CC BY
50
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Якушева Е.Н., Черных И.В., 2013 УДК 616-001.8:616-008.9
ВЛИЯНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПОДОСТРОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ
ГЛИКОПРОТЕИНА-Р
Е.Н. Якушева, И.В. Черных
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань
В исследовании на кроликах изучено влияние экспериментальной подострой ги-побарической гипоксической гипоксии на функциональную активность АТФ-зависимого белка-транспортера гликопротеина-Р (Р§р). Активность Р§р оценивали по фармакокинетике его маркерного субстрата фексофенадина. Установлено, что подо-строе 4-часовое гипоксическое воздействие приводит к индукции активности Р§р.
Ключевые слова: гликопротеин-Р, ЫБК1, гипоксия, подострая гипобарическая ги-поксическая гипоксия, фексофенадин, транспортеры, фармакокинетика.
Современная фармакотерапия часто характеризуется полипрагмазией, что связано с увеличением доли пожилого населения и, как следствие, с ростом поли-морбидности. Возможность лекарственных взаимодействий при полипрагмазии в клинике часто недооценивается, что влечет за собой возникновение нежелательных явлений, таких как развитие побочного действия лекарственных средств или неэффективность фармакотерапии.
- это эффлюксный транспортер, контролирующий фармакокинетику различных соединений в физиологических и патологических условиях [9]. Белок осуществляет экстрацеллюлярный перенос липофильных экзогенных и эндогенных веществ через клеточные мембраны вне зависимости от их концентрационного градиента, что требует затраты энергии в форме АТФ. В связи с конститутивной экспрессией в тканях, широкой субстратной специфичностью, активным участием в кишечной секреции, почечной и желчной экскреции многих экзогенных соединений, формированием защитных свойств гисто-гематических барьеров Р^ играет важную роль в защите организма от потенциально
токсичных ксенобиотиков, их метаболитов, а также от эндогенных веществ [7].
Гипоксия - это типовой патологический процесс, осложняющий различные заболевания, определяющий в значительной степени тяжесть течения патологии и ее исход. Вне зависимости от провоцирующих факторов результирующим метаболическим сдвигом при гипоксии является недостаточность окислительно-восстановительных процессов и энергообеспечения тканей. Гипоксия сопровождает сердечно-сосудистые заболевания (сердечная недостаточность, гипертоническая болезнь), нарушения дыхательной функции (бронхиальная астма, хроническая обструктивная болезнь легких, пневмония) и другие расстройства, что особенно актуально для людей пожилого возраста. Состояние именно этой группы населения наиболее часто характеризуется полимор-бидностью, а, значит, и необходимостью назначать несколько лекарственных средств одновременно. Это, в свою очередь, повышает вероятность возникновения нежелательных лекарственных взаимодействий, связанных с нарушением функций белков-транспортеров.
В экспериментах на крысах установлено, что гипоксическое воздействие приводит к тканеспецифичному повышению экспрессии Pgp в сердце [5], к возрастанию уровня иРНК гена mdr1b, а также уровня самого транспортера [3]. В опытах на культурах клеток после воздействия умеренной гипоксии показано повышение активности Pgp, выявленное по ингибированию верапамилом эффлюкса дигоксина и родамина [4].
Однако при анализе научной литературы нами не было обнаружено информации об изучении функциональной активности Pgp при гипоксии в условиях целостного организма методом оценки фармакокинетики маркерных субстратов белка-транспортера.
Цель настоящего исследования -изучить влияние подострой гипобариче-ской гипоксической гипоксии на функциональную активность Pgp.
Материалы и методы
Работа выполнена на 6 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла, массой 3500-4300 г. Исследование влияния подострой гипобарической гипоксической гипоксии на функциональную активность Pgp проводили по анализу динамики плазменной концентрации фексофенадина -маркерного субстрата белка-транспортера.
Моделирование подострой гипобари-ческой гипоксической гипоксии осуществляли в барокамере с приточно-вытяжной вентиляцией при разряжении воздуха, эквивалентном подъему животных "на высоту" 6000 м. Г ипоксическому воздействию кроликов подвергали в течение 4 ч [6], "подъем" и "спуск" производили со скоростью 15 м/с.
За 4 суток до и сразу после гипоксиче-ского воздействия животным вводили фек-софенадин (Телфаст, Aventis Pharma, Италия) внутрижулудочно через зонд в дозе 67,5 мг/кг массы тела [1]. Пробы крови отбирали из краевой вены уха кролика в объеме 5 - 7 мл в гепаринизированные пробирки через 1,
2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 и 24 часа после однократного введения фексофенадина, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин, плазму хранили при -29°С до анализа [1].
Содержание фексофенадина в плазме крови определяли методом ВЭЖХ на
хроматографе «Стайер» (Россия) с ультрафиолетовым детектором и обращено-фазовой колонкой «Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм. Экстракцию и хроматографирование маркерного субстрата осуществляли по собственной методике, за основу которой был взят метод Раменской Г.В. с соавт. [2]. Анализ выполняли при длине волны 220 нм и скорости подвижной фазы 1 мл/мин. В качестве экстрагентов для жидкостной экстракции фексофенадина применяли дихлорметан (ACROS OrGANICS), этилацетат (ACROS ORGANICS) и диэтиловый эфир (ХИМ-МЕД). Коэффициент экстракции фексофе-надина из плазмы крови составлял 64 %.
Количественное определение фексофенадина проводили методом абсолютной калибровки по высоте пика. Калибровочная зависимость сигнала детектора от концентрации фексофенадина в диапазоне от 100 до 1000 нг/мл являлась линейной с коэффициентом корреляции 0,9974. Методика характеризовалась пределом обнаружения 50 нг/мл.
Определяли следующие фармакокинетические параметры: максимальная концентрация - Cmax (нг/мл), время достижения максимальной концентрации - Tmax (ч), период полувыведения T/2 (ч), площадь под фармакокинетической кривой "концентрация-время" от нуля до бесконечности и от нуля до последнего забора крови AUC0-M, AUC0-t (нг/мл)*ч, общий клиренс - Cl (л/ч), коэффициент абсорбции - Cmax/AUC0-t (1/ч) среднее время удерживания - MRT (ч), константа элиминации - Kel (1/ч).
Фармакокинетические параметры рассчитывали модельно-независимым методом с использованием программы Kinetica 5.0. Отношение Cmax/AUC0-t вычисляли самостоятельно. Экспериментальные данные были подвергнуты математико-статистической обработке с использованием офисного пакета «Microsoft Office XP» и программы Statistica 8.0. Характер распределения данных определяли по критерию Шапиро-Уилка. Наличие статистически достоверных меж-групповых различий определяли по t-критерию Стьюдента для связанных выборок в случае нормального распределения данных и по критерию Вилкоксона в случаях, когда
распределение данных отличалось от нормального. Полученные результаты представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего результата в случае нормального распределения данных или в виде медианы, верхнего и нижнего квартиля, если распределение данных отличалось от нормального.
Результаты и их обсуждение
Воздействие на кроликов подострой гипобарической гипоксической гипоксии, соответствующей «подъему на высоту» 6000 м в течение 4 ч., приводило к достоверному изменению фармакокинетики маркерного субстрата Pgp - фексофенадина. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Фармакокинетические параметры фексофенадина до и после гипоксического воздействия (М±т - при нормальном распределении данных; медиана, нижний и верхний квар-__________тиль - при распределении данных, отличном от нормального)____________
Изучаемые параметры Исходные значения п=6 Значения после гипоксического воздействия п=6
Стах, нг/мл 898,59±89,31 409,21±60,23*
Tmax, Ч 4,17±0,7 4,17±0,91
Тй, ч 9,49±1,13 6,32±1,17
ЛИСм , (нг/мл)хч 5628,98 (5392,28; 5817,93) 4227,25* (2647,26; 4557,88)
ЛИС0.о , (нг/мл)хч 7201,085 (6255,07; 7853,63) 4507,58* (2845,76; 4932,24)
С1, л/ч 31,055±3,084 62,29±9,38*
Стах/ЛИС0.ь 1/ч 0,15±0,018 0,11±0,011
МЯТ, ч 14,39±1,72 11,11±1,54*
Кі, 1/ч 0,078±0,0099 0,13±0,02
* - достоверные различия по сравнению с исходными данными (р<0,05)
Гипоксическое воздействие вызывало достоверное (р<0,05) снижение медиан значений ЛИС0-4 на 24,90%, ЛИС0-о на 37.40%, средних значений МЯТ на 22,79% и Стах на 54,46% по сравнению с исходными данными. Изменение средних значений Т1/2 и Стах/ЛИС0-4 не было статистически достоверным, однако наблюдалась тенденция к снижению показателей на 33,40% (р=0,056) и на 26,67%
(р=0,088), соответственно. Выявлено достоверное повышение среднего значения С1 на 100,58% (р<0,05) и тенденция к повышению среднего значения Ке1 на 66,67% (р=0,067). Ттах фексофенадина у кроликов до и после гипоксического воздействия не менялось (р>0,05).
В проведенном исследовании изучено воздействие гипоксии на функциональную активность Pgp. Достоверное снижение значений Стах, ЛиС0-м, ЛИС0-Ь МЯТЬ а также повышение значения С1 фексофенадина может служить доказательством индуци-
рующего влияния подострой гипобариче-ской гипоксической гипоксии в течение 4 часов на функциональную активность Pgp.
По данным научной литературы ги-поксическое воздействие способно изменить степень экспрессии и функциональную активность Pgp. Ранее было установлено, что двухнедельное воздействие на крыс интермиттирующей дыхательной гипоксии приводило к повышению степени экспрессии транспортера Pgp в сердце, к увеличению количества иРНК гена т^1а в печени и сердце, а также иРНК гена т^1Ъ в сердце [5]. По другим данным 48-часовое воздействие на крыс гипоксических условий (8% 02) вызывало статистически значимое возрастание уровня иРНК гена т^1Ъ, а также уровня самого транспортера. Уровень иРНК тМа не претерпевал изменений [3]. В опытах на культурах клеток после воздействия умеренной гипоксии в течение 48 и 24 часов наблюдалось повышение активности Pgp, выявленное по
изменению степени ингибирования вера-памилом эффлюкса дигоксина (культура эпителиальных клеток T84) и родамина 123 (культура эндотелиальных клеток Caco2) [4]. По данным эксперимента на культурах эпителиальных и эндотелиальных клеток, подвергавшихся гипоксиче-скому воздействию (инкубирование при парциальном давлении кислорода 20 мм рт. ст., углекислого газа - 35 мм рт. ст.), наблюдалось зависимое от продолжительности воздействия увеличение содержания мРНК гена MDR1 (в 2,2 и 7,1 раз по сравнению с контролем после 6 и 18 часов гипоксии, соответственно) и возрастание количества самого транспортера (максимальный уровень наблюдался после 48 часов гипоксического воздействия; дальнейшего возрастания уровня протеина после увеличения продолжительности гипоксии до 72 и 96 часов не наблюдалось) [4].
Существенную роль в процессе активации экспрессии гена MDR1 в условиях гипоксии отводится фактору, индуцируемому гипоксией (Hipoxia Inducible Factor - HIF-1) [4]. Данный фактор ответственен за транскрипционный ответ организма на гипоксию, включающий изменение выработки эритропоэтина, некоторых транспортеров глюкозы, ферментов гликолиза и цикла Кребса, метаболическую адаптацию, изменение сосудистого тонуса и неоангиогенеза [8].
Полученные нами данные дополняют представления о влиянии гипоксии на функциональную активность Pgp, т.к. установлено, что индукция функциональной активности белка-транспортера в условиях гипоксии достоверно изменяет у кроликов фармакокинетику маркерного субстрата Pgp
- фексофенадина. Таким образом, фармакотерапия заболеваний, сопровождающихся гипоксией, должна проводиться с учетом возможного изменения фармакокинетики лекарственных веществ-субстратов Pgp в результате индуцирующего влияния гипоксии на данный белок-транспортер.
Выводы
Воздействие на кроликов подострой гипобарической гипоксической гипоксии, соответствующей «подъему на высоту» 6000
м в течение 4 часов, приводит к индукции функциональной активности Pgp, определяемой по фармакокинетике его маркерного субстрата - фексофенадина, что подтверждается достоверным снижением Cmax, AUC0-t, AUC0-M, MRT и повышением Cl.
Литература
1. Колхир С.В. Клиническое значение изучения активности транспортера лекарственных средств гликопротеина-Р для оптимизации фармакотерапии: дис. ... канд. мед. наук / С.В. Колхир; ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова. - М., 2007. - 21 с.
2. Раменская Г.В. Разработка методики количественного определения маркера активности P-гликопротеина фексофенадина в плазме крови / Г.В. Раменская, Е.А. Скуридина, Л.М. Красных // Хим.-фармац. журн. - 2006. - Т. 40, №12. - С. 47-50.
3. Animal models of acute moderate hypoxia are associated with a down-regulation of CYP1A1, 1A2, 2B4, 2C5, and 2C16 and up-regulation of CYP3A6 and P-glycoprotein in liver / C. Fradette [et al.] // Drug Metab. Dispos. - 2007. - Vol. 35, №5. - P. 765-771.
4. Hypoxia-inducible Factor-1-dependent Regulation of the Multidrug Resistance / M. Katrina [et al.] // Gene Cancer Res. - 2002. -Vol. 62, №12. - P. 3387-3394.
5. Influence of intermittent hypoxia on myocardial and hepatic P-glycoprotein expression in a rodent model / J.M. Dopp [et al.] // Pharmacotherapy. - 2009. -Vol. 29, №4. - P. 365-372.
6. Pavlov A.D. RNA synthesis in rabbit and rat kidney under experimental changes in erythropoiesis / A.D. Pavlov, E.F. Morshchakova, N.M. Kalacheva // Haematologia (Budap). - 1978-1979. -Vol. 12, №1-4. - P. 149-158.
7. Tanigawara Y. Role of P-glycoprotein in drug disposition / T. Tanigawara // Ther. Drug. Monit. - 2000. - Vol. 22, №1. -P. 137-140.
8. The hypoxia-inducible transcription factor pathway regulates oxygen sensing in the simplest animal, Trichoplax adhaerens / C. Loenarz [et al.] // EMBO Rep. - 2011. - Vol. 12, №1. - P. 63-70.
9. The structure and functions of Med. Chem. - 2010. - Vol. 17, №8. -
P-glycoprotein / Y. Li [et al.] // Curr. P. 786-800.
THE INFLUENCE OF EXPERIMENTAL SUBACUTE HYPOBARIC HYPOXIA ON P-GLYCOPROTEIN FUNCTIONAL ACTIVITY
E.N. Yakusheva, I. V. Chernykh
In a study on rabbits the effect of the experimental subacute hypobaric hypoxic hypoxia on the functional activity of ATP-dependent protein transporter P-glycoprotein (Pgp) was studied. Pgp activity was assessed by pharmacokinetic of it’s marker substrate fexofenadine. It was found that 4-hour hypoxic action leads to Pgp induction.
Key words: glycoprotein-P, MDR1, hypoxia, subacute hypobaric hypoxic hypoxia, fexofenadine, transporters, pharmacokinetics.
Якушева Е.Н. - д.м.н., доц., зав. кафедрой фармакологии с курсом фармации и фармакотерапии ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России.
E-mail: [email protected].
Черных Иван Владимирович
E-mail: [email protected].
