотида на другой - так называемые полиморфизмы одного нуклеотида (single nucleotide polymorphism). Два из них (G2677T и G2677A в 21 экзоне) являются структурными полиморфизмами, т. е. приводят к изменениям в аминокислотной последовательности. Полиморфизмы C1236T (в 12 экзоне) и C3435T (в 26 экзоне) не приводят к аминокислотным заменам, однако вызывают изменение экспрессии данного гена [1]. Так, известно, что у лиц с генотипом TT отмечается низкая экспрессия гена MDR1, в результате чего у них снижено количество Pgp в кишечнике, печени, почках и эндотелии гематоэнцефали-ческого барьера [13]. Если лекарственные средства, являющиеся субстратами Pgp, имеют малую широту терапевтического действия, то сниженная активность транспортера у лиц с генотипом 343 5TT может иметь клинические последствия, проявляющиеся развитием нежелательных лекарственных реакций или высоким риском их возникновения.
По данным научной литературы изменение экспрессии иРНК гена MDR1 не всегда коррелирует с изменением экспрессии самого белка-транспортера и может быть результатом различий в транскрипционных и трансляционных процессах [16].
Субстраты Pgp - вещества структурно разнородные, однако, у них есть схожие свойства. Pgp переносит преимущественно липофильные ароматические соединения с молекулярной массой 300 - 500 Д и вещества, имеющие аминогруппу [4] или атом азота, положительно заряженный при физиологических значениях pH, и водородные связи в молекуле [37]. Причем, чем липофильнее молекула и, чем больше в ней водородных связей, тем большим сродством к Pgp обладает соединение [21].
Абсолютное большинство ABC-транспортеров требует энергии в форме АТФ для транспортировки лигандов через клеточную мембрану. Для их функционирования необходимо наличие как минимум четырех доменов: два трансмембран-
ных домена (ТМД), формирующих ли-ганд-связывающие сайты, и два нуклео-тидсвязывющих домена (НСД), связывающих и гидролизующих АТФ для осуществления транслокации субстрата. Pgp включает все 4 домена в одинарной поли-пептидной цепи. Он состоит из 1280 аминокислотных остатков, сгруппированных в 2 гомологичные половины, каждая по 6 трансмембранных сегментов, а также цитозольный НСД. Некоторые спирали ТМД предположительно формируют связывающий сайт и, следовательно, являются каналами, через которые субстраты пересекают мембрану. С другой стороны НСД аккумулирует энергию связей АТФ для транспорта веществ [39]. Причем для транспортировки одной молекулы субстрата необходим гидролиз двух молекул АТФ. Исследования с неспецифическими ингибиторами АТФазы (ванадатом и негидролизуемым аналогом АТФ
AdoPP(NH)P) показали, что молекула АТФ - это не простой аллостерический активатор, и ее гидролиз является необходимым условием для транспортировки субстратов Pgp [17]. Исследования, проведенные на клеточных клонах, устойчивых к винкристину, выявили, что N-гликозилирование на первой экстрацел-люлярной петле Pgp необходимо для соответствующей направленной ориентации в пространстве и стабильности молекулы транспортера, но не играет решающей роли в транспортировке субстратов [28].
Локализация Pgp изучена в эспери-ментах с использованием иммуногисто-химического анализа, метода Western-blotting, полимеразно-цепной реакции (ПЦР), а также специфических ингибиторов Pgp. Высокие уровни белка-транспортера были обнаружены в эпителии тонкого и толстого кишечника [8, 31], в проксимальных канальцах нефронов почек, желчевыводящих протоках гепатоци-тов, протоках поджелудочной железы [8, 15], в трофобластах плаценты, скелетной и сердечной мускулатуре [15], в дерме, протоках потовых желез, сосудах кожи [30]. В большинстве тканей Pgp локализован на поверхности апикальной мембраны
клеток, что подтверждает его функционировании в качестве насоса для физиологических метаболитов и ксенобиотиков. Только в надпочечниках белок распределен диффузно, и, значит, способен секре-тировать вещества в интерстициальное пространство. Функцией Pgp в клетках надпочечников является, очевидно, защита клеточных мембран от высокой локальной концентрации стероидов [2]. Pgp также локализован в эндотелии капилляров, формирующих гематоэнцефаличе-ский барьер, в астроцитах [33], и в других гистогематических барьерах (гематоова-риальном, гематотестикулярном и гема-топлацентарном) [1, 15, 25]. Pgp обнаружен во всех гемопоэтических предшественниках с самым высоким уровнем экспрессии в плюрипотентных стволовых клетках [9], а также в зрелых лимфоцитах периферической крови, в T-клетках и натуральных киллерах [34]. Связь экспрессии Pgp с наиболее ранними кроветворными предшественниками может отражать специальную роль Pgp в их защите от токсических субстратов и, возможно, от различных регуляторных факторов, провоцирующих дифференцировку или пролиферацию стволовых клеток [2]. С помощью мышиных моноклональных антител MRK16 не было выявлено наличие Pgp в легких, желудке, слюнных железах, коре головного мозга, мозжечке, спинном мозге, яичниках, матке, коже и селезенке.
Таким образом, Pgp - это эффлюкс-ный транспортер, контролирующий фармакокинетику различных соединений в физиологических условиях. Pgp рассматривается как белок с полиспецифичностью, так как он способен распознавать широкий спектр субстратов. Известен целый ряд соединений, которые in vitro оказывают как индуцирующее, так и ингибирующее влияние на функциональную активность Pgp [3].
Однако, изменение активности Pgp возможно не только в результате лекарственного взаимодействия с транспортером. Линейное возрастание функциональной активности Pgp наблюдалось также в результате экстрацеллюлярного ацидоза,
возникающего вследствие смоделированной интермиттирующей гипоксии (8% O2) или введения молочной кислоты в опухоль крыс [6]. Сходные результаты получены и при ацидификации культуры клеток опухоли предстательной железы крыс, а также при понижении pH путем интенсификации анаэробного метаболизма у крыс in vivo [5]. Двухнедельное воздействие на крыс интермиттирующей дыхательной гипоксии приводило к повышению степени экспрессии Pgp в сердце, а также к увеличению количества иРНК гена MDR1 в печени и сердце, что было выявлено методом Western blotting и ПЦР [22]. Сходные результаты с Pgp, локализованным в печени, были получены и другими авторами [7].
В эксперименте на культуре эпителиальных клеток, подвергавшихся гипокси-ческому воздействию, обнаружено увеличение содержания мРНК гена MDR1 и возрастание количества самого транспортера. В культуре интактных клеток T84 наблюдалось повышение активности Pgp, выявленное путем анализа изменений степени ингибирования эффлюкса дигоксина и родамина 123 верапамилом [20]. Показано, что 24-часовое воздействие на культуру опухолевых клеток гипоксии при нормальном значении pH не привело к существенному изменению активности и степени экспрессии Pgp, тогда как экстрацеллю-лярный ацидоз (pH=6,6) усилил Pgp-опосредованный выброс даунорубицина, причем этот эффект был даже более выражен, чем при совместном действии на клеточную культуру ацидоза и гипоксии [32].
Индуцированная гипоксией экспрессия Pgp может частично объяснить устойчивые к лекарственной терапии кардиоваскулярные заболевания у пациентов с обструктивными приступами апноэ во сне [22].
Существенную роль в процессе активации экспрессии гена MDR1 в условиях гипоксии отводится HIF-1a [14]. По современным данным HIF-1a состоит из двух субъединиц: a-субъединица ответственна за проникновения димера в нуклео-плазму, а Р-субъединица связывается с элементом, ответственным за гипоксию
Abcbl-промотора и оказывает на него регуляторное воздействие [23]. Однако, имеются сведения о том, что приобретение опухолевыми клетками устойчивости к химиотерапии в условиях гипоксии объясняется задержкой клеточного цикла на стадии G1; при этом активации Pgp не происходит [19].
Тиреоидные расстройства также могут провоцировать существенные изменения степени экспрессии Pgp. Установлено, что у пациентов с болезнью Базедова-Грейвса с повышенным уровнем свободных Т3 и Т4, экспрессия Pgp уменьшалась при увеличении длительности заболевания. Авторы получили корреляционную связь между экспрессией гена MDR1, уровнем ТТГ в крови и размером щитовидной железы по данным УЗИ [18].
У больных с патологией щитовидной железы обнаружены аномалии в фармакокинетике различных лекарственных препаратов, в том числе и субстратов Pgp.
При гипертиреозе клиренс субстрата Pgp дигоксина был существенно снижен, однако его биодоступность, объем распределения, период полувыведения и степень связи с белками плазмы крови оставались неизменными [36]. В ранее выполненном исследовании установлено, что концентрация дигоксина снижалась у пациентов с гипертиреозом по сравнению пациентами с нормальной функцией щитовидной железы [29].
Изучение влияния левотироксина на экспрессию Pgp в кишечнике выявило, что экспрессия мРНК гена MDR1 в двенадцатиперстной кишке пациентов увеличивалась недостоверно, существенных нарушений фармакокинетики субстрата Pgp талинолола не обнаружено [12].
У пациентов с гипотиреозом при восстановлении функции щитовидной железы наблюдалось возрастание количества мРНК гена MDR1- в 1,8 раза и интенсификация эффлюкса родамина из клеток CD56(+) на 26% [36].
Выявлено, что у крыс с гипертирео-зом экспрессия Pgp существенно повышалась в печени и почках, умеренно в тощей и подвздошной кишке. На основании ана-
лиза полученных данных авторы считают, что тироксин тканеспецифично и концентрационно-зависимо индуцирует экспрессию белка-транспортера [27]. Учитывая, что механизм действия тироксина связан с активацией ядерных рецепторов, индукция экспрессии Pgp в почках у крыс с ги-пертиреозом опосредуется увеличением транскрипции мРНК гена mdr1a. Однако, в печени крыс с гипертиреозом обнаружено значительное снижение экспрессии мРНК гена mdr1b, при отсутствии влияния на экспрессию мРНК гена mdr1a [38].
В исследовании на клетках карциномы толстого кишечника человека (LS180 и Сасо-2) выявлено, что на активность Pgp можно воздействовать гормонами щитовидной железы по прегнан - х - рецептор (PXR)-независимому механизму [24].
На культуре клеток с повышенной экспрессией MDR1 доказано, что Т3 выводится из клеток Pgp [26]. Аналогичные данные получены для Pgp в гематоэнце-фалическом барьере. Показано, что белок
- транспортер обеспечивает транспорт Т4 между спинно-мозговой жидкостью, хориоидальными сплетениями и мозгом, регулируя проникновение Т4 в спинномозговую жидкость [41].
В других исследованиях было высказано предположение об отсутствии влияния Pgp на выведение Т3. Например, ве-рапамил ингибировал эффлюкс Т3 из культуры клеток линии MDCKII, которые не экспрессировали MDR-1. Авторы предположили, что обнаружили новый белок, чувствительный к верапамилу и ответственный за выведение Т3 из клеток. Было установлено, что выделенный из мембраны белок отличается от Pgp своей массой [40].
Выполненный анализ научной литературы позволяет предположить, что эндокринные расстройства и хронические заболевания, сопровождающиеся гипоксией, способны влиять на функциональную активность Pgp, что требует дальнейших исследований с целью подтверждения данной гипотезы.
Таким образом, существует продиктованная практикой постоянная потреб-
ность в анализе и систематизации данных о Pgp, его субстратах, лекарственных средствах и других факторах, способных изменять активность белка-транспортера. Оценка экспериментальных и клинических данных по изучению транспортеров лекарственных веществ позволит повысить эффективность и безопасность фармакотерапии, улучшить практику использования лекарственных средств.
Литература
1. Значение полиморфизма гена MDR1, кодирующего гликопротеин-P, для индивидуализации фармакотерапии / Д.А. Сычев [и др.] // Клинич. фармакология и терапия. - 2005. - №1. - С. 92-96.
2. Карпова С.И. P-гликопротеин -структура, функции и роль в резистентности лейкозов к химиотерапии / С.И. Карпова, Н.Г. Тюрина // Пробл. гематологии и переливания крови. -1997. - №1. - С. 37-46.
3. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализированной медицины: руководство для врачей / В.Г. Кукес [и др.]. - М.: ГЭО-ТАР-Медиа, 2008. - 304 с.
4. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов: учебное пособие / Е.Ю. Афанасьева [и др.]; под ред. Н.И. Калетиной. - М.: ГЭО-ТАР-МЕДИА, 2008. - С. 149-164.
5. Acidosis induces multi-drug resistance in rat prostate cancer cells (AT1) in vitro and in vivo by increasing the activity of the p-glycoprotein via activation of p38 /
C. Sauvant [et al.] // Int J Cancer. -
2008. - Vol. 123, №11. - P. 2532-2542.
6. Activation of P-glycoprotein (Pgp)-mediated drug efflux by extracellular acidosis: in vivo imaging with (68)Ga-labelled PET tracer / O. Thews [et al.] // Eur J Nucl Med Mol Imaging. - 2010. -Vol. 37, №10. - P. 1935-1942.
7. Animal models of acute moderate hypoxia are associated with a down-regulation of CYP1A1, 1A2, 2B4, 2C5, and 2C16 and up-regulation of CYP3A6 and P-
glycoprotein in liver / C. Fradette [et al.] // Drug Metab Dispos. - 2007. -Vol. 35, №5.
- P. 765-771.
8. Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues / F. Thiebaut [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. -1987. - Vol. 84, №21. - P. 7735-7738.
9. Chaudhary P.M. Expression and activity of P-glycoprotein, a multidrug efflux pump, in human hematopoietic stem cells / P.M. Chaudhary, I.B. Roninson // Cell. - 1991. - Vol. 66, №1. - P. 85-94.
10. Choudhuri B.S. Isoniazid accumulation in Mycobacterium smegmatis is modulated by proton motive force-driven and ATP-dependent extrusion systems / B.S. Choudhuri, S. Sen, P. Chakrabarti // Biochem Biophys Res Commun. -1999. - Vol. 256, №3. - P. 682-684.
11. Doxorubicin induces drug efflux pumps in Candida albicans / G. Kofla [et al.] // Med Mycol. - 2011. - Vol. 49, №2. -P. 132-142.
12. Effect of levothyroxine administration on intestinal P-glycoprotein expression: consequences for drug disposition / W. Siegmund [et al.] // Clin. Pharmacol. Ther. - 2002. - Vol. 72. - P. 256-264.
13. Effects of genetic polymorphisms in the ABCB1 gene on clinical outcomes in patients with gastric cancer treated by second-line chemotherapy / K. Shitara [et al.] // Asian Pac J Cancer Prev. -2010. - Vol. 11, №2. - P. 447-452.
14. Expression and significance of hypoxia-inducible factor-1 alpha and MDR1/P-glycoprotein in human colon carcinoma tissue and cells / Z.J. Ding [et al.] // Cancer Res Clin Oncol. - 2010. - №3.
- P. 1276-1282.
15. Expression of the multidrug resistance gene product (P-glycoprotein) in human normal and tumor tissues / C.J. Cordon-Cardo [et al.] // Histochem Cytochem. -1990. - Vol. 38, №9. - P. 1277-1287.
16. Guhaniyogi J. Regulation of mRNA stability in mammalian cells / J. Guhaniyogi, G. Brewer // Gene. - 2001.
- Vol. 265, №1. - P. 11-23.
17. Horio M. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells / M. Horio, M.M. Gottesman, I. Pastan // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1988. - Vol. 85, №10. - P. 3580-3584.
18. Human multidrug resistance-1 gene expression levels in graves-basedow disease / S. Cetinkalp [et al.] // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. - 2010. -Vol. 118, № 3. - P. 158-160.
19. Hypoxia induces resistance to 5-fluorouracil in oral cancer cells via G(1) phase cell cycle arrest / S. Yoshiba [et al.] // Oral Oncol. - 2009. - Vol. 45, №2. - P. 109-115.
20. Hypoxia-inducible Factor-1-dependent Regulation of the Multidrug Resistance (MDR1) Gene / M. Katrina [et al.] // Cancer Res. - 2002. - №6. - P. 3387.
21. Identification of P-glycoprotein substrates and inhibitors among psychoactive compounds-implications for pharmacokinetics of selected substrates / A.A. El Ela [et al.] // J Pharm Pharmacol. - 2004. - Vol. 56, №8. - P. 967-975.
22. Influence of intermittent hypoxia on myocardial and hepatic P-glycoprotein expression in a rodent model / J.M. Dopp [et al.] // Pharmacotherapy. -2009. - Vol. 29, №4. - P. 365-372.
23. Influence of Intermittent Hypoxia on Myocardial and Hepatic P-glycoprotein Expression / M. John [et al.] // Pharmacotherapy. - 2009. - Vol. 29, №4. - P. 365-372.
24. Levothyroxine up-regulates p-glycoprotein independent of the preg-nane-X-receptor / T. Mitin [et al.] // Physiol. Rev. - 2006. - Vol. 86. -P. 1179-1236.
25. Linlin Su Drug transporter, P-glycoprotein (MDR1), is an integrated component of the mammalian blood-testis barrier / C. Yan Cheng, Dolores
D. Mruk // Int J Biochem Cell Biol. -
2009. - Vol. 41, №12. - P. 2578-2587.
26. Mitchell A. Thyroid hormone export
from cells: contribution of P-
glycoprotein / A. Mitchell, M. Tom,
R. Mortimer // Endocrinol. - 2005. -Vol. 185, № 1. - P. 93-98.
27. Modulation of P-glycoprotein expression in hyperthyroid rat tissues / N. Ni-shio [et al.] // Journal of endocrinology.
- 2005. - Vol. 185. - P. 93-98.
28. N-glycosylation and deletion mutants of the human MDR1 P-glycoprotein / A.H. Schinkel [et al.] // J Biol Chem. -1993. - Vol. 268, №10. - P. 7474-7481.
29. O’Connor P. Clinical pharmacokinetics and endocrine disorders - therapeutic implication / P. O’Connor, J. Feely // Clin. Pharmacokinet. - 1987. - №13. -P. 435-364.
30. P-Glycoprotein (ABCB1) expression in human skin is mainly restricted to dermal components / C. Skazik [et al.] // Exp Dermatol. - 2011. - №3. -P. 1600-1625.
31. Rifampin and digoxin induction of MDR1 expression and function in human intestinal (T84) epithelial cells / I.S. Haslam [et al.] // Br J Pharmacol. -2008. - Vol. 154, №1. - P. 246-255.
32. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells / C. Lotz [et al.] // Oncol Rep. -2007. - Vol. 17, №1. - P. 239-244.
33. Schlachetzki F. P-glycoprotein and caveolin-1alpha in endothelium and astrocytes of primate brain / F. Schlachetzki, W.M. Pardridge // Neuroreport.
- 2003. - Vol. 14, №16. - P.2041-2046.
34. Subpopulations of normal peripheral blood and bone marrow cells express a functional multidrug resistant phenotype / D. Drach [et al.] // Blood. - 1992.
- Vol. 80, №11. - P. 2729-2734.
35. Targeting multidrug resistance in cancer / G. Szakacs [et al.] // Nat Rev Drug Dis-cov. - 2006. - Vol. 5, №3. - P. 219-234.
36. The Impact of Thyroid Disease on the Regulation, Expression, and Function of ABCB1 (MDR1/P Glycoprotein) and Consequences for the Disposition of Digoxin / O. Burk [et al.] // Clin Pharmacol Ther. - 2010. - Vol. 88, №5. -P. 685-694.
37. The importance of a nitrogen atom in modulators of multidrug resistance / G. Ecker [et al.] // Mol Pharmacol. -1999. - Vol. 56, №4. - P. 791-796.
38. The molecular biology of thyroid hormone action / R.C.J. Reibeiro [et al.] // Ann NY Acad Sci. - 1995. - Vol. 758.
- P. 366-389.
39. The structure and functions of P-gly coprotein / Y. Li [et al.] // Curr Med Chem. - 2010. - Vol. 17, №8. -P. 786-800.
40. Thyroid hormone export in rat FRTL-5 thyroid cells and mouse NIH-3T3 cells is carrier-mediated, verapamil-sensitive, and stereospecific / R. Cavalieri [et al.]
// Endocrinology. - 1999. - Vol. 140. -P. 4948-4954.
41. Thyroxine (T4) transfer from CSF to choroid plexus and ventricular brain regions in rabbit: contributory role of P-glycoprotein and organic anion transporting polypeptides / N. Kassem [et al.] // Brain Res. - 2007. - Vol. 1181. -P. 44-50.
42. Ueda K. Isolation and sequence of the promoter region of the human mul-tidrug-resistance (P-glycoprotein) gene / K. Ueda, I. Pastan, M.M. Gottesman // J Biol Chem. - 1987. - Vol. 262, №36.
- P. 17432-17436.
CHARACTERISTIC OF P-GLYCOPROTEIN AS A DRUG PEPTIDE TRANSROPTER
E.N. Yakusheva, I.V. Chernykh, A.S. Biruicova
Review characterizes the urgency of problem, chemical properties of P-glycoprotein substrates, structure, functions, localization of peptide transporter, factors influencing P-glycoprotein activity.
Елена Николаевна Якушева - д-р мед. наук, доц., зав. кафедрой фармакологии с курсом фармакотерапии ФПДО ГОУ ВПО РязГМУ Минздравсоцразвития России.
E-mail: [email protected].
