CC BY
21
Рис. 4. АСМ-изображение препаратов белков Sap (a) и ЕА1 (б), выделенных из штамма В. anthracis Sterne 34F2 ДТ (Prf ) после диализа и высушивания на поверхности слюды (сила взаимодействия острия и поверхности 2,6 нН). Размеры участков сканирования составляют 60x60 нм (а) и 100x500 нм (б)
ченность наноструктуры образуемых ими слоев. Полученные данные согласуются. с результатами, приведенными в статье [9].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Байбурин В.Б., Волков Ю.П., Коннов Н.П. Многофункциональный комплекс сканирующей зондовой микроскопии и его применение. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - 120 с. - 2. Вайнштейн Б.К. Электронная микроскопия атомного разрешения // УФН. - 1987. - Т. 152. - С. 75-122,- 3. Иваницкий Г.Р., Кринский В.И., Сельков Е.Е. Математическая биофизика клетки. - М.: Наука. - 1978. -308 с. - 4. Коннов Н.П., Байбурин В.Б., Волков .Ю.П. и др.// Пробл. особо опасных инф. - 2002. - Вып.' 1(83). -С. 90-96. - 5. Северина JI.O. // Микробиология.- 1995. — Т. 64, №6. - С. 725-733. - 6. Austin J.W., Stewart М., Murray R. //J. Bacteriol. - 1990. - Vol. 172, N 2. - P. 808-817. -7. Bahl H., Scholz H., Bayan N. eia/. // FEMS Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 20. - P. 47-98. - 8. Caston J.R., Beren-guer J., Kocsis E. et cd. Hi. Struct. Biology. - 1994. - Vol. 113, N2. - P. 164-176,- 9. Couture-Tosi E., Delacroix H., Mignot T. et al. II J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, N23. -P. 6448-6456. - 10. Ezzell J., Abshire T. // Infect. Immun. -
1988. - Vol. 56, N 2. - P. 349-356. - 11. Farchaus J., Ribot W., Downs M. et al. II i. Bacteriol. - 1995. - Vol. 177. -P. 2481-2489. - 12. Mock M., Fouet A. II Microbiol. Rev. -2001.-Vol. 55.-P. 647-671.- 13. Sleytr U., Messner P.//J. Bacteriol.- 1998.-Vol. 170.-P. 2891-2897.
N.P.Konnov, Yu.P.Volkov, A.Yu.Korsakova, T.V.Danilova, N.I.Mikshis, A.O.Manturov, O.S.Kuznetsov, Yu.A.Popov, M.N.Kireyev 1
Transmission Electron and Scanning Power Microscopic Studies of Bacillus anthracis S-Layer Proteins
Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe", Saratov;
Saratov State Technical University
S-layer proteins of the anthrax pathogen were studied using the methods of transmissive electron microscopy (ТЕМ) and scanning atom-power microscopy (АРМ). To analyse the hidden image of the protein structure, the direct Fourier transform method was used which elucidated strictly expressed periodic nature and wave-like symmetry of the nanostructures. Three-dimensional nanostructural organization of the proteins could be seen by means of the АРМ procedure.
Поступила 15.03.04.
УДК 616.932:616.988.21 ■
В.В.Лобанов, В.В.Сухарь, Н.И.Пасюкова, А.В.Миронова
ГИДРОФОБНОСТЬ VIBRIO CHOLERAE И КОЛОНИЗАЦИЯ КИШЕЧНИКА
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Представлены данные, свидетельствующие о множественности факторов, причастных к колонизации кишечника холерными вибрионами. Адгезию и колонизацию во многом определяют их гидрофобные свойства. Прилипание вибрионов к эпителию тонкой кишки осуществляют, видимо, пили адгезии, а к слизи - гидрофобные группировки липополисахарида. R-мутанты, вследствие высокой чувствительности к комплементу, не способны размножаться в тонком кишечнике новорожденных мышей и крольчат, но способны задерживаться в толстой кишке, по крайней мере, 24 ч.
Колонизация тканей животных микроорганиз- с адгезии бактерий к слизи и затем к тканям-мише-
мами является важным моментом инфекционного ням, что позволяет относить адгезины к факторам
процесса. При кишечных инфекциях она начинается патогенности [4, 5]. Для неинвазивных энтеропато-
генных микробов, к которым относится V. chàlerae, прикрепление к эпителию ворсинок тонкого кишечника наиболее важный этап колонизации [12]. В просвете кишечника этому мешает слизь, для преодоления которой вибрионы используют гидрсшазы муцина [14] и механическое движение.. Ведущую роль в прикреплении бактерий к слизи и эпителию играет их гидрофобность. Успех колонизации слизистой тонкого кишечника холерными вибрионами во многом определяется способностью образовывать фимбрии (пили IV типа) - наиболее гидрофобные структуры, имеющие на конце кластер гидрофобных аминокислот [2, 8]. Существенную роль в колонизации должен играть липополисахарид (ЛПС), но поскольку он . амфифилен у разных штаммов гидрофобность выражена по-разному. Было выявлено [13], что у холерных вибрионовЮ139 серогруппы отсутствие О-боковой цепи ЛПС или капсульного полисахарида сопутствует снижению колонизации тонкого кишечника новорождённых мышей. Авторы высказывают предположение,«что в этом случае -усиление свойств R-формы снижает устойчивость штаммов к бактерицидным факторам макроорганизма. До настоящего времени нет единого мнения о роли разных факторов в обеспечении колонизации кишечника холерными вибрионами.
Цель нашей работы - изучить у холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп влияние гидрофобных свойств на колонизацию кишечника различных экспериментальных животных.
Материалы и методы
В работе использовано 20 штаммов V. cholerae, среди которых 7 типичных представителей 01:'серо-группы биовара eltor , 1 - классического биовара, 4 штамма 0139 серогруппы (Индия), 5 - V. cholerae, выделенные из воды и агглютинирующиеся ¡сывороткой 0139 Ростовского*противочумного института, 1 - нитрозогуанидиновый мутант V. ch'olerae 0139, утративший способность агглютинироваться этой сывороткой [6], 1 - V. cholerae R-формы, 1 -V. cholerae биовара eltor RS-формы. Генотипирова-ние штаммов проводили методом ПЦР: изучали наличие генов ctxA, ctxAB, tcpA (структурного гена TCP холерных вибрионов eltor). Степень гидрофоб-ности культур характеризовали двумя методами. Метод межфазного перераспределения микробных взвесей [11] выполняли, используя холерные, вибрионы, выращенные на агаре Хоттингера, pH 7,2. Визуально оценивали степень мутности водной фазы после интенсивного встряхивания бактериальной взвеси в смеси гептан/вода. Методом Faris [15] выявляли самоагглютинацию (агрегацию) бактерий в растворах разных концентраций сульфата аммония. Холерные вибрионы выращивали либо на агаре Мартена (pH 7,7), либо в условиях AKI, способствующих пилеобразованию in vitro [12]. Вибрионы с высокой гидрофобностью агрегировали при более низких концентрациях сульфата аммония (0,4-0,9 моля), гидрофильные при высоких (1,0 М и выше). Подвижность вибрионов определяли в U-образ-ных трубках, заполненных 0,3 % агаром Хоттингера. Заражение кроликов-сосунков и оценку адге-
зивных свойств проводили в соответствии с рекомендациями В.В.Короля с соавт.[3]. Колонизацию кишечника новорожденных мышей изучали, используя два пути заражения: внутрижелудочный [9] и ректальный [1]. Количество вибрионов подсчитывали методом серийных разведений с последующим высевом на агаровые пластинки смывов слизи и фильтратов гомогената разных отделов кишечника, полученных одновременно от 10 выживших мышей. Устойчивость к комплементу оценивали по минимальному его разведению, инкубация с которым в течение 2 ч вызывала гибель менее 50 % микробных клеток.
Результаты и обсуждение
Гидрофобность 14 штаммов разного происхождения изучена с помощью метода межфазного перераспределения. Среди 6 наиболее гидрофобных -природный R-мутант V. cholerae и 5'штаммов 01 и 0139 серогрупп «водного» происхождения, один из которых V. cholerae биовара eltor RS-формы. Группу из 6 наиболее гидрофильных штаммов представляют 4 клинических, 1 выделенный из воды и 1 нитрозогуанидиновый мутант. Большинство испытанных штаммов, изолированных из воды, и гидрофобные «шероховатые» объединяет чувствительность к комплементу (1:40- 1:80). Гидрофильные штаммы от больных с полноценным ЛПС отличала устойчивость к комплементу. Результаты изучения гидрофобности в пробе по Faris 20 культур, выращенных в AKI, были следующими. Культивирование в условиях, способствующих пилеобразованию, выявило 10 гидрофобных и 10 гидрофильных штаммов. Среди гидрофобных - 6 штаммов, выделенных от больных, 2 - «шероховатых», 1 - нитрозогуанидиновый мутант и 1 - V. cholerae биовара eltor из воды. Среди гидрофильных штаммов только два выделены от больных, то есть в новых условиях культивирования большинство вирулентных культур (ctx+, tcpA+) стали гидрофобными, предположительно, за счет продукции пилей.
■. Для изучения адгезивной и колонизирующей способности холерных вибрионов были подобраны 5 штаммов различного гено- и фенотипа. Проведено их выращивание на агаре Мартена и в бульоне методом АКТ для выявления гидрофобности. У агаровых культур изучали подвижность, они же были использованы для заражения кроликов-сосунков. Выделенный от больного холерой Bengal штамм Р16064 обладал всеми свойствами вирулентного холерного вибриона: содержал гены ctx и tcpA, имел полноценный ЛПС, был подвижен и устойчив к комплементу в разведении 1:20. Агаровая культура была гидрофильна в пробе по Faris (более 1,0 М) и гидрофобна (0,6 М) после выращивания в условиях AKI. В тонком кишечнике кролика-сосунка она проявила высокую адгезивность (индекс адгезии 10 %). Штамм 18519 (генотипа ctx", tcpA+) выделенный из воды, агглютинировался О-холерной сывороткой до титра, был подвижным, устойчивым к комплементу 1:40. В пробе по Faris агаровая и бульонная культуры оказались гидрофильными. Индекс адгезии при заражении крольчат составлял пример-
но 0,1 %. Другой штамм из воды - 17673, агглютинирующийся сывороткой 0139, авирулентный (ctx~, tcpA~), устойчивый к комплементу 1:40, обладал высокой подвижностью (более 50 мм в сутки) и был гидрофильным в обоих вариантах пробы Fans. В тонком кишечнике через 1,5 ч после заражения крольчат были выделены единичные адгезирован-ные клетки этой культуры, но через 24 ч в гомоге-нате слизистой «промытой» толстой кишки количество жизнеспособных холерных вибрионов превышало число введенных. Мы не обнаружили в тонком кишечнике живых адгезированных клеток R-мутанта RCA385 и нитрозогуанидинового мутанта 16064 НГ6. Оба штамма имели гены ctx и tcpA, были неподвижны, чувствительны к комплементу и гидрофобны. Однако через 24 ч в толстом кишечнике обнаруживались жизнеспособные клетки холерного вибриона RCA385. Опыты in vitro показали, что холерные вибрионы могут в течение 24 ч размножаться в слизи кишечника кроликов-сосунков.
Изучение колонизации на модели новорожденных мышей продемонстрировало, что она возможна при обоих путях заражения. При инокуляции в желудок через 1,5 ч мы наблюдали адгезию слизистой тонкого кишечника вирулентной культурой 0139 серогруппы V. cholerae Р16064. Атоксигенная культура 17673 не адгезировала на клетках верхних отделов кишечника, но через 1,5 ч почти весь иноку-лят (п-10 млн м.к.) сохранился в смывах слизи. При введении холерных вибрионов per rectum отмечали их продвижение вверх. Через 24 ч в трех случаях из пяти вибрионы достигали верхнего отдела тонкой кишки. В течение этого срока введенные per rectum вирулентные (V. cholerae 569В классического био-4 - вара, V. cholerae Р16064 серогруппы 0139) и авиру-лентные (V. cholerae RCA385, V. cholerae 17673) культуры колонизовали кишечник мышей, но по-разному. Количество жизнеспособных вибрионов авирулентных штаммов в неотмытых кишечниках на два порядка превышало таковое вирулентного -Р16064. Это позволяет предположить, что колонизация кишечника новорожденных мышей при отсутствии адгезии к эпителию происходит за счет взаимодействия гидрофобных структур ЛПС со слизью. Инфекционный процесс при этом не развивается. Авирулентные штаммы из воды способны задерживаться в слизи верхнего отдела тонкого кишечника и в толстой кишке, где продукция комплемента значительно снижена [5, 7].
Использованные нами для заражения культуры были выращены в условиях, не приспособленных для пилеобразования, и можно предполагать, что в прилипании к слизи причастны гидрофобные составляющие ЛПС - метальные и ацетильные группы боковых цепей и жирных кислот. Гидрофоб-ность поверхности R-мутантов в этом случае дает преимущество, но одновременно делает вибрионы более чувствительными к комплементу. В опытах
по межфазному перераспределению выявлена гид-рофобность культур из воды и «шероховатых». Эти штаммы не колонизуют слизистую тонкого кишечника, но в некоторых случаях способны задерживаться в слизи и в толстом кишечнике [5]. В прикреплении к эпителию тонкой кишки преимущество имеют вибрионы генотипа ctx+, tcpA+ [8, 12], которые способны к экспрессии пилей в кишечнике. Такой способностью, по-видимому, обладает штамм V. cholerae биовара eltor 18519 генотипа ctx', tcpA+, который в наших опытах колонизовал эпителий тонкого кишечника крольчат. Наличие токсин-коре-гулируемых пилей, которые являются не только колонизирующим фактором, но и рецепторами для лизогенного бактериофага СТХф, делает подобные штаммы потенциально опасными [10].
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ефремов В.Е. // Эпидемиол. и профилакт. инф. бол. -1977. - С. 71-74. - 2. 3aflHoeá С.П., Топорков A.B., Новикова О.В., Смирнова Н.И. // Биотехнол. - 2003. -№ 1. - С. 79-84. - 3. Король В. В., Смоли ко ва Л.М., Сомова А.Г. , Эмдина И.А. // Журн. микробиол. - 1989. -№9. - С. 18-22. - 4.Костюкова H.H. // Там же. - С. ЮЗ-111,- 5.Лобанова Л.H., Сомова А.Г. , Смоликова Л.М. , Лобанов В.В. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1994. - Вып. 6. - С. 136-143. - 6. Лобанов В.В., Шес-тиалтынова И.С., Агафонова В.В. и др. // Журн. микробиол. - 2003. - № 3. - С. 81-82. - 7. Angelichio М. J., Spector J., Waldor М.K., С a m i 11 i A. // Infect. Immun. - 1999. -Vol. 67, N 8. - P. 3733-3739. - 8. Chiang Su L., Mekalanos J.J. // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67, N2. - P. 976-980. -
9.Dean A.L., Ching С.-Y., Williams R.L., Harden L.B. // J. Infect. Dis. - 1972. - Vol. 125, N4,- P. 407-411. -
10. Faruque S.M., Kamruzzaman H., Meraj J.M.//Infect. Immun.-2003.-Vol. 71.-P. 1020-1025. - 11. Gibbons R. J., Etherden D. // Infect. Immun. - 1983. - Vol. 41, N 3. - P. 1190— 1196.-12.Lee S.H., Hava D.L., Waldor M.K., Camilli A. // Cell. - 1999. - Vol. 99, N 6. - P. 625-634. - 13. Nesper J., Schild S., Lauriano C. // Infect. Immun. - 2002. - Vol. 70. -P. 5990-5996. - 14. Stewart-Tull D.E. S., Ollar R.A., Scobie T.S. // J. Med. Microbiol. - 1986. - Vol. 22. - P. 325-337. - 15.Taylor R.K., Miller V.B., Furlong D.B., Mekalanos J.J.// PNAS . USA. - 1987. - Vol. 84. -P. 2833-2837.
V.V.Lobanov, V.V.Sukhar’, N.l.Pasiukova, A.V.Mironova
Hydrophobic Properties of Vibrio cholerae and Intestinal Colonization
Rostov-On-Don Anti-Plague Research Institute
The data presented in the paper are indicative of sufficient multiplicity of the factors involved into the process of intestinal colonization by the cholera vibrios. Adhesion and colonization characteristics are determined to a great extent by their hydrophobic properties. The pili of adhesion are likely to accomplish the function of adherence of the vibrios to the small-intestine epithelium, while lipopolysaccharide hydrophobic groups facilitate adherence to the mucus. R-mutants, due to their high sensitivity to the complement, are unable of propagation in the small intestine of new-born mice and rabbits, however, demonstrating a tendency to retention in the large intestine for at least 24 hours.
nocTymma 11.05.04
