CC BY
1
Для корреспонденции
Багрянцева Ольга Викторовна - доктор биологических наук,
ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой
токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва,
Устьинский проезд, д. 2/14
Телефон: (495) 698-54-05
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/00 00-0003-3174-2675
Багрянцева О.В.1, Бессонов В.В.1, Боков Д.О.1, Гурэу З.Г.1, Ляшенко Е.В.2
Гигиеническая оценка и перспективы использования подсластителей на основе белков в производстве пищевой продукции
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
2 Акционерное общество «Управляющая Компания ЭФКО», 115035, г. Москва, Российская Федерация
1 Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
2 JSC EFKO Management Company, 115035, Moscow, Russian Federation
Анализ структуры заболеваемости населения РФ выявил значительное количество лиц с алиментарно-зависимыми патологиями, в том числе с ожирением и с сахарным диабетом, в рацион которых должны входить пищевые продукты со сниженной энергетической ценностью, среди которых широко используются продукты с подсластителями. Вместе с тем спектр разрешенных для применения в пищевой промышленности подсластителей не всегда позволяет достичь нужного технологического эффекта. В этой связи представляет интерес поиск новых видов подсластителей, обладающих необходимыми органолептическими и технологическими свойствами. К таким подсластителям относится ряд белков со сладким вкусом.
Финансирование. Исследование выполнено за счет средств субсидии гранта РНФ (№ 19-76-30014-П), https://rscf.ru/project/23-76-33001 Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
Вклад авторов. Дизайн исследования - Багрянцева О.В., Бессонов ВВ.; сбор и обработка материала - Багрянцева О.В., Боков ДО., Гурэу З.Г, Ляшенко Е.В.; написание, редактирование статьи - Багрянцева О.В., Бессонов В.В., Боков Д.О.; ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Для цитирования: Багрянцева О.В., Бессонов ВВ., Боков ДО., Гурэу З.Г., Ляшенко Е.В. Гигиеническая оценка и перспективы использования подсластителей на основе белков в производстве пищевой продукции // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 6. С. 27-36. DOI: https://doi. org/10.33029/0042-8833-2024-93-6-27-36
Статья поступила в редакцию 07.11.2023. Принята в печать 11.11.2024.
Funding. The study was supported by the grant of the Russian Science Foundation (No. 19-76-30014-П), https://rscf.ru/project/23-76-33001 Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. Study design - Bagryantseva O.V., Bessonov V.V.; data collection and processing - Bagryantseva O.V., Bokov DO., Gureu Z.G., Lyashenko E.V.; writing, editing the article - Bagryantseva O.V., Bessonov V.V., Bokov D.O.; the responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
For citation: Bagryantseva O.V., Bessonov V.V., Bokov DO., Gureu Z.G., Lyashenko E.V. Hygienic assessment and prospects for the use of protein-based sweeteners in food production. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (6): 27-36. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-6-27-36 (in Russian)
Received 07.11.2023. Accepted 11.11.2024.
Hygienic assessment and prospects for the use of protein-based sweeteners in food production
Bagryantseva O.V.1, Bessonov V.V.1, Bokov D.O.1, Gureu Z.G.1, Lyashenko E.V.2
Цель работы - анализ имеющихся данных о безопасности для здоровья человека и возможности применения в пищевой промышленности подсластителей на основе белков.
Материал и методы. В статье приведены анализ и обобщение опубликованных данных, размещенных в базах научных статей Scopus, Web of Science, PubMed, РИНЦ, Cyberleninka, Google Scholar, а также положений отечественных и международных нормативных и законодательных документов. Результаты. Проведен анализ биологических и технологических свойств подсластителей на основе белков со сладким вкусом (тауматина, браззеина, куркулина, мабинлина, миракулина, монеллина, пентадина), а также способов их производства. Представлены доказательства возможности безопасного применения в составе пищевых продуктов не только тауматина (Е957), но и таких белков, как браззеин и монеллин. Другие белки со сладким вкусом также представляют интерес для их использования в качестве подсластителей и веществ, модифицирующих вкус пищевых продуктов. Показано, что в настоящее время биологические свойства и механизм действия различных видов сладких белков на организм не изучены в достаточной степени. Кроме того, использование в качестве компонентов для производства этих белков только растительного сырья не даст возможности их широкого использования в пищевой промышленности, что является ограничением для их применения в качестве пищевых добавок - подсластителей. Имеются сообщения о возможности включения сладких белков в протокол лечения различных алиментарно-зависимых патологий, в том числе онкозаболеваний. Заключение. Проведенный анализ свойств белков со сладким вкусом показал перспективность их применения в пищевой промышленности в качестве подсластителей, веществ, модифицирующих вкус пищевых продуктов, биологически активных веществ. В связи с тем, что увеличение объемов производства сладких белков возможно только в случае применения биотехнологических методов, штаммы-продуценты и получаемые при помощи микробного синтеза подсластители могут использоваться в пищевой промышленности только после оценки рисков здоровью человека и установления регламентов их безопасного применения. Ключевые слова: сладкие белки; подсластители;микробный синтез;ГМ-микро-организмы; продукты с пониженной энергетической ценностью; оценка рисков
The analysis of the morbidity in the population of the Russian Federation showed the presence of a significant number of people with chronic non-infection pathologies, including obesity, diabetes mellitus, whose diet should include food with reduced energy value. For this purpose, food containing sweeteners are widely used. At the same time, the range of sweeteners permitted for the usage in food industry does not always allow achieving the desired technological effect. In this regard, it is of interest to search for new types of sweeteners with the necessary organoleptic and technological properties. Such sweeteners include a number of proteins with a sweet taste.
The purpose of the study was to analyze the available data on the possibility of using protein-based sweeteners in the food industry and their human health safety. Material and methods. The article presents an analysis and generalization of published data from Scopus, Web of Science, PubMed, RSCI, Cyberleninka, Google Scholar, as well as provisions of domestic and international regulatory and legislative documents. Results. An analysis of the biological and technological properties of sweeteners based on sweet-tasting proteins (thaumatin, brazzein, curculin, manbilin, miraculin, monellin, pentadin) and their production methods has been carried out. Evidence is presented of the possibility of safe use in food, not only of thaumatin (E957), but also of such proteins as brazzein and monellin. Other sweet-tasting proteins are also of interest for their use as sweeteners and substances modifying food taste. It has been shown that at present the biological properties and mechanism of action of various types of sweet proteins on the human body have not been studied sufficiently. In addition, the use of only plant raw materials for the production of these proteins will not allow their wide application in food industry, which is a limitation for their use as food additives - sweeteners. There are reports on the possibility of including sweet proteins in the treatment protocol for various chronic non-infection diseases, including oncological diseases.
Conclusion. The conducted analysis of the properties of sweet taste proteins showed the prospects of their use in food industry as sweeteners, substances modifying food taste and bioactive substances. Due to the fact that an increase in the production of sweet proteins is possible only in the case of using biotechnological methods, producer strains and sweeteners obtained by microbial synthesis can be applied in food industry only after assessing the risks to human health and establishing regulations for their safe use. Keywords: sweet proteins; sweeteners; microbial synthesis; GM-microorganisms; low-energy foods; risk assessment
В соответствии с имеющимися данными, с 2013 по 2018 г. в России увеличилась заболеваемость алиментарно-зависимыми заболеваниями, такими как болезни эндокринной системы, в том числе сахарный диабет 2 типа (на 4%) и расстройства пищеварения и нарушения обмена веществ (на 17%). На 14% выросла заболеваемость болезнями системы кровообращения, в том числе на 17% сердечно-сосудистыми патологиями1. В этой связи приоритетным направлением государственной политики РФ в области здорового питания является снижение заболеваемости социально значимыми алиментарно-зависимыми неинфекционными патологиями2. Решению этой задачи в большой степени способствует снижение калорийности рациона, в том числе за счет включения в состав пищевых продуктов подсластителей.
Вместе с тем использование подсластителей, разрешенных для применения в пищевой промышленности, ограничено тем, что ни один из них не соответствует органолептическому профилю сахара, а степень сладости ряда подсластителей значимым образом снижается при высоких температурах и изменении рН [1]. Это обстоятельство делает необходимым поиск новых видов подсластителей, соответствующих по своим технологическим свойствам требованиям безопасности и предпочтениям потребителей, производителей пищевой продукции. Наиболее перспективными являются натуральные подсластители нового вида на основе белков (браззеин, куркулин, мабинлин, миракулин, монеллин, пентадин) [2]. В соответствии с требованиями РФ и Евразийского экономического союза (ЕАЭС) применение пищевых добавок нового вида в пищевой промышленности возможно только после проведения установленных процедур оценок рисков здоровью человека3, 4.
Цель работы - анализ имеющихся данных о безопасности для здоровья человека и возможности применения в пищевой промышленности подсластителей на основе белков.
Материал и методы
В ходе исследования проведен анализ и обобщение данных, опубликованных в реферативных базах Scopus, Web of Science, PubMed, РИНЦ, Cyberleninka и электронных поисковых системах (академия Google), а также положений отечественных и международных нормативных и законодательных документов.
Результаты
Неуклонный рост количества людей с патологиями, вызванными избыточным потреблением сахара, стал угрозой для здоровья населения России. Для снижения калорийности рациона питания лиц с избыточной массой тела и сахарным диабетом достаточно часто используются пищевые добавки - подсластители [1]1. В соответствии с утвержденными требованиями, подсластители должны применяться в пищевой продукции с пониженной энергетической ценностью (калорийностью) или без добавленных сахаров, в диетических продуктах, предназначенных для лиц, которым рекомендуется ограничивать (исключить) потребление сахара, в специализированной продукции с заданным химическим составом, а также для частичной или полной замены сахара2, 5.
В настоящее время большое внимание уделяется поиску и оценке рисков здоровью потребителя новых видов подсластителей, таких как пептиды (белки) сладкого вкуса. Такие белки могут быть получены из растений, и их сладость в значительной степени превосходит сладость сахарозы. Интерес к этим веществам обусловлен тем, что они позиционируются как натуральные подсластители [1, 3]. Вместе с тем, вследствие отсутствия возможности их получения из растительных источников в достаточном для пищевых производств объемах и высокой стоимости, в последние годы в качестве продуцентов таких белков используются технологические штаммы мутантных и/или генетически модифицированных (ГМ) микроорганизмов [3]. Данное обстоятельство делает необходимым проведение анализа влияния этих белков на метаболизм макроорганизма, а также рисков здоровью потребителей, связанных с применением технологических микроорганизмов и продуцируемой ими пищевой продукции нового вида.
Анализ опубликованных данных позволил оценить возможность использования в пищевой промышленности известных в настоящее время сладких белков (браз-зеин, куркулин, мабинлин, миракулин, монеллин, пен-тадин).
Тауматин
Тауматин - одноцепочечный полипептид, состоящий из 207 аминокислотных остатков с молекулярной массой 22 кДа. Относительная сладость тауматина растительного происхождения в 2000 раз выше, чем у сахарозы, в пересчете на молекулярную массу. Технологическое
1О состоянии здорового питания в Российской Федерации: Доклад. Москва: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2020. 118 с.
2 Стратегия повышения качества пищевой продукции в Российской Федерации до 2030 года. Утверждена распоряжением Правительства РФ от 29 июня 2016 г. №1364-р.
3 Р 2.1.10.3968-23 «Руководство по оценке риска здоровью населения при воздействии химических веществ, загрязняющих среду обитания»(утв. Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения от 5 сентября 2023 г.). Москва, 2023. 152 с.
4 Технический регламент Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов, технологических вспомогательных средств»(ТР ТС 029/2012).
5 Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции»(ТР ТС 021/2011).
действие тауматина проявляется при его содержании в составе пищевой продукции в количестве 50 нмоль. Сладость белка сохраняется при кипячении при pH ниже 5,5 в течение 1 ч. Отмечено, что при этих значениях pH тауматин стабилен при высоких температурах. Этим объясняется его широкое применение при пастеризации и консервировании [4].
Подсластитель тауматин (Е957) разрешен для использования в пищевой промышленности РФ и ЕАЭС4. Учитывая, что предполагаемая допустимая суточная доза тауматина составляет порядка 2 мг на 1 кг массы тела в сутки, а также тот факт, что тауматин вносит незначительный вклад в потребление белка в составе рационов и входит в состав растений, используемых в питании человека, Международный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам (JECFA) принял решение утвердить регламент использования Е957 - допустимая суточная доза «не установлено» [5]. Такой регламент устанавливается для веществ с низкой токсичностью, если неблагоприятные эффекты не наблюдаются при их 5% содержании в суточном рационе.
В соответствии со спецификацией [6] тауматин получается путем водной экстракции из кожуры плодов произрастающего в Африке растения Thaumatococcus daniellii (Benth). Белок тауматин состоит из 2 субъединиц - тауматина I и II с небольшим количеством примеси растительных компонентов из исходного сырья в самом подсластителе. Качество такой продукции в значительной степени зависит от качества плодов.
Помимо того, что тауматин является низкокалорийным подсластителем и не вызывает кариеса, он может также использоваться в качестве модификатора вкуса в составе пищевой продукции. Уникальные свойства этого подсластителя делают его привлекательным ингредиентом для пищевой промышленности [1].
С целью получения больших количеств тауматина и производных этого подсластителя, более устойчивых к высоким температурам, проведен ряд исследований, направленных на разработку способа его получения с помощью ГМ-микроорганизмов и трансгенных растений [1, 2]. Наиболее перспективными из известных ГМ-микроорганизмов, используемых в производстве таума-тина, являются Komagataella phaffii (Pichia pastoris) [7].
Браззеин
Браззеин - одноцепочечный полипептид с молекулярной массой 6,473 кДа, состоящий из 54 аминокислот. Браззеин в 500-2000 раз слаще сахарозы в пересчете на молекулярную массу [3, 7]. Природный источник браз-зеина - мякоть плодов пентадипландры (Pentadiplandra brazzeana Baill.) - древесного растения, произрастающего в тропических лесах Центральной Африки. Содержание браззеина в плодах пентадипландры невысоко, около 0,2%. Культивирование этого растения затруд-
нено, а экстракция из растительных источников является сложной и дорогостоящей процедурой. Важным свойством браззеина из Р. brazzeana является его термостабильность, обусловленная наличием 4 дисульфид-ных мостиков между 8 остатками цистеина. Браззеин сохраняет сладкий вкус на протяжении 4 ч при 80 °С или 2 ч при 98 °С в диапазоне pH от 2,5 до 8. Сладость браззеина проявляется медленнее, чем у сахарозы, поэтому его целесообразнее использовать в сочетании с другими подсластителями [8, 9].
В настоящее время имеется ряд сообщений об успешном синтезе браззеина с использованием ГМ-микроор-ганизмов, таких как Е. coli, Komagataella phaffii (ранее Pichia pastoris), Lactococcus lactis, Bacillus licheniformis, а также ГМ-растений - салата (Lactuca sativa L.), риса (Oryza sativa L. var. Japonica) и кукурузы (Zea mays L.), моркови (Daucus carota L.), табака (Nicotiana tabacum L.). Показана возможность получения браззеина из молока трансгенных мышей [9, 10]. При этом сладкие белки, синтезируемые различными ГМ-микроорганизмами, растениями и животными, отличаются от браззеина, получаемого из Р. brazzeana, по степени сладости, устойчивости к температуре и влиянию на организм человека [9].
Анализ синтетической последовательности нуклео-тидов векторной вставки в генотип K. phaffii CF-st401 с помощью методов in silico продемонстрировал, что она соответствовала на 70% и более молекулярной формуле белка браззеина, получаемого из плодов растения Р. brazzeana. Показано, что исследуемый штамм не способен к продукции токсинов, антибиотиков и аллергенов [11]. В экспериментах, проводимых ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» с использованием мышей и крыс, ГМ-штамм-продуцент браззеина Komagataella phaffii CF-st401 показал отсутствие у него антибиотической активности, вирулентности, способности к дис-семинации внутренних органов6. Исследование острой токсичности браззеина, получаемого с использованием K. phaffii (Р. pastoris), показало, что доза браззеина, вводимая внутрижелудочно самцам и самкам крыс и мышей, не вызывающая при однократном введении гибель животных, составила более 5000 мг на 1 кг массы тела. Результаты оценки субхронической токсичности браззеина с использованием морских свинок-альбиносов свидетельствуют о том, что браззеин не оказывал негативного действия на гематологические и биохимические показатели крови животных при ежедневном внутрижелудочном введении в дозах 2,17 и 21,7 мг на 1 кг массы тела в сутки в течение 21 сут. Оценка хронической токсичности браззеина, проводимая на крысах (самцах и самках) в течение 150 сут при внутрижелудоч-ном поступлении в дозах 2,14 и 21,4 мг на 1 кг массы тела в сутки, также не выявила негативного действия этого подсластителя на подопытных животных (динамика прироста массы тела, массы внутренних органов, гемато-
6 Результаты, полученные в ходе выполнения исследований по Договору № 13/н от 19.06.2023 на проведение работ по Техническому заданию на токсикологические исследования генно-инженерно-модифицированного микроорганизма К. phaffii CF-st401 между ООО «Бирюч» и ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии».
логические и биохимические показатели крови, диурез и биохимические показатели мочи, поведенческие реакции, результаты цитологических исследований органов животных). Браззеин также не проявил мутагенных свойств в тесте Эймса и способности к индукции хромосомных аберраций у клеток костного мозга мышей. Введение браззеина в дозах 4,64 и 46,4 мг на 1 кг массы тела не оказывало аллергического действия на организм морских свинок-альбиносов и беспородных мышей [12]. Введение конканавалина А мышам, получавшим браззеин с кормом, не вызывало развитие аллергической воспалительной реакции. Основываясь на этих результатах, сделан вывод об отсутствии токсического и аллергенного действия браззеина при его внутриже-лудочном введении [12]. Браззеин также не оказывал выраженного действия на качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника крыс, получавших его с рационом в количествах 2,14 и 21,4 мг на 1 кг массы тела в сутки в течение 150 дней [13].
Монеллин
Монеллин - белок, состоящий из 2 полипептидных цепей. Пептид А включает 44 аминокислотных остатка, а пептид В - 50. Данный белок был впервые получен из плодов произрастающего в Африке кустарника серен-дипити (Dioscoreophyllum cummins). Коэффициент сладости монеллина в 3000 раз превышает коэффициент сладости сахарозы. Сладость монеллина проявляется медленно, но имеет длительное послевкусие. Нагрев выше 50 °С при низких значениях pH способствует денатурации этого белка, что, в свою очередь, приводит к потере сладкого вкуса. Сладкий вкус монеллина могут чувствовать только человек и человекообразные обезьяны [3, 9].
Как и в случае с браззеином, производство монеллина растительного происхождения требует больших затрат. В этой связи были исследованы возможности получения путем микробного синтеза одноцепочечного реком-бинантного монеллина - полипептида из 94 аминокислотных остатков. Для этого была проведена экспрессия в генотип Е. coli синтетической последовательности нуклеотидов с использованием в качестве промотора фага Т7. Полученный белок характеризовался выраженным сладким вкусом, устойчивостью к изменениям pH и температуры. Так, температура, вызывающая денатурацию рекомбинантного монеллина, на 20 °С выше, чем у растительного белка. Проведены исследования по включению последовательности нуклеотидов, кодирующих монеллин в Candida utilis и Saccharomyces cerevisiae [9, 14-16].
Монеллин, продуцируемый K.phaffii, не вызывал гибели животных, изменений поведения животных и состояния внутренних органов при его однократном внутрижелу-дочном введении самцам и самкам крыс в дозе более 5000 мг на 1 кг массы тела. Внутрижелудочное введение с кормом монеллина морским свинкам в подостром эксперименте в течение 2,5 мес в дозах 1,45 и 14,5 мг на 1 кг массы тела в сутки не выявило негативного действия
этого белка на организм подопытных животных. Оценка состояния получавших монеллин в составе общевивар-ного рациона в течение 150 дней самцов и самок крыс по морфологическим, гистологическим, гематологическим и биохимическим показателям также не выявила статистически значимых различий в состоянии животных опытных и контрольной группы [12]. В другом токсикологическом исследовании, проводимом в течение 90 дней, недействующая доза (NOAEL) для крыс монеллина, полученного из ГМ-микроорганизма K. phaffii, в генотип которого была экспрессирована синтетическая последовательность нуклеотидов, аналогичная последовательности из серендипити, составила 2000 мг на 1 кг массы тела в сутки [17].
Аллергенное действие моннелина изучалось на 2 видах лабораторных животных: самцах-альбиносах морских свинок в возрасте 3-4 мес со средней массой тела 250-300 г и самцах беспородных мышей в возрасте 2-2,5 мес с массой тела 18-20 г. Результаты кожных, назальных и конъюнктивальных тестов, непрямая реакция дегрануляции тучных клеток у морских свинок и отсутствие воспалительной реакции на конканавалин А у мышей свидетельствуют о том, что сладкий белок монеллин не обладает аллергенными свойствами [12, 17]. Отсутствие индуцированных хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей при различных режимах и дозах введения монеллина, а также отсутствие накопления микроядер в полихроматофильных эритроцитах популяций клеток костного мозга мышей, отрицательный тест Эймса позволяют сделать вывод о том, что монеллин из K. phaffii не проявляет цитогенетиче-ской и мутагенной активности [12]. Монеллин, так же как и браззеин, при внутрижелудочном введении в количествах 1,45 и 14,5 мг на 1 кг массы тела в сутки в течение 150 дней не оказывал значимого влияния на качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника [13].
Куркулин
Куркулин - белок, состоящий из 114 аминокислотных остатков. Это димер с молекулярной массой 12 491 Да. Идентичные по аминокислотному составу полипептидные цепи, входящие в состав куркулина, связаны двумя дисульфидными мостиками. Сладость куркулина превышает коэффициент сладости сахарозы в 550 раз.
Куркулин получен из растения, произрастающего в Малайзии - Curculigo latifolia. Кроме придания сладкого вкуса, куркулин обладает способностью модифицировать вкус пищевых продуктов. Например, вода и кислые вещества вызывают сладкий вкус после потребления куркулина. Это делает куркулин наиболее привлекательным для использования в пищевой промышленности. Модифицирующие вкус свойства этого белка не изменяются при температуре 50 °C в течение 1 ч в диапазоне pH от 3 до 11 [7, 18, 19].
В экспериментах in vivo показано, что экстракты из листьев и клубней Curculigo latifolia оказывают доказанное антиоксидантное и антибактериальное дейст-
вие. Антибактериальная активность экстрактов из этого растения может быть обусловлена наличием в них фенольных соединений, подавляющих рост как грампо-зитивных, так и грамнегативных микроорганизмов, а не самого куркулина [15]. Обсуждается вопрос использования куркулина в качестве антиокислителя при изготовлении муки [20]. Куркулиноподобный (маннозосвязыва-ющий белок) лектин выявлен в составе ксилемного сока рапса (Brassica napus) [21].
Оценка рисков потребления куркулина и куркулино-подобных белков здоровью человека не проводилась. Это делает невозможным в настоящее время применение этого сладкого белка в пищевой промышленности в качестве подсластителя, антиокислителя и/или биологически активной добавки к пище.
Мабинлин
Мабинлин - сладкий белок, состоящий из 2 полипептидных цепей. Среди 4 различных изомеров этого белка мабинлин II с молекулярной массой 12 400 Да считается одним из наиболее изученных. Он состоит из 2 полипептидных цепей из 33 и 72 аминокислот, прочно связанных 4 сульфидными связями [15, 18]. A-цепь состоит из 2 а-спиралей, а В-цепь - из 3 а-спиралей. Интересно, что белок В-цепи может вызывать сладость, тогда как A-цепь не обладает таким действием, что согласуется с дальнейшими выводами о том, что В-цепь с уникальным (NL/I) тетралетным мотивом в структуре этого белка является сайтом, определяющим его сладость, в то время как A-цепь может играть роль в длительном послевкусии этого белка [22]. Исследования молекулярной структуры мабинлина II из семян Capparis masaikai H. Lev. с использованием методов биоинформатики показали, что этот белок является 2S альбумином и обладает антимикробными свойствами [23].
Высокое содержание мабинлина обнаружено в плодах (каперсах) многолетнего травянистого растения (Cap-paris masaikai), произрастающего в субтропических районах китайской провинции Юньнань. Сладость мабинлина II примерно в 100 раз выше, чем у сахарозы, в пересчете на молекулярную массу. Мабинлин характеризуется высокой термостабильностью, что обусловлено наличием в составе молекулы дисульфидных связей. Сладость мабинлина II не изменяется после 48 ч инкубации при температуре кипения, а сладость мабинлина III и IV не изменяется в течение 60 мин при 80 °C. Другие варианты мабинлина (I-I, III и IV) отличаются по органо-лептическому профилю от мабинлина II, что объясняется наличием глутамина или остатка аргинина в положении 47 в 0-цепи [15, 24].
Степень токсичности мабинлина для теплокровных организмов в настоящее время не определена. Не исследованы в достаточной степени также его физико-химические и органолептические свойства. Кроме того, не установлены дозировки этого белка в составе определенных видов пищевых продуктов, обеспечивающих их оптимальные потребительские свойства и безопасность для потребителей.
Миракулин
Миракулин был впервые выделен из ягод кустарника, произрастающего в Западной Африке (Richadella dul-cifera). Этот белок также обнаружен в высокой концентрации в растении Synsepalum dulcificum (син. Pouteria dulcifica, Чудесные ягоды, Путерия сладковатая, Магический фрукт, Miracle Fruit, Синсепалум) [24].
В соответствии с различными данными этот белок состоит из 191 или 220 аминокислотных остатков. Миракулин принадлежит к семейству белков - ингибиторов трипсина сои (STI) типа Кунитца, утративших STI-актив-ность. Он имеет молекулярную массу 24,6 кДа, из которых до 13,9% (3,4 кДа) нуклеотидов отвечают за продукцию сахаров, включая глюкозамин (31%), маннозу (30%), фукозу (22%), ксилозу (10%) и галактозу (7%). Первичная структура миракулина представляет собой тетрамер (98,4 кДа), состоящий из 4 мономеров, сгруппированных в 2 димера, связанных дисульфидной связью [15, 25].
Сам по себе миракулин не обладает сладким вкусом. Он может, как и куркулин, изменять кислый вкус на сладкий. Данный эффект после использования в пище любого кислого вещества может длиться в течение примерно 30 мин и объясняется особенностями действия миракулина на вкусовые рецепторы [18]. Это свойство делает незаменимым миракулин при использовании в рационах пациентов с нарушениями вкуса, например онкологических больных, проходящих химиотерапию. От 20 до 86% пациентов, получающих химиотерапию и/или облучение, страдают нарушениями вкуса, которые сохраняются на протяжении всего лечения, что увеличивает риск недоедания и ухудшения эффективности лечения, плохих прогнозов заболевания, а также снижения качества жизни этих больных [26].
Проведенный Европейским агентством по безопасности пищевой продукции (EFSA) анализ возможности использования сухих плодов Synsepalum dulcificum в составе специализированных пищевых продуктов, показал, что данные фрукты имеют длительную историю пищевого применения, а продукты из них реализуются на рынках всего мира. Миракулин сохраняет стабильность после ферментативной обработки пептидазой D и карбоксипептидазой М, но разрушается после обработки пепсином и трипсином, что соответствует естественному перевариванию белков в желудочно-кишечном тракте. В остром эксперименте однократное введение порошка плодов S. dulcificum в рацион в количестве более 5000 мг на 1 кг массы тела не вызывало негативного действия на организм самок крыс Вистар. В под-остром эксперименте, проводимом в течение 90 дней с использованием самок и самцов крыс, показано, что доза 2000 мг на 1 кг массы тела в сутки не вызывала токсических эффектов. Плоды не оказывали генотоксиче-ского действия на Salmonella typhimurium в концентрации 5 мг на чашку. Анализ последовательности белка мира-кулина, проводимый с использованием методов биоинформатики, показал наличие гомологий между этим белком и последовательностями белков-аллергенов из арахиса. EFSA также отметило наличие гомологичной
аминокислотной последовательности в составе белка миракулина и аллергенных белков латекса, персика и сои. Применяя коэффициент безопасности (фактор неопределенности), равный 200, EFSA установила допустимый уровень поступления (ADI) плодов S. dulcificum -10 мг на 1 кг массы тела в сутки, что соответствует 0,7 г/сут для взрослых людей (за исключением беременных и кормящих) [25].
Synsepalum dulcificum выращивается в Западной Африке. Массовое производство миракулина растительного происхождения ограничено. Показана возможность получения миракулина при помощи биотехнологических методов, а именно путем включения синтетического гена (MIR. gene), кодирующего синтез этого белка в генотип E. coli [18], гомозиготную линию томатов (Solanum lycopersicum) [27, 28], в каллусные культуры моркови (Daucus carota L.) [29]. Использование этих методов значимым образом повысит объемы производства миракулина. Оценка рисков здоровью человека ГМ-миракулина не проводилась. Не определена область применения и регламента его безопасного использования в пищевой промышленности.
Пентадин
Pentadiplandra brazzeana Baillon (вьющийся кустарник), произрастающий в некоторых тропических странах Африки (например, в Габоне). Растение содержит сладкий белок с молекулярной массой 12 кДа. Исследования электрофоретического профиля пентадина подтвердили наличие в составе его молекулы субъединиц, соединенных дисульфидными связями. В этой связи логично предположить высокую устойчивость этого белка к высоким температурам и изменению значений pH. Пентадин в 500 раз слаще сахарозы. Органолепти-ческие свойства пентадина больше похожи на свойства монеллина, чем на свойства тауматина. Однако до сих пор отсутствуют данные об аминокислотной последовательности и структуре этого сладкого белка [18]. Оценка рисков здоровью человека при использовании пента-дина не проводилась.
Обсуждение
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей и молекулярной структуры сладких белков (браззеина, куркулина, мабинлина, миракулина, монел-лина, пентадина) не выявил у них идентичных последовательностей аминокислот, отвечающих за сладкий вкус [22, 30]. Показано, что сладкий вкус этих веществ обусловливается их воздействием на гете роди мерный рецептор T1R2/T1R3, расположенный в мембране клеток вкусовых сосочков языка. Подсластители (включая сладкие на вкус белки) связываются с этими рецепторами, активируют их и запускают сигнальный механизм, включающий активацию G-белка, фосфолипазы С, высвобождение Са2+, деполяризацию клеток и т.д. В конечном итоге появляется ощущение сладкого вкуса. Выражен-
ность сладкого вкуса белковых подсластителей определяется степенью комплементарности между его зарядом и рецептором сладкого вкуса [22, 30]. Показано, что сладость этих белков в значительной степени зависит от их стабильности при воздействии различных факторов. Например, термостабильный сладкий белок браззеин содержит 4 внутримолекулярные дисульфидные связи. Дисульфидные связи обнаружены также у тауматина, мабинлина, пентадина. Кроме того, стабильность сладких белков зависит от количества водородных связей в их молекулах [2, 12, 15, 24]. Так, монеллин, полученный из мутантного штамма E2N/E23A MNEI (одноце-почечный монеллин), имел большее количество водородных связей по сравнению с мутантом дикого типа, а также более сильные ковалентные связи между углеродом и водородом, что обусловило его большую термостабильность. Так, монеллин из мутантного штамма E2N/E23A MNEI сохраняет свойства при температуре 84,9 °С, а из штамма дикого типа - при температуре 74,2 °С [24].
В связи с тем, что растительные источники содержат небольшое количество сладких белков, перспективы более широкого применения таких подсластителей в пищевой промышленности связаны прежде всего с использованием мутантных и/или ГМ-микроорганиз-мов, растений и в некоторых случаях животных (например, молоко от трансгенных мышей для получения браззеина). Сконструированные вставки нуклеотидов, отвечающие за продукцию сладких белков, способствуют не только увеличению объемов производимой продукции, но и модификации их структуры и, следовательно, свойств. Имеются данные о том, что изменение свойств ГМ-организмов способствует улучшению органолепти-ческих свойств подсластителей белковой природы и/или увеличению коэффициента их сладости по отношению к сахарозе [4, 10, 12, 15, 27, 31, 32]. Например, мутация гена G16A, кодирующая синтез белка монеллина, может вызывать изменения гибкости поверхности белка через эффекты, опосредованные гидрофобными взаимодействиями, что привело к 10-кратному снижению коэффициента его сладости [31]. Сообщалось, что сладость ряда вариантов сладкого на вкус белка браззеина зависит от количества водородных связей в его молекуле. В частности, 3 более сладких варианта этого белка имели одинаковое количество водородных связей. У несладких вариантов браззеина отсутствовала 1 водородная связь в середине а-спирали и 1 водородная связь в середине ß-спиралей II и III. Кроме того, показано наличие комбинаторных эффектов последовательностей ДНК у мутировавших штаммов и степенью сладости этих белков. Например, мутанты, генотип которых включал множественные мутации генов (например, H31R/E36D/E41A), продуцировали браззеин с более выраженным сладким вкусом, чем у штаммов с с мутациями 2 генов (например, H31R/E36D, H31R/E41A и E36D/E41A) или 1 гена (например, H31R, E36D и Е41А) [12, 14, 22].
Таким образом, для получения подсластителей белковой природы, характеризующихся различной сладо-
стью и термостабильностью, устойчивостью к кислотам и щелочам, необходимо учитывать наличие и характер мутаций, изменений первичной, вторичной и третичной структуры этих белков. Вместе с тем в настоящее время предсказание этих свойств является достаточно сложной задачей, для решения которой необходимо проведение дальнейших исследований в области взаимосвязи строения и технологических характеристик и биологических свойств этих белков. Эти сведения важны еще и потому, что некоторые белки со сладким вкусом, в соответствии с результатами проведенных исследований, проявляют выраженное биологически активное действие на организм человека и планируются для применения в лечебной практике, для терапии сахарного диабета, онкопатологий и др. [25, 26, 33, 34].
Необходимо также учитывать, что изменение структуры белков, получаемых с использованием мутантных и ГМ-микроорганизмов за счет наличия последовательностей нуклеотидов, отвечающих за их патогенность, вирулентность, способность к синтезу токсинов, антибиотиков, также может привести к другим негативным проявлениям действия таких микроорганизмов и продуцируемых ими метаболитов на организм человека [35, 36]. Такая пищевая продукция согласно установленным требованиям относится к продукции нового вида. В этой связи штаммы-продуценты и пищевые компоненты нового вида, получаемые при помощи микробного синтеза и ранее не используемые в питании населения, должны проходить процедуру оценки их рисков здоровью человека в соответствии с законодательством РФ и ЕАЭС, международным законодательством [35, 36]2, 4 7 8. Примером такого подхода является проведенный анализ рисков здоровью пищевой продукции нового вида - «сладкого белка Браззеина», получаемого при помощи ГМ-штамма Котада1авНа рЬаШ СГ-э1401, который включал анализ свойств этого вида
Сведения об авторах
микроорганизма и влияния продуцированного им сладкого белка на макроорганизм на основе результатов комплексных исследований с использованием методов биоинформационного анализа (in silico) [11], а также токсикологических, гематологических, биохимических, микробиологических, иммунологических методов [12, 13] (номер свидетельства о государственной регистрации RU 77.99.22003 R001157.0.524).
Заключение
Проведенный анализ биологических и технологических свойств белков со сладким вкусом (тауматина, браззеина, куркулина, мабинлина, миракулина, монел-лина, пентадина) показал перспективность их использования в пищевой промышленности в составе пищевых продуктов с пониженной энергетической ценностью.
Перспективность таких подсластителей обусловлена их органолептическими и технологическими свойствами, а именно возможностью их применения в составе пищевых продуктов, обрабатываемых при высоких температурах, и низких значений pH.
Таким образом, сладкие белки, за исключением тауматина (Е957), ранее не использовались в питании населения РФ и ЕАЭС. В настоящее время они производятся в основном при помощи мутантных и ГМ-микроорганизмов. Такая пищевая продукция в соответствии с законодательством РФ и ЕАЭС относится к продукции нового вида. Разрешение на применение в питании человека продукции нового вида, получаемой при помощи микробного синтеза, может быть принято только после проведения оценки рисков здоровью населения как штамма-продуцента, так и вырабатываемой им пищевой продукции.
Багрянцева Ольга Викторовна (Olga V. Bagryantseva) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3174-2675
Бессонов Владимир Владимирович (Vladimir V. Bessonov) - доктор биологических наук, заведующий лабораторией химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-3587-5347
Боков Дмитрий Олегович (Dmitry O. Bokov) - кандидат фармацевтических наук, доцент, научный сотрудник лаборатории химии пищевых продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-2968-2466
Гурэу Зинаида Геннадиевна (Zinaida G. Gureu) - лаборант-исследователь лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6939-5843
7 Principles for the Risk Analysis of Foods Derived from Modern Biotechnology. CXG 44-2003.
8 Guideline for the Conduct of Food Safety Assessment of Foods Produced Using Recombiant-DNA Microorganisms. CXG 46-2003.
Ляшенко Евгений Васильевич (Evgeniy V. Lyashenko) - генеральный директор АО «УК ЭФКО» (Москва, Российская
Федерация)
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0009-0000-6427-4519
Литература
1. Sayas-Barbera E., Paredes C., Salgado-Ramos M., Pallares N., Ferrer E., 19. Navarro-Rodríguez de Vera C. et al. Approaches to enhance sugar content
in foods: is the date palm fruit a natural alternative to sweeteners? // Foods. 2024. Vol. 13, N 1. P. 129. DOI: https://doi.org/10.3390/foods13010129
2. Saraiva A., Carrascosa C., Raheem D., Ramos F., Raposo A. Natural sweeteners: the relevance of food naturalness for consumers, food secu- 20. rity aspects, sustainability and health impacts // Int. J. Environ. Res. Public Health. 2020. Vol. 17, N 17. Article ID 6285. DOI: https://doi. org/10.3390/ijerph17176285
3. Randhir R., Shetty K. Biotechnology of non-nutritive sweeteners // 21. Functional Foods and Biotechnology / eds K. Shetty, D. Sarkar. CRC Press, 2019. 218 p. DOI: https://doi.org/10.1201/9781003003830-11
4. Joseph J.A., Akkermans S., Nimmegeers P., Van Impe J.F.M. Biopro- 22. duction of the recombinant sweet protein thaumatin: current state
of the art and perspectives // Front. Microbiol. 2019. Vol. 10. Р. 695. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00695
5. Evaluation of certain food additives and contaminants. Twenty-Ninth 23. Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives // World Health Organ. Tech. Rep. Ser. 1986. Vol. 733. P. 35-36.
6. Thaumatin. Prepared at the 53rd JECFA (1999) and published in FNP 52
Add 7 (1999), superseding tentative specifications prepared at the 51st JECFA 24. (1998), published in FNP 52 Add 6 (1998). ADI «not specified», established at the 29th JECFA in 1985. URL: https://www.fao.org/fileadmin/ user_upload/jecfa_additives/docs/Monograph 1/Additive-462.pdf
7. Ming D., Hellekant G. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B // FEBS Lett. 1994. Vol. 355, 25. N 1. P. 106-108. DOI: https://doi.org/10.1016/0014-5793(94)01184-2
8. Hellekant G., Danilova V. Brazzein a small, sweet protein: discovery and physiological overview // Chem. Senses. 2005. Vol. 30, suppl. 1.
P. i88-i89. DOI: https://doi.org/10.1093/chemse/bjh127 26.
9. Saraiva A., Carrascosa C., Ramos F., Raheem D., Pedreiro S., Vega A. et al. Brazzein and monellin: chemical analysis, food industry applications, safety and quality control, nutritional profile and health impacts // Foods. 2023. Vol. 12, N 10. Article ID 1943. DOI: https://doi. org/10.3390/foods12101943
10. Neiers F., Belloir C., Poirier N., Naumer C., Krohn M., Briand L. Comparison of different signal peptides for the efficient secretion of the 27. sweet-tasting plant protein brazzein in Pichia pastoris // Life (Basel). 2021. Vol. 11. P. 46. DOI: https://doi.org/10.3390/life11010046
11. Гурэу З.Г., Багрянцева О.В., Новикова Д.С., Хотимченко С.А. Анализ свойств Komagataella phaffii CF-st401 — генетически 28. модифицированного продуцента сладкого белка браззеина
с применением методов in silico // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 4. С. 65-73. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-4-65-73
12. Novik T.S., Koveshnikova E.I., Kotlobay A.A., Sycheva L.P., Kurochkina 29. K.G., Averina O.A. et al. Sweet-tasting natural proteins brazzein and monellin: safe sugar substitutes for the food industry // Foods. 2023. Vol. 12,
N 22. Article ID 4065. DOI: https://doi.org/10.3390/foods12224065
13. Veselovsky V.A., Boldyreva D.I., Olekhnovich E.I., Klimina K.M., 30. Babenko V.V., Zakharevich N.V. et al. Effect of the consumption of brazzein and monellin, two recombinant sweet-tasting proteins, on
rat gut microbiota // Front. Nutr. 2024. Vol. 11. Article ID 1362529. 31. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2024.1362529
14. Liu Q., Li L., Yang L., Liu T., Cai C., Bo Liu B. Modification of the sweetness and stability of sweet-tasting protein monellin by gene mutation and protein engineering // Biomed. Res. Int. 2016. Vol. 2016. 32. Article ID 3647173. DOI: https://doi.org/10.1155/2016/3647173
15. Bilal M., Jib L., Xub S., Zhangb Y., Iqbal H.M.N., Cheng H. Bioprospecting and biotechnological insights into sweet-tasting proteins
by microbial hosts - a review // Bioengineered. 2022. Vol. 13, N 4. Article 33. ID 9829. DOI: https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2061147
16. Delfi M., Emendato A., Leone S., Lampitella E.A., Porcaro P., Cardinale G. et al. Super stable mutant of the plant protein monellin endowed with enhanced sweetness // Life. 2021. Vol. 11, N 3. Article ID 236. DOI: https://doi.org/10.3390/life11030236 34.
17. Freeman E.L., Ward R., Murphy M.M., Wang T., Ryder J. Comprehensive safety assessment of serendipity berry sweet protein produced from Komagataella phaffii // Regul. Toxicol. Pharmacol. 2024. Vol. 147. Article ID 105562. DOI: https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2024.105562
18. Kant R. Sweet proteins - potential replacement for artificial low calorie sweeteners // Nutr. J. 2005. Vol. 4, N 5. P. 1—6. DOI: https://doi. 35. org/10.1186/1475-2891-4-5
Reza F., Taha R.M., Rashid K.A., Ahmed B.A., Danaee M., Rozali S.E. Preliminary screening of antioxidant and antibacterial activities and establishment of an efficient Callus induction in Curculigo latifolia Dryand (Lemba) // Evid. Based Complement. Alternat. Med. 2016. Vol. 2016. Article ID 6429652. DOI: https://doi.org/10.1155/2016/6429652 Karigidi O., Olaiya C.O. Effects of Curculigo pilosa supplementation on antioxidant and antidiabetic activities of yam flour // J. Food Sci. Technol. 2021. Vol. 58, N 11. Р. 4110-4117. DOI: https://doi. org/10.1007/s13197-020-04872-x
Kehr J., Buhtz A., Giavalisco P. Analysis of xylem sap proteins from Brassica napus // BMC Plant Biol. 2005. Vol. 5. P. 11. DOI: https://doi. org/10.1186/1471-2229-5-11
Zhao X., Wang C., Zheng Y., Liu B. New insight into the structure-activity relationship of sweet-tasting proteins: protein sector and its role for sweet properties // Front. Nutr. 2021. Vol. 8. Article ID 691368. DOI: https://doi.org/10.3389/fnut.2021.691368
Rahman M., Browne J. J., Van Crugten J., Hasan M.F., Liu L., Barkla B. J. In silico, molecular docking and in vitro antimicrobial activity of the major rapeseed seed storage proteins // Front. Pharmacol. 2020. Vol. 11. Article ID 1340. DOI: https://doi.org/10.3389/fphar.2020.01340 Gomez de Cedron M., Wagner S., Reguero M., Menendez-Rey A., Ramirez de Molina Miracle A. Berry as a potential supplement in the control of metabolic risk factors in cancer // Antioxidants (Basel). 2020. Vol. 9, N 12. Article ID 1282. DOI: https://doi.org/10.3390/ antiox9121282
Turck D., Castenmiller J., De Henauw S., Hirsch-Ernst K.I., Kearney J., Knutsen H.K. et al. Safety of dried fruits of Synsepalum dulcificum as a novel food pursuant to Regulation (EU) 2015/2283 // EFSA J. 2021. Vol. 19, N 6. Article ID e06600 DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2021.6600 Lopez-Plaza B., Gil A., Menendez-Rey A., Bensadon-Naeder L., Hummel T., Feliu-Batlle J. et al. Effect of regular consumption of a miraculin-based food supplement on taste perception and nutritional status in malnourished cancer patients: a triple-blind, randomized, placebo-controlled clinical trial - CLINMIR pilot protocol // Nutrients. 2023. Vol. 15, N 21. Article ID 4639. DOI: https://doi.org/10.3390/ nu15214639
Ono A., Hiwasa-Tanase K., Nonaka S., Ezura H. The accumulation of recombinant miraculin is independent of fruit size in tomato // Plant Biotechnol. 2021. Vol. 38, N 1. P. 161-165. DOI: https://doi. org/10.5511/plantbiotechnology.20.0904a
Kajiura H., Hiwasa-Tanase K., Ezura H., Fujiyama K. Comparison of the N-glycosylation on recombinant miraculin expressed in tomato plants with native miraculin // Plant Biotechnol. 2018. Vol. 35, N 4. Р. 375-379. DOI: https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.18.1023a Park Y.J., Han J.E., Lee H., Jung Y.-J., Murthy H.N., Park S.Y. Large-scale production of recombinant miraculin protein in transgenic carrot callus suspension cultures using air-lift bioreactors // AMB Express. 2020. Vol. 10. P. 140. DOI: https://doi.org/10.1186/s13568-020-01079-3 Hellekant G. Neuroscience of taste: unlocking the human taste code // BMC Neurosci. 2024. Vol. 25. Article ID 19. DOI: https://doi. org/10.1186/s12868-024-00847-2
Leone S., Pica A., Merlino A., Sannino F., Temussi P.A., Picone D. Sweeter and stronger: enhancing sweetness and stability of the single chain monellin MNEI through molecular design // Sci. Rep. 2016. Vol. 6, N 1. Article ID 34045. DOI: https://doi.org/10.1038/srep34045 Masuda T., Kigo S., Mitsumoto M., Ohta K., Suzuki M., Mikami B. et al. Positive charges on the surface of thaumatin are crucial for the multi-point interaction with the sweet receptor // Front. Mol. Biosci. 2018. Vol. 5. P. 10. DOI: https://doi.org/10.3389/fmolb.2018.00010 O'Riordan N.M., Juric V., O'Neill S. K., Roche A.P., Young P.W. A yeast modular cloning (MoClo) toolkit expansion for optimization of heterologous protein secretion and surface display in Saccharo-myces cerevisiae // ACS Synth. Biol. 2024. Vol. 13, N 4. Р. 1246-1258. DOI: https://doi.org/10.1021/acssynbio.3c00743 Lopez-Plaza B., Alvarez-Mercado A.I., Arcos-Castellanos L., Plaza-Diaz J., Ruiz-Ojeda F.J., Brandimonte-Hernandez M. et al. Efficacy and safety of habitual consumption of a food supplement containing miraculin in malnourished cancer patients: the CLINMIR pilot study // Nutrients. 2024. Vol. 16, N 12. Article ID 1905. DOI: https:// doi.org/10.3390/nu16121905
Younes M., Aggett P., Aguilar F., Crebelli R., Dusemund B., Filipic M. et al. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavail-
ability of nutrient from the sources (revision 1) // EFSA J. 2021. Vol. 19, N 3. Article ID e06552. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2021.6552 36. Ricci A., Allende A., Bolton D. Chemaly M., Davies R., Girones R. et al. Update of the list of QPS-recommended biological agents inten-
tionally added to food or feed as notified to EFSA 7: suitability of taxo-nomic units notified to EFSA until September 2017. EFSA BIOHAZ Panel (EFSA Panel on Biological Hazards) // EFSA J. 2018. Vol. 16, N 1. Article ID e05131. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5131
References
1. Sayas-Barbera E., Paredes C., Salgado-Ramos M., Pallares N., Ferrer E., Navarro-Rodriguez de Vera C., et al. Approaches to enhance sugar content in foods: is the date palm fruit a natural alternative to sweeteners? Foods. 2024; 13 (1): 129. DOI: https://doi.org/10.3390/foods13010129 20.
2. Saraiva A., Carrascosa C., Raheem D., Ramos F., Raposo A. Natural sweeteners: the relevance of food naturalness for consumers, food security aspects, sustainability and health impacts. Int J Environ Res Public 21. Health. 2020; 17 (17): 6285. DOI: https://doi.org/10.3390/yerph17176285
3. Randhir R., Shetty K. Biotechnology of non-nutritive sweeteners. Eds
by K. Shetty, D. Sarkar. Functional Foods and Biotechnology. CRC 22. Press, 2019: 218 p. DOI: https://doi.org/10.1201/9781003003830-11
4. Joseph J.A., Akkermans S., Nimmegeers P., Van Impe J.F.M. Bioproduction of the recombinant sweet protein thaumatin: current state of the
art and perspectives. Front Microbiol. 2019; 10: 695. DOI: https://doi. 23. org/10.3389/fmicb.2019.00695
5. Evaluation of certain food additives and contaminants. Twenty-Ninth Report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. World Health Organ Tech Rep Ser. 1986; 733: 35-6. 24.
6. Thaumatin. Prepared at the 53rd JECFA (1999) and published in FNP 52 Add 7 (1999), superseding tentative specifications prepared at the 51st JECFA (1998), published in FNP 52 Add 6 (1998). ADI «not specified», established at the 29th JECFA in 1985. URL: https://www.fao. 25. org/fileadmin/user_upload/jecfa_additives/docs/Monograph1/Addi-tive-462.pdf
7. Ming D., Hellekant G. Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B. FEBS Lett. 1994; 355 26. (1): 106-8. DOI: https://doi.org/10.1016/0014-5793(94)01184-2
8. Hellekant G., Danilova V. Brazzein a small, sweet protein: discovery and physiological overview. Chem Senses. 2005; 30 (suppl 1): i88—9. DOI: https://doi.org/10.1093/chemse/bjh127
9. Saraiva A., Carrascosa C., Ramos F., Raheem D., Pedreiro S., Vega A.,
et al. Brazzein and monellin: chemical analysis, food industry applica- 27. tions, safety and quality control, nutritional profile and health impacts. Foods. 2023; 12 (10): 1943. DOI: https://doi.org/10.3390/foods12101943
10. Neiers F., Belloir C., Poirier N., Naumer C., Krohn M., Briand L. Comparison of different signal peptides for the efficient secretion of the 28. sweet-tasting plant protein brazzein in Pichia pastoris. Life (Basel). 2021; 11: 46. DOI: https://doi.org/10.3390/life11010046
11. Gureu Z.G., Bagryantseva O.V., Novikova D.S., Khotimchenko S.A. Analysis of the properties of Komagataella phaffii CF-st401 - a geneti- 29. cally modified producer of the sweet protein brazzein using in silico methods. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (4): 65—73. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-4-65-73 (in Russian)
12. Novik T.S., Koveshnikova E.I., Kotlobay A.A., Sycheva L.P., Kuroch- 30. kina K.G., Averina O.A., et al. Sweet-tasting natural proteins brazzein
and monellin: safe sugar substitutes for the food industry. Foods. 2023; 31. 12 (22): 4065. DOI: https://doi.org/10.3390/foods12224065
13. Veselovsky V.A., Boldyreva D.I., Olekhnovich E.I., Klimina K.M., Babenko V.V., Zakharevich N.V., et al. Effect of the consumption of brazzein and monellin, two recombinant sweet-tasting proteins, on 32. rat gut microbiota. Front Nutr. 2024; 11: 1362529. DOI: https://doi. org/10.3389/fnut.2024.1362529
14. Liu Q., Li L., Yang L., Liu T., Cai C., Bo Liu B. Modification of the sweetness and stability of sweet-tasting protein monellin by gene muta- 33. tion and protein engineering. Biomed Res Int. 2016; 2016: 3647173. DOI: https://doi.org/10.1155/2016/3647173
15. Bilal M., Jib L., Xub S., Zhangb Y., Iqbal H.M.N., Cheng H. Bioprospecting and biotechnological insights into sweet-tasting proteins by microbial hosts — a review. Bioengineered. 2022; 13 (4): 34. 9829. DOI: https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2061147
16. Delfi M., Emendato A., Leone S., Lampitella E.A., Porcaro P., Cardinale G., et al. Super stable mutant of the plant protein monellin endowed with enhanced sweetness. Life. 2021; 11 (3): 236. DOI: https://doi. org/10.3390/life11030236 35.
17. Freeman E.L., Ward R., Murphy M.M., Wang T., Ryder J. Comprehensive safety assessment of serendipity berry sweet protein produced from Komagataella phaffii. Regul Toxicol Pharmacol. 2024; 147: 105562. DOI: https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2024.105562 36.
18. Kant R. Sweet proteins — potential replacement for artificial low calorie sweeteners. Nutr J. 2005; 4 (5): 1—6. DOI: https://doi.org/10.1186/1475-2891-4-5
19. Reza F., Taha R.M., Rashid K.A., Ahmed B.A., Danaee M., Rozali S.E. Preliminary screening of antioxidant and antibacterial activities
and establishment of an efficient Callus induction in Curculigo latifolia Dryand (Lemba). Evid Based Complement Alternat Med. 2016; 2016: 6429652. DOI: https://doi.org/10.1155/2016/6429652 Karigidi O., Olaiya C.O. Effects of Curculigo pilosa supplementation on antioxidant and antidiabetic activities of yam flour. J Food Sci Technol. 2021; 58 (11): 4110-7. DOI: https://doi.org/10.1007/s13197-020-04872-x Kehr J., Buhtz A., Giavalisco P. Analysis of xylem sap proteins from Brassica napus. BMC Plant Biol. 2005; 5: 11. DOI: https://doi. org/10.1186/1471-2229-5-11
Zhao X., Wang C., Zheng Y., Liu B. New insight into the structure-activity relationship of sweet-tasting proteins: protein sector and its role for sweet properties. Front Nutr. 2021; 8: 691368. DOI: https://doi. org/10.3389/fnut.2021.691368
Rahman M., Browne J.J., Van Crugten J., Hasan M.F., Liu L., Barkla B.J. In silico, molecular docking and in vitro antimicrobial activity of the major rapeseed seed storage proteins. Front Pharmacol. 2020; 11: 1340. DOI: https://doi.org/10.3389/fphar.2020.01340 Gomez de Cedron M., Wagner S., Reguero M., Menendez-Rey A., Ramirez de Molina Miracle A. Berry as a potential supplement in the control of metabolic risk factors in cancer. Antioxidants (Basel). 2020; 9 (12): 1282. DOI: https://doi.org/10.3390/antiox9121282 Turck D., Castenmiller J., De Henauw S., Hirsch-Ernst K.I., Kearney J., Knutsen H.K., et al. Safety of dried fruits of Synsepalum dulcificum as a novel food pursuant to Regulation (EU) 2015/2283. EFSA J. 2021; 19 (6): e06600 DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2021.6600 Lopez-Plaza B., Gil A., Menendez-Rey A., Bensadon-Naeder L., Hummel T., Feliu-Batlle J., et al. Effect of regular consumption of a miraculin-based food supplement on taste perception and nutritional status in malnourished cancer patients: a triple-blind, randomized, placebo-controlled clinical trial - CLINMIR pilot protocol. Nutrients. 2023; 15 (21): 4639. DOI: https://doi.org/10.3390/nu15214639 Ono A., Hiwasa-Tanase K., Nonaka S., Ezura H. The accumulation of recombinant miraculin is independent of fruit size in tomato. Plant Biotechnol. 2021; 38 (1): 161-5. DOI: https://doi.org/10.5511/ plantbiotechnology.20.0904a
Kajiura H., Hiwasa-Tanase K., Ezura H., Fujiyama K. Comparison of the N-glycosylation on recombinant miraculin expressed in tomato plants with native miraculin. Plant Biotechnol. 2018; 35 (4): 375-9. DOI: https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.18.1023a Park Y.J., Han J.E., Lee H., Jung Y.-J., Murthy H.N., Park S.Y. Large-scale production of recombinant miraculin protein in transgenic carrot callus suspension cultures using air-lift bioreactors. AMB Express. 2020; 10: 140. DOI: https://doi.org/10.1186/s13568-020-01079-3 Hellekant G. Neuroscience of taste: unlocking the human taste code. BMC Neurosci. 2024; 25: 19. DOI: https://doi.org/10.1186/s12868-024-00847-2 Leone S., Pica A., Merlino A., Sannino F., Temussi P.A., Picone D. Sweeter and stronger: enhancing sweetness and stability of the single chain monellin MNEI through molecular design. Sci Rep. 2016; 6 (1): 34045. DOI: https://doi.org/10.1038/srep34045
Masuda T., Kigo S., Mitsumoto M., Ohta K., Suzuki M., Mikami B., et al. Positive charges on the surface of thaumatin are crucial for the multi-point interaction with the sweet receptor. Front Mol Biosci. 2018; 5: 10. DOI: https://doi.org/10.3389/fmolb.2018.00010 O'Riordan N.M., Juric V., O'Neill S. K., Roche A.P., Young P.W. A yeast modular cloning (MoClo) toolkit expansion for optimization of heterologous protein secretion and surface display in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synth Biol. 2024; 13 (4): 1246-58. DOI: https://doi. org/10.1021/acssynbio.3c00743
Lopez-Plaza B., Alvarez-Mercado A.I., Arcos-Castellanos L., Plaza-Diaz J., Ruiz-Ojeda F.J., Brandimonte-Hernandez M., et al. Efficacy and safety of habitual consumption of a food supplement containing m iraculin in malnour ished cancer patients: the CLINMIR pilot study. Nutrients. 2024; 16 (12): 1905. DOI: https://doi.org/10.3390/nu16121905 Younes M., Aggett P., Aguilar F., Crebelli R., Dusemund B., Filipic M., et al. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavail-ability of nutrient from the sources (revision 1). EFSA J. 2021; 19 (3): e06552. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2021.6552 Ricci A., Allende A., Bolton D. Chemaly M., Davies R., Girones R., et al. Update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 7: suitability of taxonomic units notified to EFSA until September 2017. EFSA BIOHAZ Panel (EFSA Panel on Biological Hazards). EFSA J. 2018; 16 (1): e05131. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5131
