CC BY
1
ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВ. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, ФАРМАКОГНОЗИЯ. ОРГАНИЗАЦИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО ДЕЛА
DOI: https://doi.Org/10.22263/2312-4156.2024.4.113
Гистологическая характеристика регенерации тканей при лечении экспериментальной плоскостной раны гелями на основе листьев ольхи черной и листьев ольхи серой
О.В. Мушкина1, Н.С. Гурина1, А.Ю. Крылов2
белорусский государственный медицинский университет, г. Минск, Республика Беларусь 2Институт повышения квалификации и переподготовки кадров Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь, г. Минск, Республика Беларусь
Вестник ВГМУ. - 2024. - Том 23, №4. - С. 113-122.
Histological characteristics of tissue regeneration during treating an experimental plane wound with gels based on the leaves of black alder and the leaves of gray alder
O.V. Mushkina1, N.S. Gurina1, A.Yu. Krylov2 1Belarusian State Medical University, Minsk, Republic of Belarus
institute for advanced training and retraining of the investigative committee of the Republic of Belarus, Minsk, Republic of Belarus
Vestnik VGMU. 2024;23(4): 113-122.
Резюме.
Цель работы - гистологический анализ раневых дефектов кожи крыс при лечении гелями на основе настоек из листьев ольхи черной и ольхи серой.
Материал и методы. Для оценки регенеративных свойств листьев ольхи черной и ольхи серой на модели плоскостной полнослойной кожной раны использовано 6 серий полученных нами гелей. Четыре серии фитогелей: две - содержащие настойки из листьев ольхи серой (на основе 30% и 70% спирта этилового) и две - настойки из ольхи черной (на основе 30% и 60% спирта этилового). В качестве плацебо - две серии без растительных настоек. В качестве препаратов сравнения использовали 5% гель декспантенола и мазь репарэф-2. Исследование было выполнено на 81 белой крысе-самце линии Wistar. На выбритом от шерсти участке спины крыс иссекали кожу с подкожной клетчаткой. Раны оставляли открытыми и со второго дня эксперимента ежедневно обрабатывали их
1 раз в сутки. Гистологическое исследование производили на 5, 9 и 13 сутки эксперимента. Забор материала проводили путем иссечения рубцовой ткани и прилежащего края раны. Полученный материал был зафиксирован в 10% формалине, обезвожен в спиртах восходящей плотности, залит в парафин, затем из него были изготовлены микропрепараты, окрашенные гематоксилином и эозином.
Результаты. Результаты морфологического исследования показали, что использованные фитогели стимулируют пролиферативную и функциональную активность клеток грануляционной ткани. При этом гель, содержащий настойку листьев ольхи черной на основе 60% спирта, проявлял максимальную эффективность. Заключение. Динамика морфологической картины ран, обрабатываемых фитогелями и мазью репарэф-2, указывала на их четко выраженное ранозаживляющее действие, в то время как морфологическая характеристика тканевых дефектов, обрабатываемых гелями-плацебо, соответствовала таковой в контрольной группе. Ключевые слова: ольха черная, ольха серая, гели, раны, гистологические препараты.
Abstract.
Objectives. To make a histological analysis of wound defects of the skin of rats during treatment with gels based on tinctures of black alder and gray alder leaves.
Material and methods. For assessing the regenerative properties of black alder and gray alder leaves on a model of a planar full-thickness skin wound, we used 6 series of gels, which had been prepared previosly. Four series of phytogels:
two of them containing tinctures of gray alder leaves (based on 30% and 70% ethyl alcohol) and two containing tinctures of black alder leaves (based on 30% and 60% ethyl alcohol). Two series without herbal tinctures served as a placebo. 5% dexpanthenol gel and Reparef-2 ointment were used as comparison drugs. The study was performed on 81 white male Wistar rats. The skin and subcutaneous tissue were excised from an area of the rats' backs shaved from fur. The wounds were left open and beginning with the second day of the experiment they were treated daily once a day. Histological examination was carried out on the 5th, 9th and 13th days of the experiment. The material was collected by excision of scar tissue and the adjacent wound edge. The obtained material was fixed in 10% formaldehyde, dehydrated in alcohols of increasing density, embedded in paraffin, and then microslides were made from it, stained with hematoxylin and eosin. Results. The results of the morphological study showed that the phytogels used stimulate the proliferative and functional activity of granulation tissue cells. At the same time, the gel containing a tincture of black alder leaves based on 60% alcohol showed maximum effect.
Conclusions. The dynamics of the morphological picture of wounds treated with phytogels and Reparef-2 ointment indicated their clearly expressed wound-healing effect, while the morphological characteristic of tissue defects treated with placebo gels corresponded to that in the control group. Keywords: black alder, gray alder, gels, wounds, histological preparations.
Введение
Раны - одно из самых распространенных травматических повреждений, частота которых постоянно возрастает в связи с увеличением количества стихийных бедствий, производственных и бытовых травм, военных конфликтов. Поэтому проблема регенерации раневых повреждений и поиск новых лекарственных средств для ее решения является актуальной задачей современной медицины [1, 2]. Разработка местных ранозажив-ляющих средств растительного происхождения - перспективное направление, так как фитоэк-стракты содержат разнообразные по химическому строению биологически активные вещества, оказывающие широкий спектр фармакологической активности. Полифенольные соединения растительного происхождения (флавоноиды, дубильные вещества, фенолкарбоновые кислоты и др.) обладают противовоспалительным, антимикробным и антиоксидантым действием. Использование местных ранозаживляющих средств, содержащих антиоксиданты, способствует сокращению времени заживления ран. С активными формами кислорода взаимодействуют неферментативные и ферментативные антиоксиданты. При этом низкомолекулярные соединения, например глутатион, убихинон, витамин С (аскорбиновая кислота), витамин Е, каротиноиды и фенольные соединения, функционируют как неферментативные антиоксиданты [3].
Регенерация раны включает в себя три фазы: I - фаза воспаления; II - фаза регенерации; III -фаза организации рубца. Заживление ран в коже инициируют фибробласты, которые образуют
временную тканевую матрицу. За этим следует воспаление и повторная эпителизация керати-ноцитами. Дальнейшая реваскуляризация раны, наряду с образованием внеклеточного матрикса, ангиогенезом и ремоделированием, завершается заживлением и восстановлением раны. Морфологически выделяют три фазы клеточных реакций, в зависимости от преобладания отдельных видов клеток: лейкоцитарную, макрофагальную и фибробластическую. Для регенерации раны характерен сложнейший клеточный состав, который может служить прогностическим критерием оценки процесса заживления [4].
Цель работы - гистологический анализ раневых дефектов кожи крыс при лечении гелями на основе настоек из листьев ольхи черной и серой.
Материал и методы
Для оценки регенеративных свойств листьев ольхи черной и ольхи серой на модели плоскостной полнослойной кожной раны использовано 6 серий полученных нами гелей. Четыре серии фи-тогелей, содержащие настойки из листьев ольхи серой или черной и две серии - гелей-плацебо (табл. 1) [5, 6]. В качестве препаратов сравнения использовали 5% гель декспантенола и мазь ре-парэф-2.
Исследование было выполнено на 81 белой крысе-самце линии Wistar, массой 180,0+20,0 г, прошедших карантин в виварии УО БГМУ. Все животные содержались в стандартных условиях. Животным под наркозом после депиляции волосяного покрова моделировались плоскостные полнослойные круглые кожные раны. На выбри-
Таблица 1 - Составы экспериментальных гелей
Серия геля Состав
Действующее вещество Вспомогательные вещества
Серия 0Ч60 Настойка листьев ольхи черной на основе 60% спирта этилового вода, этилендиаминтетраацетат, карбомера, макрогола, пропиленгликоля, диэтаноламина
Серия 0Ч30 Настойка листьев ольхи черной на основе 30% спирта этилового гидроксипропилметилцеллюлоза
Серия 0С70 Настойка листьев ольхи серой на основе 70% спирта этилового вода, этилендиаминтетраацетат, карбомера, макрогола, пропиленгликоля, диэтаноламина
Серия 0С30 Настойка листьев ольхи серой на основе 30% спирта этилового гидроксипропилметилцеллюлоза
Серия П70 Спирт этиловый 70% вода, этилендиаминтетраацетат, карбомера, макрогола, пропиленгликоля, диэтаноламина
СерияП30 Спирт этиловый 30% гидроксипропилметилцеллюлоза
Таблица 2 - Группы экспериментальных животных
Группа животных Препараты, которыми обрабатывали раны
1-я (контрольная) 0,9% раствором №С1
2-я гель 0Ч60
3-я гель 0Ч30
4-я 5% гель декспантенол
5-я мазь репарэф 2
6-я гель 0С70
7-я гель 0С30
8-я гель П70
9-я гель П30
том от шерсти участке спины без соблюдения стерильных условий иссекали хирургическими ножницами кожу с подкожной клетчаткой. Раны оставляли открытыми, со второго дня эксперимента обрабатывали их 1 раз в сутки исследуемыми препаратами. Животные были разделены на 9 групп по 9 животных в группе в зависимости от препарата, которым осуществлялась обработка ран (табл. 2).
Гистологическое исследование производили на 5, 9 и 13 сутки эксперимента. Животных выводили из эксперимента путем передозировки фторотана. Забор материала проводили путем иссечения рубцовой ткани и прилежащего края раны. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей проводкой по восходящим спиртам в процессоре карусельного типа Leika ТР 1020 и заливкой в парафин по стандартной методике. Полученные блоки резали на микротоме (Leika RT), толщина срезов 3-5 мкм. Депарафинизация срезов. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином в аппарате Leika ST
5010, затем накрывали покровными стеклами. Микроскопический анализ проводили на гисто-скане MoticEasyscan [7].
При проведении экспериментального исследования соблюдались принципы биоэтики в соответствии со следующими регламентирующими документами: «Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» [8-11]. Перед проведением эксперимента протокол исследования был утвержден на заседании этической комиссии УО «Белорусский государственный медицинский университет».
Результаты и обсуждение
Гистологические исследования показали, что на 5 сутки эксперимента во всех группах имеются участки кожи с дефектом многослойного плоского эпителия (эпидермиса): очаг некроза с выраженной воспалительной инфильтрацией (рис. 1), в воспалительном инфильтрате преобладают сег-
Рисунок 1 - Участки кожи с раной - очаг некроза Рисунок 2 - В воспалительном инфильтрате
с выраженной воспалительной инфильтрацией, преобладают сегментоядерные лейкоциты (а),
распространяющейся до жировой клетчатки. Ув. х4 тучные клетки (б), плазмоциты (в). Ув. х20
Рисунок 3 - Формирование микроабсцессов в ране. Ув. х10
Рисунок 4 - Морфологические изменения дефекта контрольной группы на 9 сутки. Ув. х10
Рисунок 5 - Участки хорошо сформированной грануляционной ткани. Ув. х10
Рисунок 6 - 0чаги продуктивного воспаления с наличием гигантских многоядерных клеток (а). Ув. х 20
¡¡Ё£ жязя
Рисунок 7 - края раны, определяется молодой эпидермис (а), под ним зрелая грануляционная ткань (б). Ув. х10
Рисунок 8 - Морфологические изменения в группе 3 на 9 сутки. Ув. х10
Рисунок 9 - Морфологические изменения дефекта группы 6 на 9 сутки. Ув. х10
ментоядерные лейкоциты (рис. 2), тучные клетки, плазмоциты, что свидетельствует о хроническом гнойном воспалении. Наблюдается формирование грануляционной ткани. Воспалительный инфильтрат распространяется до жировой клетчатки. Кроме того, в группе 3 наблюдалось формирование микроабсцессов в ране (рис. 3).
На 9 сутки в контрольной группе наблюдался дефект эпидермиса с гнойно-некротическими изменениями, очагами кровоизлияний и плазмор-рагиями. (рис. 4). Во второй группе животных, обрабатываемых гелем серии 0Ч60, отмечалось формирование зрелой грануляционной ткани в глубоких отделах (рис. 5), очаги продуктивного воспаления с наличием гигантских многоядерных клеток
(рис. 6). На границе с очагом некроза отмечалась молодая грануляционная ткань, в глубоких отделах - зрелая. В краях раны определялся молодой эпидермис, под ним зрелая грануляционная ткань (рис. 7). В группах 3 (использовался гель серии 0Ч30), 6 (использовался гель серии 0С70) и 7 (использовался гель серии 0С30) на 9 сутки морфологические изменения сходны со второй группой, однако гнойно-некротические изменения выражены в большей степени (рис. 8, 9, 10). На 9 сутки в группе 6 более выражены гнойно-некротические изменения по сравнению с группами 2 и 3 (рис. 9).
На 9 сутки в группе животных 4, у которых раны обрабатывались декспантенолом, отмечалось наличие некроза, отсутствует многослой-
Рч • • ' ' й* .■- '-' "Й- -■''V ■ ■
- Эн . ~ * ч^ЬГ.- . СТ., '.■- ~ -ггт. ~ ^* . ^*- 1 а^Г
Рисунок 10 - Морфологические изменения дефекта группы 7 на 9 сутки Ув. х10
ный плоский эпителий (рис. 11). В группе 5 (рис. 12) наблюдалось появление эпителизации в краях раны. В группах 8 и 9 эпителизация отсутствовала, определялись гнойно-некротические изменения и формирование молодой грануляционной ткани (рис. 13, 14).
На 13 сутки у животных контрольной группы наблюдался дефект эпидермиса, признаки хронического воспаления с обострением (нейтрофилы и лимфоциты в большом количестве) (рис. 15). В группе 2 многослойный плоский эпителий покрывает грануляционную ткань, что не наблюдалось в контрольной группе 1 (рис. 16, 17). В этот же период эксперимента в ранах третьей группы животных наблюдался процесс эпителизации, но
Рисунок 11 - Морфологические изменения дефекта группы 4 на 9 сутки. Ув. х10
Рисунок 12 - Морфологические изменения дефекта группы 5 на 9 сутки. Ув. х10
Рисунок 13 - Морфологические изменения дефекта Рисунок 14 - Морфологические изменения дефекта группы 8 (отсутствие эпителизации, гнойно- группы 9 на 9 сутки
некротические изменения). Ув. х10 (эпителизация отсутствует, определяются гнойно-
некротические изменения). Ув. х10
Рисунок 15 - Дефект эпидермиса, признаки Рисунок 16 - Морфологические изменения дефекта у
хронического воспаления с обострением, нейтрофилы группы 2 на 13 сутки. Ув. х10
и лимфоциты в большом количестве. Ув. х10
Рисунок 17 - Эпителизация с паракератозом многослойного плоского эпителия. Ув. х10
Рисунок 18 - Морфологические изменения дефекта у группы 3 на 13 сутки. Ув. х20
более выражены гнойно-некротические изменения по сравнению со второй группой (рис. 18). Аналогичная картина наблюдалась в ранах, обрабатываемых фитогелями, содержащими настойки на основе листьев ольхи серой (рис. 19, 20).
На 13 сутки в 5 группе животных рана была представлена зрелой грануляционной и фиброзной тканью (формируется рубец). Дефект практически полностью покрыт многослойным плоским эпителием (рис. 21). В 4 группе животных определялись очаги кровоизлияний, грануляционная
ткань разной степени зрелости, что свидетельствовало о замедленных процессах репарации по сравнению с группами 2 и 3 (рис. 22). В группе 8, где раны обрабатывались гелем-плацебо № 5, на 13 сутки грануляционная ткань без эпителизации по сравнению с группой 2, 5 и 6 в эти же сутки (рис. 23). На 13 сутки в ранах животных группы 9, обрабатываемых гелем-плацебо № 6, сохранялись гнойно-некротические изменения, грануляционная ткань была развита слабо, по сравнению с группой 3 и 7 (рис. 24).
Рисунок 19 - Морфологические изменения дефекта у группы 6 на 13 сутки. Ув. х10
Рисунок 20 - Морфологические изменения дефекта группы 7 на 13 сутки. Ув. х10
Рисунок 21 - Дефект практически полностью покрыт Рисунок 22 - очаги кровоизлияний (а), грануляционная многослойным плоским эпителием. Ув. х10 ткань разной степени зрелости. Ув. х10
Рисунок 23 - Морфологические изменения у группы 8 на 13 сутки. Ув. х10
Рисунок 24 - Морфологические изменения группы 9 на 13 сутки. Ув. х10
Заключение
Гистологическое изучение раневого процесса показало, что разработанные гели на основе спиртовых настоек из листьев ольхи черной и серой обладают хорошо выраженным стимулирующим эффектом на пролиферативную и функциональную активность клеток грануляционной ткани, который со временем возрастает. При этом гель на основе 60% спиртовой настойки из листьев ольхи черной проявлял максимальную эффективность по сравнению с остальными фитопрепаратами, морфологически сходные картины наблюдались у животных, обрабатываемых данным гелем и препаратом сравнения - мазью репарэф-2. Морфологическая картина изменений дефектов, обрабатываемых гелями-плацебо, соответствовала изменениям контрольной группы и отличалась от дефектов, обрабатываемых фи-тогелями и мазью репарэф 2, которые проявляли ранозаживляющее действие.
Литература
1. Гистохимическая характеристика восстановительных процессов при заживлении ран / А. А. Глухов [и др.] // Фундам. исслед. 2013. № 7, ч. 1. С. 55-60.
2. Ранозаживляющее действие экстракта зубчатки обыкновенной / А. В. Бодоев [и др.] // Вестн. Бурятского гос. ун-та. Медицина и фармация. 2009. № 12. С. 30-32.
References
1. Glukhov AA, Frolov RN, Alekseeva NT, Andreev AA. Histochemical characterization of regenerative processes during wound healing. Fundam Issled. 2013;(7 ch 1):55-60. (In Russ.)
2. Bodoev AV, Shantanova LN, Alekseev PV, Ubasheev IO. Wound-healing effect of common clove extract. Vestn Buryatskogo Gos Un-ta Meditsina Farmatsiya. 2009;(12):30-2. (In Russ.)
3. Kochubey VV, red. Wounds, the wound process: ucheb-metod posobie dlya internov, ordinatorov i prakt vrachei. Krasnodar, RF: KubGMU; 2016. 29 p. (In Russ.)
4. Konstantinova MV, Khaytsev NV, Kravtsova AA, Balashov LD. Major wound healing problems and the use of skin substitutes. Pediatr. 2015;6(2):85-95. (In Russ.)
5. Mushkina OV, Kravtsova-Kukhmar NG, Gurina NS, Shakovets NV, Kidyasova TV. Application of phytogel with tincture of black alder leaves in experimental gingivitis. Vestn VGMU. 2022;21(3):94-101. (In Russ.)
6. Mushkina V. Effect of wound healing in gels containing tincturese of Alnus glutinosa (L) leaves. Clinical
3. Раны, раневой процесс : учеб.-метод. пособие для интернов, ординаторов и практ. врачей / под общ. ред. В. В. Кочубей. Краснодар : КубГМУ, 2016. 29 с.
4. Основные проблемы заживления ран и использование заменителей кожи / М. В. Константинова [и др.] // Педиатр. 2015. Т. 6, № 2. С. 85-95.
5. Применение фитогеля с настойкой листьев ольхи черной при экспериментальном гингивите / О. В. Мушкина [и др.] // Вестн. ВГМУ 2022. Т. 21, № 3. С. 94-101.
6. Mushkina, V. Effect of wound healing in gels containing tinc1шresе of Alnus glutinosa (L) leaves / V. Mushkina // Clinical. Phytoscience. 2021 Jul. Vol. 62, N 7. Art. 62. doi: 10.1186/s40816-021-00299-9
7. Гистологическая техника в патоморфологической лаборатории : учеб.-метод. пособие / М. О. Мавликеев [и др.]. Москва : Практ. медицина, 2023. 112 с.
8. Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных [Электронный ресурс]. Женева, 1985. Режим доступа: https://studfile.net/ preview/6330457/page:39/. Дата доступа: 16.08.2024.
9. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях ETC № 123 (Страсбург, 18 марта 1986 г) [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://base. garant.m/4090914/#friends. Дата доступа: 16.08.2024.
10. Денисов, С. Д. Требования к научному эксперименту с использованием животных / С. Д. Денисов // Здравоохранение. 2001. № 4. С. 40-41.
11. Надлежащая лабораторная практика = Надежная ла-бараторная практыка : ТКП 125-2008 (02040). Введ. 2008.05.01. Изд. офиц. Минск : М-во здравоохранения Респ. Беларусь, 2008. 34 с.
Поступила 10.05.2024 г.
Принята в печать 28.08.2024 г.
Phytoscience. 2021 Jul;62(7):62. doi: 10.1186/s40816-021-00299-9
7. Mavlikeev MO; Kiyasov AP; Deev RV; Chernova ON. Histologic technique in the pathomorphology laboratory: ucheb-metod posobie. Moscow, RF: Prakt meditsina; 2023. 112 р. (In Russ.)
8. International recommendations (code of ethics) for conducting biomedical research using animals [Internet]. Geneva, Switzerland; 1985. Available from: https://studfile. net/preview/6330457/page:39/. [Accessed 16th August 2024]. (In Russ.)
9. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes ETC No. 123 (Strasbourg, March 18, 1986) [Internet]. Available from: https://base.garant. ru/4090914/#friends. [Accessed 16th August 2024]. (In Russ.)
10. Denisov SD. Requirements for scientific experimentation using animals. Zdravookhranenie. 2001;(4):40-1. (In Russ.)
11. Good laboratory practice: TKP 125-2008 (02040). Vved 2008.05.01. Izd ofits. Minsk, RB: M-vo zdravookhraneniya Resp Belarus', 2008. 34 р. (In Russ.)
Submitted 10.05.2024 Accepted 28.08.2024
Сведения об авторах:
О.В. Мушкина - к.ф.н., доцент, зав. кафедрой организации фармации, Белорусский государственный медицинский университет, https://orcid.org/0000-0002-3397-1220, e-mail: [email protected] - Мушкина Ольга Владимировна;
Н.С. Гурина - д.б.н., профессор, декан фармацевтического факультета, Белорусский государственный медицинский университет;
А.Ю. Крылов - к.м.н., доцент, зав. кафедрой судебной медицины, Институт повышения квалификации и переподготовки кадров Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь.
Information about authors:
O.V. Mushkina - Candidate of Pharmaceutical Sciences, associate professor, head of the Chair of Organization of Pharmacy, Belarusian State Medical University, https://orcid.org/0000-0002-3397-1220, e-mail: [email protected] - Olga V Mushkina;
N.S. Gurina - Doctor of Biological Sciences, professor, dean of the pharmaceutical faculty, Belarusian State Medical University;
A.Yu. Krylov - Candidate of Medical Sciences, associate professor, head of the Chair of Forensic Medicine, the Institute for Advanced Training and Retraining of the Investigative Committee of the Republic of Belarus.
