CC BY
122
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 579.083.13
А. Б. Маргулис, О. В. Сиадат, Е. В. Никитина,
А. И. Колпаков, О. Н. Ильинская
ГОМОСЕРИНЛАКТОН КАК РЕГУЛЯТОР ИНДУЦИБЕЛЬНЫХ И КОНСТИТУТИВНЫХ
ФЕРМЕНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Ключевые слова: гомосеринлактон, гидролитические ферменты прокариот.
Показано, что гомосеринлактон, химический аналог плотностно-зависимых видоспецифических регуляторов, не являющийся генотоксикантом, увеличивает активность индуцибельной ß-галактозидазы Escherichia coli, не влияя на уровень ее биосинтеза. Химический агент коммуникации микроорганизмов гомосеринлактон не оказывает существенного влияния на активность гидролитических ферментов прокариот.
Keywords: homoserine lactone, hydrolytic enzymes of prokaryotes.
It is shown that homoserine lactone, nongenotoxic chemical analogue of density-dependent species-specific regulator, increases the activity of inducible fi-galactosidase of Escherichia coli, without affecting the level of its biosynthesis. Chemical agent of communication of microorganisms homoserine lactone has not significant effect on the activity of hydrolytic enzymes prokaryotes.
Введение
Серьёзной проблемой клинической практики является широкое распространение устойчивых форм микроорганизмов, снижающее эффективность применения антибактериальных препаратов. Особенную трудность представляет повышенная лекарственная устойчивость бактерий в биоплёнках. Для синтеза факторов вирулентности, антибиотиков и формирования биоплёнок бактерии часто используют реакции кворум-сенсинга. Поэтому изучение механизмов таких реакций открывает новые возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами, а также позволяет по-иному взглянуть на сложный комплекс межвидовых бактериальных взаимодействий в природных местах обитания микроорганизмов [1,2]. Известно, что низкомолекулярные химические вещества, относящиеся к классу ацильных производных лактона гомосерина, выступают в роли диффундирующих химических факторов коммуникации и используются в межвидовых взаимодействиях в качестве сигнальных агентов, индуцирующих экспрессию ряда генов [3]. Местом действия сигнальных молекул, обеспечивающих межвидовую коммуникацию прокариот, по-видимому, являются клеточные ферменты. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция
метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций.
Ранее нами было показано, что гомосеринлактон не обладает токсическими эффектами в диапазоне концентраций от 10 до 1000 мкг/мл. В тесте Эймса с использованием мутантного штамма Salmonella typhimurium TA 100 мутагенной активности выявлено не было. В тесте на повреждение ДНК гомосеринлактон не проявил ни токсического, ни генотоксического (прямого ДНК-повреждающего) действия. Фактор индукции SOS-
ответа для гомосеринлактона в концентрациях от 10 до 100 мкг/мл были значительно ниже порогового значения, что также указывает на отсутствие генотоксических свойств этого препарата [5]. Кроме того, нами установлено, что гомосеринлактон участвует в индукции перехода некоторых штаммов микроорганизмов (B. subtilis Spo0E) в некультивируемое состояние [6]. Однако механизмы действия плотностно-зависимого регулятора гомосеринлактона как индуктора
гипометаболического состояния пока остаются неизвестными. Можно предполагать, что при общем снижении интенсивности метаболизма и подавлении экспрессии многих генов, имеет место активация некоторых конститутивных гидролитических ферментов, важных для перехода клетки к новому физиологическому состоянию. В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилась оценка возможности гомосеринлакона изменять активность и биосинтез гидролитических ферментов прокариот на примере Р-галактозидазы,
регулируемой SOS-опероном, и щелочной фосфатазы Escherichia coli PQ 37, секретируемой протеазы B. subtilis JB20-36, а также РНКазы B. intermedius для определения скорости ферментативной реакции разложения РНК в присутствии гомосеринлактона.
1. Материалы и методы исследования
В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов: E. coli PQ 37 с генотипом Sfi A::mud (Ap lac) cts, lac A U169, mat, uvr A, gal Y, pho
C, rfa (Институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск) и Bacillus subtilis JB20-36 с генотипом pCM4 (Институт молекулярной биологии, Москва). В качестве сигнальной молекулы кворум-эффекта для бактериальных систем применяли неацилированный гомосеринлактон (Aldrich, Германия) в концентрациях 5, 10, 50 и 100 мкг/мл.
Разведения исследуемого вещества готовили в стерильной дистиллированной воде.
Для определения активности щелочной фосфатазы культуру бактерий E. coli PQ 37 выращивали в течение 18 часов при температуре 370С вместе с гомосеринлактоном. Гомосеринлактон также добавляли непосредственно в реакционную смесь без предварительной инкубации. По конститутивному уровню экспрессии щелочной фосфатазы определяли влияние исследуемого
соединения на выживаемость клеток [7].
Негативным контролем служила активность щелочной фосфатазы в культуре бактерий, выросших в течение 18 часов без добавления исследуемого вещества, отражающая базовый уровень активности фермента. За единицу
активности фермента принимали его количество, вызвавшее увеличение его оптической плотности при длине волны 630 нм на 1 единицу за 1 час.
Определение активности ß-галактозидазы у штамма E. coli PQ 37 в присутствии гомосеринлактона вели по методике Quillardet с соавторами [7]. Негативным контролем служила активность ß-галактозидазы в культуре бактерий, выросших в течение 12 часов без добавления исследуемого вещества, отражающая базовый уровень активности фермента. Индуцибельный уровень регистрировали в этой же культуре спустя 3 часа после добавления митомицина С. За единицу активности фермента принимали его количество, вызвавшее увеличение его оптической плотности при длине волны 630 нм на 1 единицу за 1 час.
Протеолитическую активность определяли, используя в качестве субстрата казеин. Казеин в концентрации 2% растворяли в 0,1 М Tris-HCl буфере, рН 9,0. В первом опытном варианте длительность инкубации с исследуемым веществом составляла 18 часов, во втором - 3 часа. Делали смыв культуры Bacillus subtilis JB20-36 со скошенного агара дистиллированной водой. Затем культуру центрифугировали 20 мин при 5000 об/мин [8]. 1мл супернатанта инкубировали 5 мин на водяной бане при 37°С. То же самое проделывали с 1 мл казеина. Затем казеин приливали к супернатанту и тщательно перемешивали. Смесь из 1 мл казеина и 1мл супернатанта инкубировали 15 мин при 37°С, затем добавляли 2 мл 5%-ной ТХУ, перемешивали и инкубировали при той же температуре еще 20 мин. Смесь пропускали через плотный фильтр. Отбирали 1 мл фильтрата и добавляли к нему 5 мл 6% Na2CO3 и 1 мл 0,6н реактива Фолина. Смесь ставили на 20-30 мин в темноту для полного проявления окраски, а затем измеряли оптическую плотность при длине волны 630 нм на спектрофотометре СФ-34. Параллельно ставили контроль на субстрат следующим образом: смешивали 1 мл супернатанта и 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали 20 мин при 370С, после чего добавляли 1 мл 2%-ного казеина и выдерживали еще 15 мин при той же температуре. Смесь фильтровали. С фильтратом поступали как описано выше. За единицу активности фермента принимали его
количество, вызвавшее увеличение его оптической плотности при длине волны 630 нм на 1 ед. за 1 час.
Определение скорости ферментативной реакции с РНКазой проводили на автоматическом спектрометре Х-35. Реакцию проводили в кварцевых кюветах, куда помещали 1.98 мл раствора РНК в буфере (50 мкг/мл), затем добавляли в опытную фермент (0,01 нг/мл) и вещество в исследуемой концентрации в количестве 20 мкл. Затем измеряли светопоглощение реакционной смеси по сравнению с контрольным раствором при длине волны 260 нм. Скорость ферментативной реакции оценивали по тангенсу угла наклона прямолинейного восходящего участка кривой зависимости светопоглощения от времени и выражали в увеличении поглощения за 1 мин на 1 мг белка.
Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов в компьютерной программе ”Microsoft-Excel”.
2. Результаты исследования
Известно, что ß-галактозидаза штамма E. coli PQ 37 находится под промотором SOS-оперона и синтезируется в ответ на сигнал, представляющий собой появление одноцепочечной и частично фрагментированной ДНК вследствие действия сильных ДНК-повреждающих агентов [7]. В нашу задачу входило выяснить, может ли
гомосеринлактон как сигнальная молекула, вызывающая активацию многих оперонов, включить гены SOS-оперона. Было установлено, что гомосеринлактон, добавленный непосредственно в реакционную смесь, вызывал изменение активности фермента, увеличивая ее в среднем в 5 раз, то есть являлся эффектором белка ß-галактозидазы. При этом уровень экспрессии генов SOS-оперона при совместном добавлении гомосеринлактона и митомицина С оставался фоновым, то есть гомосеринлактон блокировал их экспрессию. Увеличение времени инкубации (рисунок 1) должно было бы привести к увеличению биосинтеза ß-галактозидазы, если гомосеринлактон является индуктором SOS-оперона.
Однако это не было зарегистрировано, что подтверждается данными SOS-хромотеста об отсутствии индукции SOS-ответа
гомосеринлактоном [5]. Отсюда следует, что гомосеринлактон вызывает блокирование экспрессии генов SOS-оперона, но при этом оказывает активирующее влияние непосредственно на активность фермента ß-галактозидазы.
Нами была оценена способность гомосеринлактона оказывать влияние на активность щелочной фосфатазы E. coli PQ 37, протеазы B. subtilis JB20-36, а также РНКазы B. intermedius. Эксперименты с щелочной фосфатазой показали, что гомосеринлактон в концентрации 10 мкг/мл не влияет на активность данного фермента, а в концентрации 50 мкг/мл увеличивает ее приблизительно в 2 раза по сравнению с контролем.
0,6 -|
0,5 -
0,4 -
0,3 -
s
M
0
¡2 Л
4 Л u
1
5
8 0,1
0,2 -
пшяп
Рис. 1 - Влияние гомосеринлактона на
активность р-галактозидазы «+» - инкубация культуры с добавлением митомицина С в течение трех часов
Концентрационно-зависимое повышение активности щелочной фосфатазы при добавлении гомосеринлактона непосредственно в реакционную смесь позволяет судить об исследуемом веществе как о модуляторе фермент-субстратного
взаимодействия. При оценке действия гомосеринлактона на биосинтез щелочной фосфатазы время инкубации было увеличено до 18 часов (рис. 2). При обработке клеток
гомосеринлактоном в течение 18 часов в концентрации 50 мкг/мл активность щелочной фосфатазы примерно в 3 раза превысила контрольную. Следовательно, гомосеринлактон активирует биосинтез щелочной фосфатазы -конститутивного фермента бактерий.
s 15
з К О р §
§ 10
н
К V о
5 й В *
л « н tu о
2 й
Д со И св
я й
Н cö
5
0
Рис.
10 50
Влияние гомосеринлактона
на
активность щелочной фосфатазы E. coli PQ 37
Зависимость активности протеаз от концентрации гомосеринлактона, входившего в состав инкубационной смеси (Н2О, клетки, гомосеринлактон), у B. subtilis представлена на рис. 3.
В малых концентрациях (5-10 мкг/мл) гомосеринлактон увеличивал активность протеазы
B. subtilis в среднем в 2.47 раза. Установлено, что базовый уровень активности протеазы составляет
0.02 единицы, что говорит, вероятно, о низкой интенсивности биосинтеза или секреции данного фермента.
tu
tu
н
о
а
в
л
н
о
о
к
и
К
н
о
о
к
и
К
н
W
0,08 -
0,06 -
0,04 -
0,02 -
П
п
Рис. 3
Влияние гомосеринлактона на
активность протеазы В. subtilis 1В20-36
Если культуры, находящиеся в конце логарифмической фазы роста, инкубировали 3 часа в присутствии гомосеринлактона, активность
протеазы возрастала незначительно. Увеличение времени инкубации с гомосеринлактоном до 18 часов, в течение которых гомосеринлактон постоянно присутствовал в среде, вызывало возрастание активности протеазы; при этом
индуцирующая способность гомосеринлактона проявлялась в концентрациях до 10 мкг/мл. Более высокие концентрации снижали активность
фермента. Если бы гомосеринлактон усиливал секрецию протеаз, вероятно, с увеличением концентрации активность фермента в среде возрастала бы. Однако этого не наблюдалось (рис. 3). Сравнение динамики ферментативной активности РНКазы B. intermedius показало, что для необработанного фермента величина активности, определенная по тангенсу угла наклона прямого участка восходящей кривой зависимости светопоглощения от времени, составила 0,25 единицы (рис. 4).
.Ny*
jfi
li
vVli
4M]
Рис. 4 - Регистрация поглощения продуктов гидролиза дрожжевой РНК биназой в течение 5 минут
При воздействии различных концентраций гомосеринлактона значения активности РНКазы не менялись, что позволяет сделать вывод об отсутствии влияния гомосеринлактона на активность РНКазы в исследуемых концентрациях (10 и 50 мкг/мл). Для удаления
высокомолекулярных продуктов гидролиза РНК производили осаждение дрожжевой РНК равным по отношению к реакционной смеси объемом 0.02М
MgCl2 в 96% этаноле [9], однако изменения количества низкомолекулярных нуклеотидов по сравнению с рисунком 4 не наблюдалось. При длине волны 280 нм (длина волны, соответствующая светопоглощению нуклеотидов) интенсивность
светопоглощения не отличалась от контрольных значений в независимости от концентрации гомосеринлактона и времени инкубации.
3. Обсуждение результатов
Таким образом, можно сделать вывод, что
плотностно-зависимый регулятор гомосеринлактон оказывает влияние на активность некоторых ферментов прокариот (Р-галактозидазы, щелочная фосфатаза, протеазы), однако практически не влияет на активность РНКазы. Показано также, что гомосеринлактон активирует биосинтез щелочной фосфатазы - конститутивного фермента бактерий. Пролонгированное действие индуктора, приводящее к возрастанию активности фермента,
свидетельствует о влиянии гомосеринлактона на процесс биосинтеза протеаз. Добавление гомосеринлактона непосредственно в реакционную смесь не привело к изменению активности протеаз, что означает отсутствие эффекторных свойств гомосеринлактона по отношению к данному
ферменту. Индукция биосинтеза протеолитических ферментов бактерий, показанная нами при действии гомосеринлактона в течение 18 часов при
концентрациях 5-10 мкг/мл, позволяет
предположить, что эта сигнальная молекула может индуцировать протеолиз белков клеток хозяина при инфекционных заболеваниях.
Недавние исследования in vitro показали, что ацилированные лактоны гомосерина могут самостоятельно выступать в качестве факторов вирулентности посредством модификации продукции цитокининов эукариотическими клетками, а также стимуляции расширения
кровеносных сосудов. Имеются данные о влиянии гомосеринлактона на сердечно-сосудистые функции крыс. Особое внимание уделяется способности N-(3-оксододеканоил)-Ь-лактона гомосерина, сигнальной молекулы, продуцируемой Pseudomonas aeruginosa, вызывать брадикардию. Более того, модификация длины ацильного радикала приводит к снижению активности, а при удалении гомосеринового лактонного кольца такого не наблюдается. Эти сведения подтверждают гипотезу, что некоторые сердечно-сосудистые осложнения бактериальных инфекций могут быть модулированы влиянием
сигнальных молекул систем "quorum-sensing" на
клетки хозяина [10].
Работа выполнена при финансовой поддержке
Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной
России» (ГК 14.740.11.1040).
Литература
1. Грузина, В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий / В.Д. Грузина // Антибиотики и химиотерапия.- 2003.-№48 (10).- С. 32-39.
2. Завильгельский, Г.Б. "Quorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом / Г.Б. Завильгельский, И.В. Манухов // Молекулярная биология.- 2001.- Т.35.- N 2.- С. 268-277.
3. Fuqua, W.C. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators / W.C. Fuqua, S.C. Winans, E.P. Greenberg // J. Bacteriol.-1994.- V. 176.- P. 269-275.
4. Лещинская, И.Б. Нуклеазы бактерий / И.Б. Лещинская, В.П. Варламов, Б.М. Куриненко // Казань: КГУ.- 1991. -317 с.
5. Маргулис, А.Б. Генотоксические эффекты микробного
сигнального агента - гомосеринлактона / А.Б. Маргулис, О.В. Бушманова, И.В. Ожиганова, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская // Ученые записки Казанского государственного университета.- Т.148.- Серия
Естественные науки.- Кн.2.- 2006.-С.83-89.
6. Маргулис, А.Б. Индукция гипометаболических форм у неспорообразующих грамположительных бактерий / А.Б. Маргулис, О.Н. Ильинская, А.И. Колпаков, К. Муфер // Ученые записки Казанского государственного университета.- Т.147.- Серия Естественные науки.-Кн.2.- 2005.- С.108-114.
7. Quillardet, P. SOS-chromotest, a direct assay of a SOS-function in Escherichia coli K12 to measure genotoxity / P. Quillardet, O. Huisman, R. D Ari, M. Hofnung // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1982. -V. 79. -P. 5971-5975.
8. Маргулис, А.Б. Влияние хлорпроизводных 2(5Н)-фуранона на жизнеспособность бактериальных клеток / А.Б.Маргулис, А.Р.Курбангалиева, Н.В.Белоногова, Л.З.Латыпова, В.Я.Пономарев, Э.Н.Хакимуллина, Е.Ю.Тризна, М.И.Богачев, А.Р.Каюмов // Вестник Казанского технологического университета.- 2012.- Т. 15, №15.- С. 220-224.
9. Колпаков, А.И. Оптимизация метода определения активности РНКазы с использованием высокополимерной РНК / А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская // Клиническая лабораторная диагностика.-1999.- N 5.- С.14-16.
10. Gardiner, S.M. Haemodynamic effects of the bacterial quorum sensing signal molecule, N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, in conscious, normal and endotoxaemic rats / S.M. Gardiner, S.R. Chhabra, C. Harty, P. Williams,
D.I. Pritchard, B.W. Bycroft, T. Bennett // Br. J. Pharmacol.- 2001.- N 133(7).- P. 1047-54.
© А. Б. Маргулис - канд. биол. наук, доц. каф. микробиологии КФУ, [email protected]; О. В. Сиадат - науч. сотр. отделения молекулярной генетики Института биологии университета имени Альберта Людвига, г. Фрайбург, [email protected]; Е. В. Никитина - канд. биол. наук, доц. каф. технологии пищевых производств КНИТУ, [email protected];А. И. Колпаков - канд. биол. наук, ст. науч. сотр., зав. лаб. НИЛ ББФ КФУ, [email protected]; О. Н. Ильинская - д-р биол. наук, зав. каф. микробиологии КФУ, [email protected].
