CC BY
100
УДК 578.52/636.09
ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (BLV): НАУЧНЫЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
П.Н. СМИРНОВ, доктор ветеринарных наук, зав. кафедрой
Н.В. БАТЕНЁВА, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
И.В. МИХНОВИЧ, аспирант Новосибирский ГАУ E-mail: [email protected].
Резюме. Знание генотипов вируса лейкоза крупного рогатого скота - важное звено диагностических и оздоровительных мероприятий в стадах, неблагополучных по BLV. Исследования проводили с целью генотипирования вариантов BLV, распространенных у крупного рогатого скота Новосибирской области и Краснодарского края, по генам gag и env. Вирус лейкоза крупного рогатого скота генетически неоднороден и представлен как минимум одиннадцатью генотипами, которые в разной степени распределены в хозяйствах Краснодарского края и Новосибирской области, что связано с породной принадлежностью крупного рогатого скота и местом районирования.
Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, gag ген, еnv ген, генотипирование, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
Инфекционные ретровирусы, в том числе вирус лейкоза КРС (BLV), имеют три основных структурных гена, кодирующих вирусные протеины в следующем порядке 5’gag - pol - env’.
Ген gag (специфичный для ретровирусов) кодирует белки, формирующие «сердцевину» вируса, которые необходимы для его внутриклеточной сборки и высвобождения из клетки. Ген pol кодирует ферментную систему (обратную транскриптазу, интегра-зу, рибонуклеазу), env - белки, которые определяют способность вируса выходить за пределы клетки и инфицировать другие.
Кроме того, для синтеза вирусных частиц необходимо наличие в геноме Х-региона, расположенного между оболочкой и длинным концевым 3’ повтором [1...3], который также выявлен у дельтаретровирусов [4, 5]. Выявленные при филогенетическом анализе по pol гену структурные различия штаммов BLV разных географических регионов не превышают 6 %, что свидетельствует об их значительно консервативности [6.10]. Причины высокой геномной стабильности до сих пор не установлены. Существует предположение, что она вызвана точностью обратной транскрипции или строгим ограничением репликации.
Кроме структурных генов у ретровирусов есть регуляторные - tat, rev, nef и др. Однако предметом нашего внимания были структурные гены gag и env, их разнородность и частота регистрации генотипов в зависимости от породной и территориальной принадлежности инфицированного крупного рогатого скота.
Изучение генотипических характеристик вируса
- важнейшая биологическая проблема. Нет сомнения в том, что, осуществляя массовые ветеринарнопрофилактические обработки скота (вакцинации, противопаразитарные мероприятия, использование антибиотиков при лечении хронических инфекционных болезней), мы прямо или косвенно воздействуем и на BLV, циркулирующий в организме и в популяции животных, оказывая определенное влияние на взаимоотношения между организмом и вирусом [11].
По-видимому, в этой связи не случайным было выявление [2, 12] факта повышения агрессивности BLV I генотипа, выразившегося в сокращении сроков реализации лейкозогенных потенций этого вируса.
Такое направление исследований нужно продолжить, поскольку оно представляет как общебиологическое, так и прикладное значение. Следует отметить, что изначально научный поиск проведен по env гену BLV провируса [9, 11, 13.16], а по наиболее чувствительному, позволяющему диагностировать инфекцию BLV на наиболее ранних стадиях вирусоносительства, gag гену есть лишь единичные исследования [17].
В связи с этим целью нашей работы было генотипирование провируса лейкоза крупного рогатого скота, выделенного из крови животных разной породной и территориальной принадлежности по генам gag и env.
Условия, материалы и методы. Объектом исследований был крупный рогатый скот черно-пестрой голштинизированной, красной степной и айрширской пород нескольких хозяйств с высоким уровнем инфи-цированности стад вирусом лейкоза в Новосибирской области и Краснодарском крае. Состояние инфициро-ванности животных BLV регистрировали при помощи тест-системы «РИД в агаровом геле с антигеном gp51 вируса лейкоза крупного рогатого скота» с сыворотками крови животных.
Генотипирование по гену gag проводили модифицированным методом ПЦР-ПДРФ с использованием рестриктаз НАЕIII, Nla III, Tsp 5091. Поиск консервативных последовательностей фланкирующих генов осуществляли путем сравнительного анализа 6 вариантов последовательности гена, представленных в GenBank. Структуру праймеров оптимизировали с использованием программы «Printer3 Output» 5’tgacccaacaatcagctcag и 5’gtcgggaaggttgtcagcta [18].
Оптимальный режим амплификации и температуры отжига выбирали исходя из длины амплифицируемого фрагмента после проведения температурного градиента. Количество циклов подбирали эмпирически для получения наиболее высокого выхода специфического ампликона при минимальном содержании неспецифических фрагментов.
Амплификацию осуществляли в 25 мкл реакционной смеси с заданной программой температурновременных циклов: Тден 94 °С - 2 мин; (Тден 95 °С -
0,2 мин, Т 64 °С, Т 72 °С - 0,5 мин) - 29 циклов; Т
9 9 отж 9 элон J / “I J элон
72 °С - 3 мин.
Визуализировали продукты амплификации в 2 %-ном агарозном геле, продукты рестрикции - в 1 %-ном агарозном и 10 %-ном полиакриламидном геле.
ЧАО Агроном Динского р-на Краснодарского края 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 13 12 13 14 15 16 1? К- К*
Рисунок. Электрофореграмма продуктов амплификации гена gag BLV. Дорожки 1.17 - опытные образцы ДНК, К- - отрицательный контроль, К+ - положительный контроль.
Таблица 1. Распределение условных генотипов BLV в хозяйствах Красно дарского края
Хозяйство, порода Частота встречаемости генотипа BLV(по гену gag), %
I 1 II 1 III1IV VIVII VII \ VIII \ IXIXIXI
ЗАО «Агроном», красная степная СПК «Колос», черно-пестрый голштинизи- рованный ПЗ «им. В.И. Чапаева» Айрширский скот Итого 17 8 75 44 12 6 6 13 19 40 66---7 20 777 36 10 27 2 5 7 2 7 2 2 2
Результаты и обсуждение. При постановке ПЦР с использованием праймеров к гену gag в 83 образцах был обнаружен провирус лейкоза крупного рогатого скота. Область gag гена, фланкируемая специфическими праймерами, составила 347 п.н. (см. рисунок)
Сравнивая полученные результаты электрофо-реграмм с ожидаемыми продуктами рестрикции и комбинируя их, мы провели условное разделение генотипов BLV по gag гену и выделили не менее 11 групп паттернов, которые распределялись следующим образом.Три генотипа (I, II, III) с преобладанием III циркулируют среди
крупного рогатого скота красной степной породы (табл. 1). У голштинизированных животных выявлено 6 генотипов BLV - I.VI, у скота айрширской породы - I...III, VII...XI (в обоих случаях с преобладанием I генотипа).
Неоднородное распределение генотипов BLV на территории Краснодарского края согласно данным,
приводимым в специальной литературе, связано с возможным результатом сочетанной эволюции вируса и хозяина, которая привела к появлению новых генетических вариантов вируса.
Наличие трех общих для инфицированных BLV коров всех изучаемых хозяйств генотипов провируса позволяет предположить, что остальные генотипы BLV проникли в СПК «Колос» и ПЗ «им. В.И. Чапаева» с импортным скотом.
На территории Новосибирской области обнаружено всего 2 генотипа как по env, так и по gag гену (табл. 2). Причем в регионе циркулируют I и VI генотипы гена env, а в Краснодарском крае - II и VI. Таблица 2. Распределение генотипов BLV черно-пестрого голштинизиро-ванного скота.
Хозяйство, порода Частота встречаемости генотипа BLV, %
по гену gag по генуenv
I 1II1 III \IV V 1 VI I 1 II 1 VI
ОПХ «Кремлевское» Новосибирская область 87 - - - - 13 40 - 60 СПК «Колос» Краснодарский край 44 12 6 6 13 19 - 27 73
Выводы. Таким образом, вирус лейкоза крупного рогатого скота генетически неоднороден и представлен, как минимум, одиннадцатью генотипами, которые в разной степени распределены в хозяйствах Краснодарского края и Новосибирской области, что связано с породной принадлежностью животных и местом районирования.
Литература.
1. Dube S., Bachman S., Spicer T., Love J., Choi D., Esteban E., Ferrer J.F., Poiesz B.J. Degenerate and specific PCR assays for the detection of bovine leukaemia virus and primate T cell leukaemia/lymphoma virus pol DNA and RNA: phylogenetic comparisons of amplified sequences from cattle and primates from around the world. //Gen Virol. - 1997. - 78 (Pt 6). - 13891398.
2. Sagata N., Yasunaga T., Ohishi K., Tsuzuku-Kawamura J., Onuma M., Ikawa Y. Comparison of the entire genomes of bovine leukemia virus and human T-cell leukemia virus and characterization of their unidentified open reading frames. //EMBO J. - 1984.
- 3. - 3231-3237.
3. Yang D., Snanks R.D., Stewart J.A., Lewin H.A. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus-infected Holsten cattle with persistant lymphocytosis.// PNAS USA. - 1993. - 90. - 6538-6541.
4. Mamoun R.Z., Morisson M., Rebeyrotte N., Busetta B., Couez D., Kettmann R., Hospital M., Guillemain B. Sequence variability of bovine leukemia virus env gene and its relevance to the structure and antigenicity of the glycoproteins. //J Virol. - 1990. - 64. -4180-4188.
5. Sagata N., Yasunaga T., Ogawa Y., Tsuzuku-Kawamura J., Ikawa Y. Bovine leukemia virus: unique structural features of its long terminal repeats and its evolutionary relationship to human T-cell leukemia virus. //Proc Natl Acad Sci U S A. - 1984. - 81. - 47414745.
6. Camargos M.F., Pereda A., Stancek D., Rocha M.A., Reis J.K., Greiser-Wilke I., Leite R.C. Molecular characterization of the env gene from Brazilian field isolates of Bovine Leukemia Virus.Virus Genes 2006.
7. Ferens W.A., Cobbold R., Hovde C.J. Intestinal Shiga toxin-producing Escherichia coli bacteria mitigate bovine leukemia virus infection in experimentally infected sheep. //Infect Immun. - 2006. - 74. - 2906-2916.
8. Ferrer J.F., Stock N.D., Lin P. Detection of replicating C-type viruses in continuous cell cultures established from cows with leukemia: effect of the culture medium. //J Natl Cancer Inst. - 1971. - 47. - 613-621.
9. Licursi M., Inoshima Y., Wu D., Yokoyama T., Gonzalez E.T., Sentsui H. Provirus variants of bovine leukemia virus in naturally infected cattle from Argentina and Japan. //Vet Microbiol. - 2003. - 96. - 17-23
10. Rice N.R., Stephens R.M., Couez D., Deschamps J., Kettmann R., BurnyA., Gilden R.V. The nucleotide sequence of the env gene and post-env region of bovine leukemia virus. //Virology. - 1984. - 138. - 82-93.
11. Смирнов П.Н. Болезнь века — лейкоз крупного рогатого скота. - Новосибирск, 2007.
12. Петропавловский М.В., Донник И.М., Татарчук А.Т. Методология снижения инфицированности животных вирусом лейкоза в оздоравливаемых стадах крупного рогатого скота. - Екатеринбург, 2009.
13. Дробот Е.В. Результаты изучения генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенности эпизоотологического и гематологического проявления: Автореф. канд дис. - Новосибирск, 2007.
14. Monti G., Schrijver R., Beier D. Genetic diversity and spread of Bovine leukaemia virus isolates in Argentine dairy cattle. //Arch Virol. - 2005. - 150. - 443-458.
15. Licursi M., Inoshima Y., Yokoyama T., Gonzales E., Sentsui H. Genetic heterogeneity bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts. //Virus Res. - 2002. - 86. - 101-110.
16. Чичинина С.В. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу: Автореф. канд. дис. - Новосибирск, 2005.
17. Mahieux R., Gessain A. New human retroviruses: HTLV-3 and HTLV-4.//Med Trop (Mars). - 2005. - 65. - 525-528.
18. Mohammadabadi M. R. Detection of bovine leukemia virus proviral DNA in Yaroslavsl, Mongolian and Black pied cattle by PCA. //CELL. MOL. BIOL. LETT. - Vol. 9. - No. 4A. - 2004.
GENETIC TYPING OF BOVINE LEUKEMIA VIRUS (BLV): SCIENTIFIC AND PRACTICAL ASPECTS P.N. Smirnov, N.V. Bateneva, I.V. Mikhnovich
Summary. In article problems genotyping a virus BLV are shown. Reflected perspective directions of development of scientific researches are. Results genotyping BLV on gag and env to genes at animals of a different pedigree and territorial accessory are resulted.
Key words: bovine leukemia virus (BLV), gag gene, env gene, genotyping, restriction fragment length polymorphism (RFLP).
УДК 636.082.453.5/636.934.2
РЕПРОДУКТИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЗВЕРОВОДСТВЕ
A.Р. ЖВАКИНА, научный сотрудник НИИПЗК Россельхозакадемии
B.А. БАГИРОВ, доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН
ВНИИ животноводства Россельхозакадемии В.Б. КУДРЯВЦЕВ, кандидат сельскохозяйственных наук, исполнительный директор
ООО «Звероплемзавод «Савватьево»
E-mail: [email protected]
Резюме. На сегодняшний день существует несколько цветовых типов лисиц и песцов (в том числе, завезённых из других стран), не включённых в Государственный реестр, но представляющих интерес с точки зрения оригинальности окраски. Среди лисиц это сапфир, санглоу, беломордая, смоук, «огонь и лёд»; среди песцов - полярный и др. Решение проблемы сохранения и рационального использования генетических ресурсов лисиц и песцов возможно путём применения искусственного осеменения, создания криобанка семени производителей различных типов и окрасов с последующим использованием ценного биоматериала.
Цель наших исследований - усовершенствование биотехнологических методов сохранения и рационального использования генетических ресурсов в звероводстве.
С 2006 по 2008 гг. в ОАО «Племзавод «Пушкинский» искусственно осеменено внутриматочным способом 2044 самки лисиц, при этом беременными оказались 81,5 %.
При использовании охлаждённого семени самцов лисиц 77,8 % самок ощенилось благополучно, плодовитость составила 4,4 щенка.
Создан криобанк семени лисиц и песцов уникальных цветовых типов российской и финской селекций, в котором сохраняется генетический материал 15 цветовых типов лисиц и 5 цветовых типов песцов. Разработаны новые криопротективные среды, подвижность сперматозоидов в которых после оттаивания составляет около 50...60 %. Получено потомство с использованием заморожено-оттаянной спермы.
Ключевые слова: криобанк семени, искусственное осеменение, расширение ассортимента производимой пушнины, транспортировка охлаждённого семени.
В последние годы на мировом рынке пушнины спрос на шкурки лисиц и песцов российской селекции снизился. Отечественные производители столкнулись с жёсткой конкуренцией со стороны скандинавских фермеров. Решить эту проблему можно путем увеличения размера, улучшения качества опушения, расширения цветового ассортимента пушнины. С помощью искусственного осеменения все это можно реализовать за 1...2 года.
Так, фермеры Финляндии за последние 15 лет резко улучшили такие показатели голубого песца, как длина и масса тела, однородность цвета, густота, плотность и уравненность волоса. По скандинавской сортировке 70 % шкурок по качеству соответствуют классам Saga
и Saga royal, а по размеру 60 % пушнины относится к категориям «40» (0000) и «50» (00000). Средняя длинна песцовых шкурок в Финляндии превышает 110 см, средняя площадь - 33 дм2. Такого эффекта удалось добиться, в частности, благодаря практически полному переходу на искусственное осеменение маточного поголовья и оценку всех производителей по качеству потомства. Однако расплатой за быстрые селекционные успехи в увеличении размеров песца при принятой системе кормления стали относительно невысокие показатели воспроизводства: выход молодняка на самку не превышает 6.6,5 щенка. Главная причина такой ситуации заключается в том, что 20.25 % самок не дают приплода [1].
В то же время сравнение результатов искусственного осеменения и естественного покрытия [2] показало, что число пустых самок песцов составляет соответственно 29,2 и 19,9 %, среднее количество щенков на одну самку - 5,8 и 5,3 шт.; по серебристо-чёрным лисицам величины этих показателей составили соответственно 32 и 15 %, 2,95 и 3,7 шт.
В естественных условиях лисицы и песцы не спариваются. Хотя иногда самец лисицы может покрыть самку песца. Использование искусственного осеменения позволяет вводить семя самцов лисицы в половые пути самок песца (и наоборот) и получать при этом жизнеспособное потомство [3, 4].
Кроме того, при искусственном осеменении можно увеличивать нагрузку на одного самца, что позволяет сократить их численность на ферме на 60 % и более, с одновременным повышением количества самок на 15 % и более [5].
Таким образом, создание криобанков семени, использование качественных и количественных показателей спермы, как селекционных критериев при отборе на улучшение продуктивных свойств животных будут способствовать повышению эффективности производства пушнины, а также сохранение генетических ресурсов животных [6].
Цель наших исследований - усовершенствование биотехнологических методов сохранения и рационального использования генетических ресурсов в звероводстве.
Условия, материалы и методы. Работу проводили в 2005-2009 гг. на лисо-песцовой ферме ОАО «Племзавод «Пушкинский». Кормление, содержание и уход за подопытным поголовьем были общепринятыми для хозяйства.
Период охоты у самок определяли по состоянию внешних половых органов (петель), поведению самки
