CC BY
3
Для корреспонденции
Гурэу Зинаида Геннадиевна - аспирант лаборатории
пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий
ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»
Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва,
Устьинский проезд, д. 2/14
Телефон: (495) 698-5342
E-mail: [email protected]
https://orcid.org/0000-0002-6939-5843
Гурэу З.Г.1, Багрянцева О.В.1, 2, Новикова Д.С.3, Хотимченко С.А.1, 2
Анализ свойств Komagataella phaffii CF-st401 -генетически модифицированного продуцента сладкого белка браззеина с применением методов in silico
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
3 Общество с ограниченной ответственностью «Бирюч», 309927, Белгородская обл., мкр-н Красногвардейский, с.п. Стрелецкое, п. Белая Вежа, Российская Федерация
1 Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation
2 I .M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
3 "Biryuch" LLC, Belgorod region, 309927, Krasnogvardeisky microdistrict, rural settlement Streletskoye, Belaya Vezha village, Russian Federation
Analysis of the properties of Komagataella phaffii CF-st401, a genetically modified producer of the sweet protein brazzein by using in silico methods
Gureu Z.G.1, Bagryantseva O.V.1, 2, Novikova D.S.3, Khotimchenko S.A.1' 2
Финансирование. Исследование выполнено по договору № 13/н от 19.06.2023 на проведение работ по Техническому заданию на токсикологические исследования генно-инженерно-модифицированного микроорганизма K. phaffii CF-st401 между ООО «Бирюч» и ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии».
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
Вклад авторов. Дизайн исследования - Багрянцева О.В., Гурэу З.Г.; анализ структуры ДНК с использованием методов in silico - Гурэу З.Г.;
обработка материала, написание, редактирование статьи, ответственность за целостность всех частей статьи - все авторы.
Для цитирования: Гурэу З.Г., Багрянцева О.В., Новикова Д.С., Хотимченко С.А. Анализ свойств Komagataella phaffii CF-st401 - генетически
модифицированного продуцента сладкого белка браззеина с применением методов in silico // Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 4.
С. 65-73. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-4-65-73
Статья поступила в редакцию 15.04.2024. Принята в печать 15.07.2024.
Funding. The study was conducted within the framework of agreement No. 13/n dated June 19, 2023 for toxicological studies of the genetically engineered microorganism K. phaffii CF-st401 between Biryuch LLC and the Federal Research Center for Nutrition and Biotechnology. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Contribution. Study design - Bagryantseva O.V., Gureu Z.G.; analysis of DNA structure using in silico methods - Gureu Z.G.; processing of the material, writing, editing the article, responsibility for the integrity of all parts of the article - all authors.
For citation: Gureu Z.G., Bagryantseva O.V., Novikova D.S., Khotimchenko S.A. Analysis of the properties of Komagataella phaffii CF-st401, a genetically modified producer of the sweet protein brazzein by using in silico methods. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (4): 65-73. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-4-65-73 (in Russian) Received 15.04.2024. Accepted 15.07.2024.
В настоящее время с целью снижения потреблениямоно- и дисахаридов в составе пищевых рационов широко используются подсластители. При этом ни один из разрешенных для применения в пищевой промышленности подсластителей по органолептическим свойствам не соответствует природным сахарам. Это обстоятельство послужило основанием для разработки технологии получения пищевого ингредиента нового вида со сладким вкусом - браззеина при помощи штамма-продуцента Komagataellaphaffii CF-st401.
Цель исследования - применение методов in silico для оценки безопасности генетически модифицированного (ГМ) микроорганизма K. phaffii CF-st401 -продуцента «сладкого белка браззеина».
Материал и методы. Объектом исследований стала карта плазмиды K. phaffii CF-st401, полученная ООО «Бирюч» в результате секвенирования плазмиды ГМ штамма K. phaffii CF-st401, включающая синтетическую нуклеотидную последовательность, аналогичную последовательности, кодирующей белок браззеин в растении Pentadiplandra brazzeana, и оптимизированную для экспрессии в ДНК штамма-реципиента; нуклеотидную последовательность плазмиды М4794 из Saccharomyces сerevisiae и линейного участка фланкирующих областей ДНК из K. phaffii, используемую для интеграции в геном штамма-реципиента K. phaffii YIB Aleu2 ВКПМ Y-476, а также данные об аминокислотной последовательности рекомбинантного браззеина. С использованием методов биоинформатики (in silico) проведены исследования структуры ДНК векторной последовательности K. phaffii CF-st401, в том числе наличие в ней оперонов, отвечающих за продукцию токсинов, антибиотикорезистентности и аллергенности.
Результаты. Проведенные исследования векторной плазмиды K. phaffii CF-st401, внедренной в K. phaffii YIB Aleu2 ВКПМ Y-4761, показали, что ее области, ответственные за структуру «сладкого белка браззеина», более чем на 70% совпадают с элементами эталонного белка браззеина Р56552 из растения P. brazzeana. Подтверждено отсутствие в векторной плазмиде селективных маркеров и маркеров аллергенности.
Заключение. Проведенный анализ структуры векторной последовательности ДНК ГМ-штамма K. phaffii CF-st401 подтвердил целесообразность применения биоинформационных методов с целью предсказания свойств технологических микроорганизмов при оценке их безопасности для потребителей. Ключевые слова:микробный синтез; генетически модифицированный микроорганизм; штамм-продуцент; Komagataella phaffii; методы биоинформационного анализа (in silico); подсластитель; браззеин
Currently, in order to reduce the consumption of mono - and disaccharides in diets, sweeteners are widely used. At the same time, none of the sweeteners approved for food industry usage matches the organoleptic properties of natural sugars. This circumstance was the basis for the development of technology for producing a new type of food ingredient with a sweet taste - brazzein using the producer strain Komagataella phaffii CF-st401. The purpose of the study was the application of in silico methods to assess the safety of K. phaffii CF-st401 genetically modified (GM) microorganism, which is the producer of the "Sweetprotein Brazzein".
Material and methods. The research object was the map of K. phaffii CF-st401 plasmid obtained by Biryuch LLC as a result of sequencing the plasmid of GM strain K. phaffii CF-st401, including: a synthetic nucleotide sequence similar to the sequence encoding the brazzein protein in the plant (Pentadiplandra brazzeana) and optimized for expression in the DNA of the recipient strain; the nucleotide sequence of plasmid M4794 from Saccharomyces cerevisiae and a linear fragment of the flanking DNA regions from K. phaffii used for integration into the genome of the recipient strain K. phaffii YIB Aleu2 VKPM Y-476, as well as amino acid sequence data of recombinant brazzein. By using bioinformatics methods (in silico), we investigated the DNA structure of the vector sequence of K. phaffii CF-st401, including the presence of operons responsible for toxin production, antibiotic resistance, and allergenicity.
Results. As a result of the studies of K. phaffii CF-st401 vector plasmid, introduced into K. phaffii YIB Aleu2 VKPM Y-4761, it was shown that its regions responsible for the structure of the "Sweetprotein Brazzein" coincide by more than 70% with elements of the brazzein P56552 reference protein from the plant P. brazzeana. The absence of selective markers and allergenicity in the vector plasmid was confirmed.
Conclusion. The analysis of the structure of the DNA vector sequence of the K. phaffii CF-st401 GM strain confirmed the feasibility of using bioinformatics methods to predict the properties of technological microorganisms when assessing their safety for consumers. Keywords: microbial synthesis; genetically modified microorganism; producer strain;
Komagataella phaffii; bioinformation analysis methods (in silico); sweetener;
brazzein
В настоящее время во всем мире отмечается рост числа заболеваний неинфекционной природы, напрямую связанных с питанием, которые представляют серьезную медико-социальную и экономическую проблему, обусловленную неуклонным ростом числа больных, высокой частотой, тяжестью и прогрессиро-ванием различных осложнений, снижением продолжительности жизни1. Одним из критических компонентов рационов населения России является избыточное потребление моно- и дисахаридов, обусловливающее развитие целого ряда алиментарно-зависимых патологий (заболевания сердечно-сосудистой системы, сахарный диабет, ожирение, остеопороз, некоторые злокачественные новообразования и др.) [1].
С целью снижения содержания в рационе моно-и дисахаридов и калорийности пищевых продуктов используются подсластители. Вместе с тем ни один из разрешенных для применения в пищевой промышленности подсластителей не соответствует по органолепти-ческим свойствам природным сахарам. Это обстоятельство послужило основанием для разработки способа получения пищевого ингредиента нового вида - сладкого белка браззеина, получаемого с использованием генетически модифицированного штамма Komagataella phaffii CF-st401.
Все виды пищевой продукции, получаемые путем микробного синтеза, относятся к натуральным продуктам, т.е. к продуктам природного происхождения. Вместе с тем многие встречающиеся в природе вещества, в том числе сладкие белки (браззеин, монелин и др.), не имеющие традиций пищевого применения в России, еще не в достаточной степени изучены с точки зрения их безопасности для здоровья человека. В случае производства пищевой продукции при помощи микроорганизмов, основными вопросами их применения являются: 1) безопасность для здоровья человека штамма-продуцента; 2) соответствие молекулярной формулы вещества, получаемого при помощи микробного синтеза, молекулярной формуле вещества, получаемого традиционными способами; 3) анализ возможности безопасного применения этого вещества в составе пищевых рационов [2].
Качество и безопасность продуцируемых технологическими микроорганизмами продуктов зависит от свойств штамма-продуцента. Komagataella phaffii - мезофильный микроорганизм (метилотрофные дрожжи), относящийся к филуму Ascomycota, классу Saccharomycetes, порядку Saccharomycetales, семейству Phaffomycetaceae, роду Komagataella [3]. Ранее 4 вида (K. pastoris, K. phaffii, K. mondaviorum и K. Ulmi) относились к виду Pichia pastoris [4]. В связи со сложностью идентификации микроорганизмов, принадлежащих к роду Komagataella, для подтверждения их видовой принадлежности необ-
ходимо использовать мультигенный филогенетический анализ с использованием методов биоинформатики по последовательностям ITS-участка (внутреннего транскрибируемого спейсера), EF-1a и RPB1 [5, 6].
На основании данных о безопасности для здоровья человека и степени вариабельности генома в отношении видов K. pastoris, K. phaffi Европейским агентством по безопасности пищевых продуктов (European Food Safety Authority, EFSA) установлен статус безопасных при использовании в пищевой промышленности (qualified presumption of safety - QPS) [7].
K. phaffii вызывает большой интерес в плане использования в производстве широкого спектра белков, включая ферменты и фармацевтические препараты. В дополнение к своей способности метаболизировать метанол K. phaffii может расти на недорогих средах, достигая высокой концентрации биомассы, которая может превышать 100 г/кг сухой клеточной массы. Учитывая способность этого микроорганизма расти на относительно недорогих питательных средах, он был первоначально использован в качестве продуцента белка. Далее K. phaffii приобрела привлекательность в качестве штамма-реципиента для производства белков кодируемых встраиваемыми отрезками ДНК бактерий, грибов, растений, животных и даже человека [8, 9].
Инструменты для экспрессии генов ДНК у этого вида микроорганизмов хорошо изучены, что позволяет целенаправленно проводить интеграцию генов, определяющих стабильный синтез белков (rProt). Кроме того, K. phaffii может осуществлять посттрансляционные модификации белков, характерные для высших эукариот - гликозилирование и образование дисуль-фидной связи. Успеху использования K. phaffii в синтезе белков способствовали индуцируемые метанолом сильные промоторы генов алкогольоксидазы [алкоголь-оксидаза 1 (AOX1) и, в меньшей степени, алкогольокси-даза 2 (АОХ2)], а также продукция глицеральдегид-3-фосфата [9].
Экспрессионная система Pichia pastoris была коммерциализирована компанией Invitrogen и широко используется для научных и промышленных целей [4]. В настоящее время EFSA дало разрешение на использование в пищевой промышленности ряда ферментных препаратов, предназначенных для пищевой промышленности, производимых при помощи генетически модифицированных (ГМ) штаммов K. phaffii [10, 11]. Изменением № 2 в Технический регламент Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012)2 предусмотрена возможность использования штаммов K. phaffii (Pichia pastoris) (штамм YIB Aleu2_PLA2Sv) - продуцента фосфолипазы A2 и K. phaffii (штамм PRF) - продуцента фосфолипазы С.
1О состоянии здорового питания в Российской Федерации: доклад. Москва: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2022. 118 с.
2 Утверждены Решением Советом Евразийской экономической комиссии № 84 31.08.2023. Дата вступления в силу - 27 февраля 2024 г.
Для пищевой промышленности также представляет большой интерес производство различных видов пищевых компонентов с использованием ГМ микробной природы. Примером такого продукта является сладкий белок браззеин. Данный пищевой компонент до недавнего времени получали из плодов растения Pentadiplandra brazzeana Baillon (P. brazzeana), произрастающего в Западной Африке. Плоды P. brazzeana -крупные красные ягоды, иногда с крапинками; они содержат 2 вида высокоэффективных термостабильных веществ: сладкий белок, называемый браззеином, который делает ягоду значительно слаще сахарозы, и пентадин. Благодаря своей сладости, термостабильности (браззеин из P. brazzeana сохраняет сладость при инкубации при 98 °С в течение 2 ч и при 80 °С в течение 4,5 ч), высокой растворимости в воде (более 7,7 мМ) и низкой молекулярной массе браззеин является веществом, перспективным для использования в пищевой промышленности в качестве пищевого ингредиента -подсластителя [12, 13].
В связи с трудностями производства браззеина в местах произрастания P. brazzeana в настоящее время разрабатываются биотехнологические методы его синтеза с использованием ГМ организма бактериального, грибного, растительного и животного происхождения [13, 14]. Аннотированный пластом P. brazzeana, полученный на основе набора данных полногеномного секвенирования по технологии Illumina, определяющего структуру браззеина, депонирован в GenBank под номером MN306574 [15]. Браззеин состоит из 54 аминокислот. Исследования, проведенные in vitro и in vivo продемонстрировали, что, несмотря на не менее чем 45% сходства ДНК с белком дефенсином и противогрибковым препаратом дрозоми-цином, браззеин не обладает антибактериальной и анти-фунгальной активностью. Из-за структурного сходства ДНК между сладким белком и дефензинами, многие из которых являются аллергенами, были высказаны опасения по поводу возможной аллергенности браззеина. Вместе с тем в экспериментах показано, что браззеин проявляет противоаллергические и противовоспалительные свойства, а также выраженное антиоксидантное действие на теплокровный организм [13].
Термостабильность браззеина является важной характеристикой для пищевой промышленности. Степень сладости браззеина, получаемого из P. brazzeana, в 750 раз превышает степень сладости сахарозы [13, 14]. Степень сладости браззеина и его термостабильность обусловлены особенностями фолдинга первичной и вторичной структуры этого белка за счет наличия дисульфидных связей цистеина, связывающих а-спирали с ближайшей р-цепью. При этом образуется складчатая структура белка. Отмечено, что эти характеристики, а также биологическая активность браззеина биотехнологического происхождения зависят от структуры ДНК ГМ организма [14].
Цель исследования - применение методов in silico для оценки безопасности ГМ микроорганизма K. phaffii CF-st401 - продуцента «сладкого белка браззеина».
Материал и методы
Объектом исследований стала карта плазмиды K. phaffii CF-st401, полученная ООО «Бирюч» в результате секвенирования плазмиды ГМ штамма K. phaffii CF-st401 и включающая синтетическую нуклеотид-ную последовательность, аналогичную последовательности, кодирующей белок браззеин в растении Pentadiplandra brazzeana, и оптимизированную для экспрессии в ДНК штамма-реципиента; нуклеотидную последовательность плазмиды М4794 из Saccharomyces œrevisiae и линейного участка фланкирующих областей ДНК из K. phaffii, используемую для интеграции в геном штамма-реципиента K. phaffii YIB Aleu2 ВКПМ Y-4761, а также данные об аминокислотной последовательности данного белка. Эти сведения приведены в паспорте штамма K. phaffii CF-st401. Кроме того, в паспорте штамма указано:
- ГМ штамм метилотрофных дрожжей K. phaffii CF-st401 получен ООО «Бирюч»;
- главный клеточный банк трансформированных метилотрофных дрожжей был подготовлен из одной колонии и выращен на минимальной среде MD, не содержащей лейцина. ДНК векторной последовательности была секвенирована для видовой идентификации ООО «Бирюч»;
- молекулярная масса синтезируемого K. phaffii CF-st401 «сладкого белка браззеина» 6,5 кДа. Штамм является митотически стабильным. Внехро-мосомные элементы отсутствуют. При разработке штамма методы направленного мутагенеза не использовались;
- генотип K. phaffii CF-st401 не содержит детерминант патогенности (вирулентности), антибиотикорези-стентности, токсигенности, способности к продукции вторичных метаболитов, оказывающих негативное действие на организм человека и животных. С целью обеспечения безопасности селективные маркеры (бактериальный ген устойчивости к ампициллину) были удалены из векторной плазмиды при помощи эндонуклеазы в сайте рестрикции Sbf1;
- в процессе производства штамма K. phaffii CF-st401 антибиотики не использовались.
Таким образом, данные, содержащиеся в паспорте штамма K. phaffii CF-st401 (продуцента браззеина), включают сведения, необходимые для дальнейшей оценки возможности его безопасного использования в пищевой промышленности в качестве пищевого компонента3.
3 Технический регламент Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012)
Рис. 1. Участок Komagataella phaffii CF-st401, кодирующий ген устойчивости к ампициллину Fig. 1. Region of Komagataella phaffii CF-st401, encoding the ampicillin resistance gene
С целью анализа возможности безопасного использования для потребителей «сладкого белка браззеина», сотрудниками ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» при помощи методов биоинформатики (in silico) проведены исследования заявленной в паспорте штамма структуры ДНК векторной последовательности K. phaffii CF-st401 (ее соответствия последовательности, кодирующей синтез эталонного белка из растения P. brazzeana, наличие локусов антибиотикоустойчивости и аллергенности).
Структуру встраиваемой в K. phaffii CF-st401 плаз-миды сравнивали с последовательностью нуклео-тидов, отвечающей за синтез молекулы браззеина в P. brazzeana, опубликованной в базе данных UniProtKB/ SwissProt (дата обращения 30.08.2023). Выравнивание нуклеотидной последовательности проводили с помощью программы BLASTX 2.14.1+ (https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi). Достоверность полученных результатов выравнивания нуклеотидной последовательности оценивали путем рассмотрения E-значения и бит-оценки.
С помощью сервиса iCn3D, доступного в NCBI (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/), осуществили предсказание вторичной структуры транслированной последовательности рекомбинантного браззеина. Достоверность полученного результата оценивали на основе показателя достоверности AlphfFold Confidence (pLDDT) по шкале от 0 до 100. База данных AlphaFold Protein Structure Database (pLDDT) используется для предсказания трехмерной структуры белка на основе его аминокислотной последовательности. Нулевая гипотеза предполагает, что области с pLDDT смоделированы с точностью >90%. Точность совпадений pLDDT от 70 до 90% свидетельствует о хорошо смоделированной модели, а совпадения с pLDDT от 70% и ниже имеют низкую достоверность.
В соответствии с паспортом штамма K. phaffii CF-st401 в состав векторной последовательности плазмиды в качестве селективного агента был включен бактериальный ген устойчивости к ампициллину в виде открытой рамки считывания (ORF 1) и бактериальный орид-жин репликации pBR322. Далее, с целью обеспечения безопасности для здоровья человека, селективные маркеры, после включения плазмиды в штамм-реципиент и репликации, в соответствии с паспортом, удаляются из плазмиды по сайтам узнавания эндонуклеазной рестрикции Sbfl (рис. 1).
Оценку потенциальной аллергенности белков и пептидов in silico проводили с использованием двух рецензируемых баз данных об аллергенах в соответствии с рекомендациями Комиссии Кодекса Алиментариус и Продовольственной и сельскохозяйственной организации (ФАО)/Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ): Allergome и Allermatch. Потенциальная аллергенность рекомбинантного браззеина была оценена с помощью серии поисков гомологии последовательности с белками аллергенами из базы данных AllergenOnline (https://www.allergome.org/) и базы данных Allermatch (https://allermatch.org/). Поиски гомологии последовательности проводили поэтапно в соответствии с рекомендациями Кодекса Алиментариус и ФАО/ ВОЗ с использованием скользящего 80-аминокислот-ного окна, полученного из полноразмерной последовательности браззеина, а также 8-аминокислотного точного соответствия. Кроме того, был проведен поиск гомологий с полной аминокислотной последовательностью «дикого» браззеина из P. brazzeana. Для скользящего окна с 80 аминокислотами использовали процентный отрезок идентичности в 35% для определения того, существует ли значительная гомология последовательности между браззеином и аллергенным белком. А также рассматривали E-значение и бит-оценку как индикаторы того, отражают ли совпадения биологически значимое сходство (рис. 2).
Для оценки возможных рисков, связанных с интеграцией плазмиды в геном штамма-реципиента, осуществили функциональную и структурную аннотацию плазмиды М4794 и линейного участка ДНК, введенной в геном с использованием трех сервисов для аннотирования последовательностей: bakta web (Software: 1.8.11 DB: 5.0.0), веб-сервиса addgene (https://www.addgene.org/) и локальной программы SnapGene Viewer (версия 7.0.2). Наличие локусов антибиотикоустойчивости оценивали в ResFinder (версия 4.3.3). Полученные результаты сравнивали с информацией, представленной в паспорте штамма ГМ K. phaffii CF-st401.
Общее выравнивание нуклеотидной последовательности встроенного гена «сладкого белка браззеина», оптимизированного для экспрессии в K. phaffii CF-st401, проводили по отношению к белковым молекулам из базы данных UniProtKB/SwissProt. Параметры: матрица замен -BLOSUM 62; длина последовательности запроса -152; идентификатор запроса: 9947.
Copy-paste your amino acid sequence here:
Algorithm:
an 80-amino-acid sliding window alignment 135 ) | Cut-off Percentage (only applicable to ihe 80-amino-acid sliding window) O Look for a small exact wordmatch ] Wordlength (only applicable to the exact wordmatch search) O Do a full FASTA alignment
Select a database: AllergenDB propeptides removed
Go
Рис. 2. Оценка плазмиды М4794 и линейного участка ДНК, использованного для интеграции в геном штамма Komagataella phaffii CF-st401 Fig. 2. Evaluation of the M4794 plasmid and the linear DNA segment used for integration into the genome of the Komagataella phaffii strain CF-st401
Protein P56552
P565S2 A
Query: Query_9947
Рис. 3. Результат выравнивания нуклеотидной последовательности встроенного гена браззеина
Protein P56552_A - последовательность ДНК эталонного белка браззеина из P. brazzeana; Query_9947 - последовательность ДНК, кодирующая синтез «сладкого белка браззеина».
Fig. 3. Result of alignment of the nucleotide sequence of the integrated brazzein gene
Protein P56552_A is the DNA sequence of the reference protein brazzein from P. brazzeana; Query_9947 - DNA sequence encoding the synthesis of the "Sweet protein Brazzein".
Результаты
Результаты геномного анализа гомологии структуры «сладкого белка браззеина», получаемого с использованием К. phaffii CF-st401 и из Р. Ьгаггеапа
Результат локального выравнивания BLASTX, представленный на рис. 3, свидетельствует о том, что с высокой степенью достоверности синтезированная последовательность ДНК, кодирующая синтез «сладкого белка браззеина», была гомологична анализируемой последовательности ДНК с ДНК дефензиноподобного белка браззеина (Е=1.2е-38) (UniProtKB/Swiss-Prot: Р56552.1) из P. brazzeana.
Анализ предсказанной вторичной структуры рекомби-нантного белка браззеина из K. phaffii СР^401 показал, что все ее области находятся в диапазоне pLDDT 70% и выше, что говорит о правильной интерпретации анализируемой векторной последовательности нуклеотидов и достаточной степени гомологии полученной структуры браззеина рекомбинантного с браззеином растительного происхождения (рис. 4).
Оценка аллергенности «сладкого белка браззеина» из K. phaffii CF-st401 в условиях in silico
Совпадения гомологии последовательности встроенного в геном K. phaffii CF-st401 гена браззеина с какими-либо известными аллергенами из базы данных Allergome или базы данных Allermatch имели менее 35% идентичности во всех 80-аминокислотных скользящих окнах. Также не были идентифицированы 8-аминокис-лотные точные совпадения с какими-либо известными аллергенами. Таким образом, структура вставки ДНК K. phaffii CF-st401 предполагает отсутствие способности «сладкого белка браззеина» вызывать аллергические реакции.
Оценка плазмиды М4794 и линейного участка ДНК (экспрессионной кассеты), использованного для интеграции в геном штамма K. phaffii CF-st401
В соответствии с паспортом размер плазмиды М4794, используемой для включения в геном штамма K. phaffii, составляет 7646 пар оснований и состоит из ряда
ключевых структурных элементов. В ходе проводимых исследований была проверена согласованность ключевых элементов плазмиды с заявленной в паспорте информацией. В процессе тестирования плазмиды не обнаружено кассет коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (С^БРЯ).
Другие структурные составляющие плазмиды М4794, согласно паспорту K. phaffii CF-st401, представлены геном, кодирующим продукцию 3-изопропилмалат дегидрогеназы из Saccharomyces cerevisiae ^Е112), и экспрессионной кассетой. С использованием методов т silico показано, что экспрессионная кассета состоит из промотора АОХ1 из К. phaffii, сигнального пептида полового феромона а-фактора из S. cerevisiae, последовательности белка браззеина из Р. Ьганеапа и терминатора транскрипции АОХ1 из К. phaffii и участков хромосом (плечи) - гомологичных последовательностям, предназначенным для включения в геном штамма-реципиента. Таким образом, заявленная структура плазмиды была подтверждена в ходе биоинформационного анализа.
Результаты аннотации нуклеотидной последовательности линейного фрагмента ДНК, использованного для интеграции в геном К. phaffii, подтвердили отсутствие в ее составе гена устойчивости к ампициллину и бактериального ориджина, отвечающего за репликацию рВЯ322 у К. phaffii СР-э1401 (в позиции 5654 и 1222) (рис. 5).
С использованием методов биоинформационного анализа подтверждено соответствие конструкции векторной последовательности штамма К. phaffii СР-э1401 заявленной в паспорте структуре, показана возможность безопасного использования ГМ штамма К. phaffii СР-э1401 в производстве «сладкого белка браззеина».
Обсуждение
Изменение последовательности ДНК технологических штаммов в результате мутаций или генетических модификаций может привести не только к увеличению количества продуцируемых ими пищевых компонентов, но и к усилению и/или появлению у них свойств пато-генности, антибиотикорезистентности, аллергенности, способности к продукции токсинов, а также к изменению молекулярной структуры синтезируемых ими пищевых веществ. С целью исключения возможного негативного действия таких пищевых компонентов на здоровье потребителей, необходим комплекс токсикологических исследований [7, 11, 16]. В последние годы в ряде стран в процессе анализа свойств микроорганизмов, в том числе технологических, все шире применяются биоинформационные методы [17].
Оценка свойств последовательности нуклеотидов векторной вставки генетически модифицированного микроорганизма К. phaffii СР-э1401 - продуцента «сладкого белка браззеина», проведенная с помощью методов т sШco, продемонстрировала, что синтетическая
N-конец
BLAST, Е: 1.2е-38
Цвет по AlphaFold Confidence (pLDDT)
I Очень высокий (pLDDT >90)
□ Умеренный (90> pLDDT >70)
□ Низкий (70> pLDDT >50)
□ Очень низкий (pLDDT <50)
Рис. 4. Вторичная структура рекомбинантного «сладкого белка браззеина»
Fig. 4. Secondary structure of the recombinant «Sweet protein Brazzein»
Рис. 5. Позиции элементов эндонуклеаз рестрикции на плазмиде М4794
Fig. 5. Positions of restriction endonuclease elements on plasmid M4794
нуклеотидная последовательность, кодирующая синтез «сладкого белка браззеина», соответствовала на 70% и выше структурной формуле эталонного белка браззе-ина, получаемого из плодов растения Р. Ьюнеапа. Биоинформационный анализ нуклеотидной вставки показал, что исследуемый штамм не способен к продукции токсинов, антибиотиков и аллергенов. Использование методов т sШco в качестве скрининговых позволит
повысить эффективность и точность проводимых на последующих этапах оценки рисков здоровью потребителей пищевой продукции нового вида, получаемой микробным синтезом.
Заключение
Проведенный анализ структуры векторной последовательности ДНК ГМ-штамма K. phaffii CF-st401 подтвердил обоснованность применения биоинформационных
методов для предсказания свойств штаммов-продуцентов пищевых компонентов. Предложенный подход может быть рекомендован для включения в систему оценки безопасности технологических микроорганизмов в Российской Федерации для скринингового исследования их свойств.
Вместе с тем решение о возможности безопасного использования данной формы браззеина может быть принято только после проведения токсикологических исследований in vivo с использованием подопытных животных.
Сведения об авторах
Гурэу Зинаида Геннадиевна (Zinaida G. Gureu) - аспирант лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-6939-5843
Багрянцева Ольга Викторовна (Olga V. Bagryantseva) - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», профессор кафедры гигиены питания и токсикологии ИПО ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0003-3174-2675
Новикова Дарья Сергеевна (Daria S. Novikova) - начальник управления по продукции АПК ООО «Бирюч» (Белгородская обл., мкр-н Красногвардейский, с.п. Стрелецкое, п. Белая Вежа, Российская Федерация) E-mail: [email protected]
Хотимченко Сергей Анатольевич (Sergey A. Khotimchenko) - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией пищевой токсикологии и оценки безопасности нанотехнологий ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», профессор кафедры гигиены питания и токсикологии ИПО ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (Москва, Российская Федерация) E-mail: [email protected], https://orcid.org/0000-0002-5340-9649
Литература
1. Тутельян В. А., Никитюк Д.Б. Ключевые проблемы в структуре потребления пищевой продукции и прорывные технологии оптимизации питания для здоровьесбережения населения России // 8. Вопросы питания. 2024. Т. 93, № 1. С. 6-21. DOI: https://doi.org/ 10.33029/0042-8833-2024-93-1-6-21
2. Багрянцева О.В. Обоснование необходимости разработки мероприятий по управлению рисками, связанными с использова- 9. нием пищевой продукции, производимой при помощи микробного синтеза // Вопросы питания. 2020. Т 89, № 2. С 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10017
3. Yamada Y., Matsuda M., Maeda K., Mikata K. The phylogenetic rela- 10. tionships of methanol-assimilating yeasts based on the partial sequences
of 18S and 26S ribosomal RNAs: the proposal of Komagataella gen. nov. (Saccharomycetaceae) // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. Vol. 59, N 3. P. 439-444. DOI: https://doi.org/10.1271/bbb.59.439
4. De Schutter K., Lin Y.C., Tiels P., Van Hecke A., Glinka S., WeberLehmann J. et al. Genome sequence of the recombinant protein 11. production host Pichia pastoris // Nat. Biotechnol. 2009. Vol. 27, N 6.
Р. 561-566. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.1544
5. Наумова Е. С., Боунди-Миллс К.Л., Наумов Г.И. Филогенетика и биогеография важных для биотехнологии метилотрофных дрожжей Komagataella // Микробиология. 2020. T. 89, № 3. С. 308-314. DOI: https://doi.org/10.31857/S002636562003012X
6. Valli M., Grillitsch K., Grunwald-Gruber C., Tatto N.E., Hrobath B., 12. Klug L. et al. A subcellular proteome atlas of the yeast Komagataella phaffii // FEMS Yeast Res. 2020. Vol. 20, N 1. foaa001. DOI: https:// doi.org/10.1093/femsyr/foaa001
7. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ord A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly M. 13. et al. Update of the list of qualified presumption of safety (QPS) recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 18: suitability of taxonomic units notified to EFSA
until March 2023 // EFSA J. 2023. Vol. 21, N 7. Article ID е8092. DOI: https://doi.Org/10.2903/j.efsa.2023.8092
Bustos C., Quezada J., Veas R., Altamirano C., Braun-Galleani S., Fickers P. et al. Advances in cell engineering of the Komagataella phaffii platform for recombinant protein production // Metabolites. 2022. Vol. 12, N 4. Р. 346. DOI: https://doi.org/10.3390/metabo12040346 Barone G.D., Emmerstorfer-Augustin A., Biundo A., Pisano I., Coccetti P., Mapelli V. et al. Industrial production of proteins with Pichia pastoris — Komagataella phaffii // Biomolecules. 2023. Vol. 13, N 3. Р. 441. DOI: https://doi.org/10.3390/biom13030441 EFSA Panel on Food Contact Materials, Enzymes and Processing Aids (CEP); Silano V., Barat Baviera J.M., Bolognesi C., Breuschweiler B.J., Cocconcelli P.S., Crebelli R. et al. Safety evaluation of the food enzyme phospholipase C from a genetically modified Komagataella phaffii (strain PRF) // EFSA J. 2019. Vol. 17, N 4. Article ID e05682. DOI: https://doi.org/10.2903Zj.efsa.2019.5682
EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP); Bampidis V., Azimonti G., Bastos M.L., Christensen H., Durjava M., Dusemund B. et al. Efficacy of a feed additive consisting of endo-1,4-beta-xylanase produced by Komagataella phaffii ATCCPTA-127053 (XygestTMHT) for all poultry species (Kemin Europa N.V.) // EFSA J. 2023. Vol. 21, N 6. Article ID e08047. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8047
Saraiva A., Carrascosa C., Ramos F., Raheem D., Pedreiro S., Vega A. et al. Brazzein and monellin: chemical analysis, food industry applications, safety and quality control, nutritional profile and health impacts // Foods. 2023. Vol. 12, N 10. Р. 1943. DOI: https://doi. org/10.3390/foods12101943
Neiers F., Belloir C., Poirier N., Naumer C., Krohn M., Briand L. Comparison of different signal peptides for the efficient secretion of the sweet-tasting plant protein brazzein in Pichia pastoris // Life (Basel). 2021. Vol. 11, N 1. Р. 46. DOI: https://doi.org/10.3390/life11010046
14. Zhenga X., Yi T.S. The plastid genome of Pentadiplandra brazzeana Baillon (Pentadiplandraceae) // Mitochondrial DNA B Resour. 2019. Vol. 4, N 2. P. 4002-4003: DOI: https://doi.org/10.1080/23802359.2019. 1688102
15. EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food 17. (ANS) ; Younes M., Aggett P., Aguilar F., Crebelli R., Dusemund B., Filipic
M. et al. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavailability of nutrient from the sources (Revision 1) // EFSA J. 2021. Vol. 19, N 3. Article ID e06552: DOI: https://doi.org/10.2903Xi.efsa.2021.6552
16. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Ricci A., Allende A., Bolton D., Chemaly M., Davies R., Girones R. et al. Scientific
Opinion on the update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA // EFSA J. 2017. Vol. 15, N 3. Article ID e04664. DOI: https://doi.org/10.2903/ j.efsa.2017.4664
EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ordonez A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly A. et al. Update of the list of qualified presumption of safety (QPS) recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 19: suitability of taxonomic units notified to EFSA until September 2023 // EFSA J. 2024. Vol. 22, N 1. Article ID e8517. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2024.8517
References
Tutelyan V.A., Nikityuk D.B. Key challenges in the dietary intake structure and cutting edge technologies for optimizing nutrition to protect the health of the Russian population. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2024; 93 (1): 6-21. DOI: https://doi.org/10.33029/0042-8833-2024-93-1-6-21 (in Russian)
Bagryantseva O.V. Study on the development of measures to manage the risks associated with the food produced using microbial synthesis. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (2): 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0042-8833-2020-10017 (in Russian) Yamada Y., Matsuda M., Maeda K., Mikata K. The phylogenetic relationships of methanol-assimilating yeasts based on the partial sequences of 18S and 26S ribosomal RNAs: the proposal of Komagataella gen. nov. (Saccharomycetaceae). Biosci Biotechnol Biochem. 1995; 59 (3): 439-44. DOI: https://doi.org/10.1271/bbb.59.439 De Schutter K., Lin Y.C., Tiels P., Van Hecke A., Glinka S., WeberLehmann J., et al. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat Biotechnol. 2009; 27 (6): 561-6. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt.1544
Naumova E.S., Boundy-Mills K.L., Naumov G.I. Phylogenetics and biogeography of biotechnologically important methylotrophic yeast Komagataella. Mikrobiologiya [Microbiology]. 2020; 89 (3): 308-14. DOI: https://doi.org/10.31857/S002636562003012X (in Russian) Valli M., Grillitsch K., Grünwald-Gruber C., Tatto N.E., Hrobath B., Klug L., et al. A subcellular proteome atlas of the yeast Komagataella phaffii. FEMS Yeast Res. 2020; 20 (1): foaa001. DOI: https://doi. org/10.1093/femsyr/foaa001
EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ord A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly M., et al. Update of the list of qualified presumption of safety (QPS) recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 18: suitability of taxonomic units notified to EFSA until March 2023. EFSA J. 2023; 21 (7): e8092. DOI: https://doi. org/10.2903/j.efsa.2023.8092
Bustos C., Quezada J., Veas R., Altamirano C., Braun-Galleani S., Fickers P., et al. Advances in cell engineering of the Komagataella phaffii platform for recombinant protein production. Metabolites. 2022; 12 (4): 346. DOI: https://doi.org/10.3390/metabo12040346 Barone G.D., Emmerstorfer-Augustin A., Biundo A., Pisano I., Coccetti P., Mapelli V., et al. Industrial production of proteins with Pichia pastoris - Komagataella phaffii. Biomolecules. 2023; 13 (3): 441. DOI: https://doi.org/10.3390/biom13030441
10. EFSA Panel on Food Contact Materials, Enzymes and Processing Aids (CEP); Silano V., Barat Baviera J.M., Bolognesi C., Breuschweiler B.J., Cocconcelli P.S., Crebelli R., et al. Safety evaluation of the food enzyme phospholipase C from a genetically modified Komagataella phaffii (strain PRF). EFSA J. 2019; 17 (4): e05682. DOI: https://doi. org/10.2903/j.efsa.2019.5682
11. EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP); Bampidis V., Azimonti G., Bastos M.L., Christensen H., Durjava M., Dusemund B., et al. Efficacy of a feed additive consisting of endo-1,4-beta-xylanase produced by Komagataella phaffii ATCCPTA-127053 (XygestTMHT) for all poultry species (Kemin Europa N.V.). EFSA J. 2023; 21 (6): e08047. DOI: https://doi. org/10.2903/j.efsa.2023.8047
12. Saraiva A., Carrascosa C., Ramos F., Raheem D., Pedreiro S., Vega A., et al. Brazzein and monellin: chemical analysis, food industry applications, safety and quality control, nutritional profile and health impacts. Foods. 2023; 12 (10): 1943. DOI: https://doi.org/10.3390/foods12101943
13. Neiers F., Belloir C., Poirier N., Naumer C., Krohn M., Briand L. Comparison of different signal peptides for the efficient secretion of the sweet-tasting plant protein brazzein in Pichia pastoris. Life (Basel). 2021; 11 (1): 46. DOI: https://doi.org/10.3390/life11010046
14. Zhenga X., Yi T.S. The plastid genome of Pentadiplandra brazzeana Baillon (Pentadiplandraceae). Mitochondrial DNA B Resour. 2019; 4 (2): 4002-3: DOI: https://doi.org/10.1080/23802359.2019.1688102
15. EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources added to Food (ANS); Younes M., Aggett P., Aguilar F., Crebelli R., Dusemund B., Filipic M., et al. Guidance on safety evaluation of sources of nutrients and bioavailability of nutrient from the sources (Revision 1). EFSA J. 2021; 19 (3): e06552: DOI: https://doi.org/10.2903Zj.efsa.2021.6552
16. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Ricci A., Allende A., Bolton D., Chemaly M., Davies R., Girones R., et al. Scientific Opinion on the update of the list of QPS-recommended biological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA. EFSA J. 2017; 15 (3): e04664. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2017.4664
17. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ); Koutsoumanis K., Allende A., Alvarez-Ordonez A., Bolton D., Bover-Cid S., Chemaly A., et al. Update of the list of qualified presumption of safety (QPS) recommended microbiological agents intentionally added to food or feed as notified to EFSA 19: suitability of taxonomic units notified to EFSA until September 2023. EFSA J. 2024; 22 (1): e8517. DOI: https://doi. org/10.2903/j.efsa.2024.8517
2
4
6
7
8
9.
