CC BY
117
МАТЕРИАЛЫ СИМПОЗИУМА «НЕКОРОНАРОГЕННЫЕ КАРДИОМИОПАТИИ». Санкт-Петербург, 25-27 сентября 2013 г. ■
I. РЕДКИЕ И СЕМЕЙНЫЕ ФОРМЫ КАРДИОМИОПАТИЙ
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ПРИЧИН ГИПЕРТРОФИИ МИОКАРДА
Е.В. Заклязьминская
ФГБУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского» РАМН, Москва
ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ
Заклязьминская Елена Валерьевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией медицинской генетики ФГБУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского» РАМН E-mail: [email protected]
Гипертрофическая кардиомиопатия - клинический феномен, часто наблюдаемый в популяции. Его распространенность составляет около 0,2% (1:500 человек). Около половины случаев гипертрофии миокарда имеют наследственную природу и представляют особый вид кардиомиопатии. Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) характеризуется первичным (не связанным с другими заболеваниями)утолщением стенок левого желудочка (ЛЖ) и/или межжелудочковой перегородки (МЖП) с возможным вовлечением в процесс правого желудочка. Это заболевание является генетически гетерогенным. Известны более 20 генов, кодирующих саркомерные и структурные белки миокарда, мутации в которых могут привести к заболеванию. Однако существует большое число так называемых фенокопий (т.е. форм гипертрофии миокарда, имеющих другую патогенетическую природу), которые требуют тонкой дифференциальной диагностики. В настоящей статье обсуждаются современные представления о генетическом разнообразии ГКМП, а также об основных классах наследственных заболеваний, при которых может наблюдаться гипертрофия миокарда, возможностях ДНК-диагностики и использовании результатов в клинической практике.
Клин. и эксперимент. хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. - 2014. - № 1. - С. 23-28.
Ключевые слова:
генетика, гипертрофическая кардиомиопатия, гены саркомерных белков, МУИ7, МуВРСЗ, миодистрофия, миотония, наследственные болезни накопления, синдром Нунан
Genetic diversity of myocardial hypertrophy
E.V. Zaklyazminskaya
Petrovsky National Research Centre of Surgery, Moscow
Myocardial hypertrophy is a clinical phenomenon often observed in the population. Its prevalence is approx. 0,2% (1:500). About one half of cases of myocardial hypertrophy are familial and represent a specific type of cardiomyopathy. Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is characterized by the primary (not associated with other diseases) thickening of the left ventricular (LV) wall and/or the interventricular septum (IVS), with the possible involvement of the right ventricle. This disease is genetically heterogeneous. We know more than
20 genes encoding cardiac and sarcomeric structural proteins when mutated can lead to the disease. However, there are a large number of so-called phenocopies (ie forms of myocardial hypertrophy caused by other pathogenic mechanisms) which require a more refined differential diagnosis. This article discusses the modern concepts of genetic variability of HCM, the main types of the genetic disorders associated with myocardial hypertrofy, DNA diagnostics facilities and the use of its results in clinical practice.
CORRESPONDENCE
Zaklyazminskaya Elena V. -MD, Professor, Head of the Laboratory of Medical Genetics, Petrovsky National Research Centre of Surgery
E-mail: [email protected]
Key words:
genetics, hypertrophic cardiomyopathy, genes encoding sarcomeric proteins, MYH7, MyBPC3, myodystrophy, myotonia, inborn metabolic diseases, Noonan syndrome
Clin. Experiment. Surg. Petrovsky J. - 2014. - N 1. - Р. 23-28.
Первичная гипертрофическая кардиомиопатия
Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) характеризуется первичным (не связанным с другими заболеваниями) утолщением стенок левого желудочка (ЛЖ) и/или межжелудочковой перегородки (МЖП) с возможным вовлечением в процесс правого желудочка. Частота гипертрофической кардио-миопатии составляет около 0,2% в популяции [1]. Доля истинных наследственных форм неизвестна, но предполагается, что не менее половины случаев заболевания генетически детерминированы [2]. Это делает ГКМП одной из самых частых болезней человека.
Возраст начала заболевания, выраженность и морфологический вариант гипертрофии стенок ЛЖ, наличие обструкции выходного тракта ЛЖ, выраженность нарушений сердечного ритма при ГКМП сильно варьируют. В результате фиброза и снижения объема полости ЛЖ развивается диа-столическая дисфункция. Как правило, систолическая функция при гипертрофии миокарда длительное время сохранена, однако у 5-10% пациентов заболевание прогрессирует до конечной стадии ГКМП, с усиливающимся снижением систолической функции и развитием сердечной недостаточности.
Как правило, первые признаки гипертрофии миокарда появляются в подростковом или раннем молодом возрасте. Манифестация заболевания может включать одышку, сердцебиение, нарушение толерантности к физической нагрузке, синко-пальные состояния и/или внезапную сердечную смерть (ВСС). Детальные патофизиологические причины ВСС при ГКМП все еще требуют уточнения, однако наиболее вероятны остро развивающиеся нарушения сердечного ритма и гемоди-намические нарушения [3, 4]. У части пациентов ГКМП в стадии декомпенсации приводит к дила-тации камер сердца и конечной стадии сердечной недостаточности [5].
В большинстве случаев ГКМП носит семейный характер и наследуется преимущественно по ауто-сомно-доминантному типу [6]. Как правило, причиной заболевания у всех членов семьи является одна и та же мутация, а вероятность ее передачи потомкам составляет 50%, без преимущественного поражения одного пола. По крайней мере часть спорадических случаев ГКМП, когда в семье нет больных родственников, развиваются в результате мутаций de novo. В этих случаях мутация, однажды возникнув, передается потомкам по законам менделевского наследования, с вероятностью 50%, и заболевание приобретает семейный характер.
Таким образом, семейные и спорадические случаи ГКМП зачастую характеризуются общими генетическими закономерностями, поэтому пациенты
со спорадическими формами заболеваниями также нуждаются в медико-генетическом консультировании и проведении ДНК-диагностики.
Гистологическая картина при ГКМП однотипна и характеризуется увеличением размера и специфической дезорганизацией кардиомиоцитов, разрастанием межклеточных соединительнотканных структур, фиброза различной степени выраженности [7].
ГКМП является генетически гетерогенным заболеванием. Известны более 20 генов, кодирующих 3 функциональные класса белков, мутации в которых могут привести к заболеванию: белки миофи-ламентов, Z-дисков, и вовлеченные в сигнальный путь регуляции Са2+-опосредованного высвобождения кальция (табл. 1) [8, 9]. Интересно отметить, что гипертрофическая, рестриктивная и дилатаци-онная кардиомиопатии являются аллельными заболеваниями. В большинстве указанных генов выявлены мутации, ведущие к различным вариантам ремоделирования сердца [10].
При полном скрининге всех известных генов, ответственных за ГКМП, удается выявить мутации в 60% семейных случаев. Такой же объем исследований у больных спорадическими формами ГКМП позволяет установить молекулярную причину заболевания не более чем у 30% больных [11].
Саркомерные белки миокарда представляют сложный комплекс толстых и тонких миофила-ментов, циклическое движение друг относительно друга обеспечивает чередование мышечного сокращения и расслабления. Этот процесс очень чувствителен к изменению концентрации кальция и обеспечивается за счет энергии, освобождающейся при гидролизе АТФ [12].
Большинство генетических изменений в генах саркомерных белков, приводящих к ГКМП, способствует синтезу стабильного белка с точечными заменами одной аминокислоты на другую (миссенс-мутации) [12]. Предположительно, большинство этих мутаций реализуются по доминант-негатив-ному механизму: измененный белок синтезируется в достаточном количестве, встраивается в саркомер и нарушает его функцию. Гипертрофия миокарда и ремоделирование желудочков могут рассматриваться как компенсаторный ответ на биофизическую и механическую несостоятельность саркомер-ного комплекса [2].
Выделяют несколько структурно-анатомических вариантов гипертрофии миокарда. Наиболее частой является асимметричная гипертрофия МЖП, встречающаяся у 75-80% взрослых больных [13, 14]. Как показало исследование, проведенное в 2006 г. Mayo Clinic, и включившее 400 неродственных больных с ГКМП, именно при этом варианте гипертрофии миокарда вероятность выявления мутаций в генах саркомерных белков была
Таблица 1. Известные генетические формы гипертрофической кардиомиопатии и их представленность в группе больных с идентифицированными мутациями (при полном скрининге генов)
Форма Ген Локус Белок Структура Частота, %
НСМ1 МУН7 14д12 Тяжелая цепь р-миозина Миофиламенты >30
НСМ2 ТЫЫТ2 1д32 Тропонин Т2 Миофиламенты 15
НСМ3 ТРМ1 15д22 Тропомиозин-а скелетных мышц Миофиламенты <5
НСМ4 МУВРСЗ 11р11.2 Миозин-связанный С-белок Миофиламенты >15
НСМ5 МУШ 20д13 Киназа легкой цепи миозина Миофиламенты <1
НСМ6 Ркклвг 7д36 АМР-киназа у-2 Са2+ обмен <1
НСМ7 ТЫЫ13 19д13 Сердечный тропонин I Миофиламенты 10
НСМ8 MУL3 3р21.3 Легкая цепь-1 миозина, В Миофиламенты <1
НСМ9 тты 2д31 Титин Миофиламенты <1
НСМ10 MУL2 12д23 Регуляторная цепь миозина Миофиламенты <1
НСМ11 АСТС1 15д14 а-Актин Миофиламенты <5
НСМ12 СБкРЗ 11р15 Сердечный ИМ-содержащий белок 1-диски <1
НСМ13 ТЫЫС1 3р21 Сердечный тропонин С Миофиламенты <1
НСМ14 МУН6 14д11 Тяжелая цепь миозина 6 Миофиламенты <1
НСМ15 уа 10д22 Винкулин 1-диски <1
НСМ16 LDB3 10д22 1_1М-связывающий домен 3 1-диски 1-5
НСМ17 МУ012 4д26 Миозенин 2 1-диски <1
НСМ18 ЗРН2 20д12 Юктофилин Са2+ обмен <1
НСМ19 PLN 6д22 Фосфоламбан Са2+ обмен <1
НСМ20 CALR3 19д13 Кальретикулин 2 Са2+ обмен <1
НСМ21 ЫЕХЫ 1р31 Нексилин-подобный белок 1-диски <1
НСМ22 ТСАР 17я12 Телетонин 1-диски <1
НСМ23 МУРЫ 10д21 Миопалладин 1-диски <1
НСМ24 АСТЫ2 1д42 а-Актинин 2 1-диски <1
Представлены наиболее частые структурные варианты гипертрофии миокарда. Вверху указана частота варианта ремоделирования в группе больных с гипертрофической кардиомиопатией. Внизу указана диагностическая эффективность ДНК-диагностики среди больных с различными вариантами гипертрофии (частота выявляемости мутаций в генах белков миофиламентов) [13, с изменениями]
наиболее высокой (рисунок) [10, 15]. Однако пока не ясно, каковы тонкие молекулярные механизмы, связывающие изменения в белках миофиламентов и анатомические особенности ремоделирования сердца.
Наиболее частые генетические формы ГКМП связаны с мутациями в генах миофиламентов. Мутации в 2 генах, МУН7 и МУВРСЗ, ответственны за 15-25% всех случаев заболевания. В настоящее время известны более 1000 мутаций, ассоциированных с ГКМП [2]. Несмотря на большое число вы-
явленных мутаций и клинических описаний носителей, как изолированных, так и семейных, данных о прогностическом значении каждой конкретной мутации все еще недостаточно. Большинство мутаций редки, встречаются в малом числе семей, поэтому больных с конкретным генетическим вариантом недостаточно для достоверного анализа. Сроки манифестации и выраженность гипертрофии миокарда значительно варьируют даже в пределах одной семьи, что затрудняет клиническую интерпретацию генетических находок. Тем не менее
известны некоторые мутации, ассоциированные с достоверно высоким риском ВСС и низкой выживаемостью, а также относительно мягкие, прогностически благоприятные варианты. Например, было показано, что предполагаемая продолжительность жизни пациентов - носителей мутаций р.Дгд403С1п, р.Дгд453Су$, р.Дгд719йп и р.Дгд719Тгр в гене МУН7 -составляет 40-45 лет, тогда как выживаемость носителей мутации р.Уа1.606Ме1 в том же гене практически не изменена [2]. Мутации р.С1и451С1п в гене МуВРСЗ и р.Дгд92^п в гене TNNT2 также имеют неблагоприятный прогноз и высокий риск внезапной смерти [2, 10]. Были предприняты попытки проводить генетический скрининг, направленный на выявление у больных только известных мутаций с неблагоприятным прогнозом, однако такой подход оказался неэффективным. Выбранные для анализа мутации были выявлены менее чем у 1% пациентов с ГКМП, а частота неблагоприятных исходов среди оставшихся 99% существенно не снизилась [16].
Однако, если речь идет о значительном снижении возраста проявления заболевания по сравнению с другими родственниками, а также быстром прогрессировании, нельзя исключать наличия 2 мутаций в генах, ответственных за ГКМП. По результатам молекулярно-генетических исследований доля больных с двумя мутациями в заинтересованных генах составляет около 5% [2]. Как правило, клиническая картина заболевания у пациентов, носителей 2 мутаций и более, отличается более ранней манифестацией по сравнению с другими членами семьи, быстрым прогресси-рованием и высоким риском жизнеугрожающих аритмий [17, 18].
На долю мутаций в генах белков 7-дисков и белков, регулирующих кальциевый метаболизм, приходится не более 1% мутаций [21], поэтому эти гены редко включают в программы диагностического скрининга.
В 2011 г. было опубликовано первое международное руководство по генетическому тестированию при каналопатиях и кардиомиопатиях, уточняющее рекомендации по ДНК-диагностике ГКМП [9].
Показания I класса. Расширенный или избирательный (МУВРСЗ, МУН7, ТМИВ, ТММТ2, ТРМ1) поиск мутаций в генах рекомендован всем пациентам, которым кардиолог поставил диагноз ГКМП, основываясь на данных персонального и семейного анамнеза, а также на электро- и эхокардиографических признаках.
Генетическое тестирование, направленное на выявление конкретной мутации, рекомендовано членам семьи и другим родственникам после идентификации генетической причины ГКМП у пробан-да [10]. При семейном консультировании важен тот
факт, что ВСС у родственников является значимым фактором риска для носителей мутации даже при минимальных признаках гипертрофии [19].
Значительное количество исследований было посвящено поиску клинических или анатомических маркеров, специфичных для разных генетических форм заболевания. При отсутствии частых мутаций, генетического разнообразия и большого размера генов такие маркеры могли бы оптимизировать поиск мутаций, сократить финансовые и временные затраты на ДНК-диагностику. К сожалению, достоверных различий между клиническими проявлениями мутаций в разных генах не выявлено [20], поэтому при классическом поэтапном подходе к ДНК-диагностике («ген за геном») руководствуются только данными о популяционной частоте мутаций в разных генах (табл. 1).
В отсутствие генетического подтверждения ГКМП остается диагнозом исключения - при отсутствии известных причин утолщения стенок сердца (длительной стойкой артериальной ги-пертензии, врожденного аортального стеноза, синдрома спортивного сердца и т.д.). В последние годы все большее распространение получают новые технологии секвенирования (NGS, New Generation Sequencing), которые позволяют одновременно анализировать большое количество генов. Новые технологии генетического анализа позволяют решить часть затруднений, возникающих при использовании классического капиллярного секвенирования (недиагно-стированные делеции и инсерции части генов и отдельных экзонов, высокая себестоимость исследования и длительность его исполнения), а также предоставить большой объем информации, относящейся к генетической структуре ГКМП, клиническому полиморфизму заболевания, потенциальным мишеням для геноспецифической терапии. Первые результаты использования NGS в диагностике ГКМП привели к появлению большого количества новых данных: неописанных генетических вариантов, генов-кандидатов, расширению представлений о клинической вариабельности заболевания [21-23].
Генетическое разнообразие фенокопий гипертрофической кардиомиопатии
В ряде случаев первичная ГКМП требует тонкой дифференциальной диагностики с другими группами наследственных заболеваний, которые могут сопровождаться или проявляться преимущественно поражением сердца. В результате анализа методами NGS расширенных панелей более сотни генов было показано, что не менее 5% больных с направляющим диагнозом ГКМП явля-
Таблица 2. Наиболее частые фенокопии, требующие дифференциальной диагностики с гипертрофической кардиомиопатией
Группа заболеваний Заболевания Экстракардиальные симптомы
Лизосомные болезни накопления Болезнь Фабри, мукополисахари-дозы,болезни Фарбера и Данона «Грубое» лицо, акромегалия, ангиокератомы, гепатомегалия, спленомегалия, умственная отсталость различной степени выраженности
Гликогенозы Болезнь Помпе Выраженная гипотония, большой язык у детей, сосудистые изменения
Митохондриальные болезни Синдромы Кернса-Сейра, MELAS, нарушения р-окисления жирных кислот, митохондриальные миопатии Энцефалопатия, миопатия, мигрень, печеночная недостаточность, почечная недостаточность, ацидоз
Амилоидоз Транстирретиновый амилоидоз Почечная недостаточность, полинейропатия, туннельный синдром, желудочно-кишечные расстройства
Прогрессирующие нервные и нервно-мышечные заболевания Миодистрофии, миопатии, миотонии, атаксия Фридрейха и т.д. Слабость, нарушения походки, скелетные деформации, атаксия, повышение креатинфосфокиназы
Наследственные синдромы различной этиологии Синдром Нунан, синдром LEOPARD, синдром Беквитта-Видемана Висцеромегалия, нарушения роста, скелетные деформации, эндокринная недостаточность, повышенный риск пролиферативных заболеваний
ются носителями мутаций в генах, отвечающих за другие группы заболеваний (так называемые фенокопии) [21].
Существует большое число наследственных болезней, при которых гипертрофия миокарда часто встречается как часть более широкого симпто-мокомплекса. В первую очередь к ним относятся многие прогрессирующие нервно-мышечные заболевания, наследственные болезни накопления и различные наследственные синдромы с вовлечением сердца (табл. 2). Дифференциальная диагностика этих заболеваний с ГКМП часто сложна и требует привлечения специфических инструментальных, биохимических и молекулярных
Литература
1. Maron B.J., Gardin J.M., Flack J.M. et al. Prevalence of hypertrophic cardiomyopathy in a general population of young adults. Echocardiographic analysis of 4111 subjects in the CARDIA Study. Coronary Artery Risk Development in (Young) Adults // Circulation. - 1995. - Vol. 92, N 4. - P. 785-789.
2. McGrow Hill Online Education. OMMBID, The Online Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease http:// ommbid.mhmedica1.com/
3. Solomon S.D., Wolff S, Watkins H. et al. Left ventricular hypertrophy and morphology in familial hypertrophic cardiomyopathy associated with mutations of the beta-myosin heavy chain gene // J. Am. Coll. Cardiol. -1993. - Vol. 22. - P. 498.
4. McKenna W., Deanfield J., Faruqui A. et al. Prognosis of hypertrophic cardiomyopathy Role of age and clinical, electrocardiographic and hemodynamic features // Am. J. Cardiol. - 1981. - Vol. 47. - P. 532.
5. Goto D., Kinugawa S., Hamaguchi S. et al.; JCARE-CARD Investigators. Clinical characteristics and outcomes
методов обследования. Установление этиологического диагноза в этом случае имеет не только академический интерес, но и непосредственно влияет на течение, прогноз заболевания и тактику лечения.
Обследование и лечение больных с гипертрофией миокарда требует согласованной работы мульти-дисциплинарной команды врачей: кардиологов, хирургов, неврологов, генетиков, биохимиков, врачей инструментальной диагностики. Не исключено, что по мере лучшего ознакомления с редкими наследственными формами фенокопий ГКМП будет расти их выявляемость, и появятся реалистичные оценки их частоты встречаемости в популяции.
of dilated phase of hypertrophic cardiomyopathy: report from the registry data in Japan // J. Cardiol. - 2013. -Vol. 61, N 1. - P. 65-70.
6. Jensen M.K., Havndrup O., Christiansen M. et al. Penetrance of hypertrophic cardiomyopathy in children and adolescents: a 12-year follow-up study of clinical screening and predictive genetic testing // Circulation. - 2013. -Vol. 127, N 1. - P. 48-54.
7. Olsen E.G. Anatomic and light microscopic characterization of hypertrophic obstructive and nonobstructive cardiomyopathy // Eur. Heart J. - 1983. -Vol. 4. - P. 1.
8. OMIM (On-line Mendelian Inheritance in Man) www. ncbi.nlm.nih.gov/omim
9. HRS/EHRA Expert Consensus Statement on the State of Genetic Testing for the Channelopathies and Cardiomyopathies // Europace. - 2011. - Vol. 13. -P. 1077-1109.
10. Bos J.M., Towbin J.A., Ackerman M.J. Diagnostic, Prognostic, and Therapeutic Implications of Genetic Testing
for Hypertrophic Cardiomyopathy // J. Am. Coll. Cardiol. -2009. - Vol. 54. - P. 201-211.
11. Ho C.Y. Genetic Considerations in Hypertrophic Cardiomyopathy // Prog. Cardiovasc. Dis. - 2012. - Vol. 54, N 6. - P. 456-460.
12. Vikstrom K.L., Leinwand L.A. Contractile protein mutations and heart disease // Curr. Opin. Cell Biol. -1996. - Vol. 8. - P. 97.
13. Maron B.J., Gottdiener J.S., Epstein S.E. Patterns and significance of distribution of left ventricular hypertrophy in hypertrophic cardiomyopathy 125 patients // Am. J. Cardiol. - 1981. - Vol. 48. - P. 418.
14. Semsarian C., French J., Trent R.J. et al. The natural history of left ventricular wall thickening in hypertrophic cardiomyopathy // Aust. N. Z. J. Med. - 1997. - Vol. 27. - P. 51.
15. Binder J., Ommen S.R., Gersh B.J. et al. Echocardiography-guided genetic testing in hypertrophic cardiomyopathy: septal morphological features predict the presence of myofilament mutations // Mayo Clin. Proc. -2006. - Vol. 81. - P. 459-467.
16. Ackerman M.J., Ommen S.R., Van Driest S.L. et al. Malignant Mutations in Hypertrophic Cardiomyopathy: A Rare Find Indeed // Pediatr. Res. - 2001. - Vol. 49, N 4. Pt 2. - P. 35a, II.
17. Girolami F., Ho C.Y., Semsarian Ch. et al. Clinical Features and Outcome of Hypertrophic Cardiomyopathy Associated With Triple Sarcomere Protein Gene Mutations // J. Am. Coll. Cardiol. - 2010. - Vol. 55. - P. 1444-1453.
18. Maron B.J., Maron M.S., Semsarian Ch. Double or compound sarcomere mutations in hypertrophic
cardiomyopathy: A potential link to sudden death in the absence of conventional risk factors // Heart Rhythm. -2012. - Vol. 9. - P. 57-63.
19. O'Mahony C., Tome-Esteban M., Lambiase P.D. et al. A validation study of the 2003 American College of Cardiology/European Society of Cardiology and 2011 American College of Cardiology Foundation/American Heart Association risk stratification and treatment algorithms for sudden cardiac death in patients with hypertrophic cardiomyopathy // Heart. - 2013. - Vol. 99, N 8. -P. 534-541.
20. Lopes L.R., Rahman M.S., Elliott P.M. A systematic review and meta-analysis of genotype-phenotype associations in patients with hypertrophic cardiomyopathy caused by sarcomeric protein mutations // Heart. - 2013. -Vol. 99, N 24. - P. 1800-1811.
21. Lopes L.R., Zekavati A., Syrris P. et al. Genetic complexity in hypertrophic cardiomyopathy revealed by high-throughput sequencing // J. Med. Genet. - 2013. -Vol. 50. - P. 228-239.
22. Mook O.R., Haagmans M.A., Soucy J.F. et al. Targeted sequence capture and GS-FLX Titanium sequencing of 23 hypertrophic and dilated cardiomyopathy genes: implementation into diagnostics // J. Med. Genet. - 2013.-Vol. 50, N 9. - P. 614-626.
23. Dames S., Durtschi J., Geiersbach K. et al. Comparison of the ¡Ilumina Genome Analyzer and Roche 454 GS FLX for resequencing of hypertrophic cardiomyopathy-associated genes // J. Biomol. Tech. - 2010. - Vol. 21, N 2. -P. 73-80.
